外泌體作為腫瘤診斷生物標(biāo)記物的研究進(jìn)展

姜良弟，顧永衛(wèi)綜述，劉繼勇審校

0 引 言

外泌體是源于內(nèi)體系統(tǒng)的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡(30～150 nm)，由多種細(xì)胞分泌，如紅細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等[1]。外泌體分布在多種體液中，如血漿、血清、尿液、胸膜液、唾液、羊水和乳汁等[2-3]。外泌體攜帶細(xì)胞質(zhì)蛋白、核酸、脂質(zhì)和代謝物等物質(zhì)，可傳遞細(xì)胞間信號(hào)，調(diào)控生物體的病理生理過(guò)程[3]。因此，外泌體作為腫瘤診斷生物標(biāo)志物已成為腫瘤研究與轉(zhuǎn)化的熱點(diǎn)。腫瘤來(lái)源的外泌體(tumor-derived exosomes，TEXs)是腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體亞群，通過(guò)建立或改變腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，抑制宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫逃逸和多藥耐藥性[4]。TEXs攜帶多種內(nèi)源性貨物，部分內(nèi)容物類似于親代細(xì)胞并反映其病理生理狀態(tài)，可提供與腫瘤相關(guān)的多種生物分子，這使其可能成為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。

1 生物發(fā)生

外泌體起源于內(nèi)體系統(tǒng)。起初，細(xì)胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成初級(jí)內(nèi)體，在高爾基體的參與下成為次級(jí)內(nèi)體和多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，MVBs膜向內(nèi)出芽形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)[5]。最終，MVBs被溶酶體降解或在Rab GTP酶的參與下與細(xì)胞膜融合將ILVs釋放到細(xì)胞外[6]，見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)運(yùn)所需內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)調(diào)控外泌體的形成和內(nèi)容物分選[7]。外泌體的形成也可通過(guò)ESCRT非依賴性途徑。例如，神經(jīng)酰胺也可觸發(fā)內(nèi)體囊泡向內(nèi)出芽形成MVBs[8]。

圖1 外泌體的生物發(fā)生

Figure 1 Biogenesis of exosomes

2 結(jié)構(gòu)與組成

外泌體由親脂性外殼和親水性內(nèi)核組成，其物質(zhì)組成根據(jù)親本細(xì)胞的病理生理狀態(tài)以及外部刺激而變化[9]。四跨膜蛋白和整合素是普遍存在于外泌體表面上的融合和靶向蛋白。四跨膜蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和黏附分子的功能[10]；整合素控制外泌體的器官靶向性轉(zhuǎn)移[11]。見(jiàn)圖2。外泌體膜中含有膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酸和磷脂酰甘油等脂類成分[12]。外泌體還含有多種功能性核酸，包括信使RNAs(messenger RNAs，mRNAs)、環(huán)狀RNAs (circular RNAs，circRNAs)、微小RNAs (microRNAs，miRNAs)、非編碼小RNAs(small non-coding RNAs，sncRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNAs，lncRNAs)和雙鏈DNA (double-stranded DNA，dsDNA)[13-18]。

圖 2 外泌體的結(jié)構(gòu)與組成

Figure 2 Structure and composition of exosomes

3 外泌體與腫瘤診斷

3.1 外泌體蛋白作為標(biāo)志物外泌體富含腫瘤相關(guān)蛋白，可作為腫瘤診斷循環(huán)標(biāo)記物[19]。Melo等[20]最早證明，胰腺癌患者血清外泌體中存在大量過(guò)表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC 1)。此外， GPC 1與腫瘤負(fù)荷、患者的術(shù)前和術(shù)后存活率密切相關(guān)，證明了外泌體蛋白用于胰腺癌早期診斷的可行性。Fu 等[21]通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定了胃癌患者和健康個(gè)體的血清外泌體中243種差異表達(dá)的蛋白。更關(guān)鍵的是，與健康個(gè)體相比，胃癌患者血清外泌體及胃癌組織中的含三聯(lián)基元蛋白3(tripartite motif containing protein 3，TRIM3)表達(dá)顯著降低，表明TRIM3可作為胃癌的診斷標(biāo)志物。

近期研究表明，血漿外泌體磷酸化蛋白能提供腫瘤進(jìn)展的實(shí)時(shí)信息，可作為腫瘤早期診斷、篩查與監(jiān)測(cè)的有效手段。Chen等[22]鑒定了微泡和外泌體中的9643種磷酸化蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，與健康個(gè)體相比，乳腺癌患者外泌體中的144種磷酸化蛋白顯著高表達(dá)。然而，磷酸化蛋白作為循環(huán)標(biāo)記物，需要大量高純度的外泌體，受到磷酸化特異性抗體的限制，同時(shí)生物體液的復(fù)雜性及分離技術(shù)的局限性也會(huì)對(duì)外泌體磷酸化蛋白用于腫瘤臨床診斷帶來(lái)挑戰(zhàn)[22]。

外泌體會(huì)選擇性地富集腫瘤特異性蛋白，檢測(cè)這些蛋白可能有助于腫瘤的診斷、預(yù)后和化療評(píng)估。然而，腫瘤外泌體特異性蛋白豐度較低且易受其他蛋白的污染，其臨床診斷應(yīng)用性有待提高[23]。

3.2外泌體核酸作為標(biāo)志物

3.2.1 miRNAs外泌體含有與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的多種 miRNAs，也可用于腫瘤診斷與預(yù)后[24-25]。例如，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者和肝硬化患者的血清miR-221、miR-222和miR-224的表達(dá)譜相似，然而HCC患者血清外泌體中這3種miRNAs的表達(dá)水平顯著高于肝硬化患者，因此外泌體miRNAs可能是比血清miRNAs更靈敏的生物標(biāo)志物[26]。去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer, CRPC)患者血漿中高水平表達(dá)的外泌體miR-1290和miR-375與其較差的總體生存率相關(guān)，可作為CRPC的預(yù)后標(biāo)記物[27]。此外，miRNAs也是比糖類抗原(carbohydrate antigen，CA)更靈敏的標(biāo)志物，例如，外泌體miRNAs比單獨(dú)的CA 19-9或GPC 1在診斷胰腺癌、區(qū)分胰腺導(dǎo)管腺癌和慢性胰腺炎方面靈敏度更高[28]。

外泌體miRNAs具有較高的特異性和靈敏度，是一種用于腫瘤診斷和預(yù)后的新途徑，但也存在一定局限性，例如其表達(dá)水平的強(qiáng)烈變化[29]。因此需要在更多類型和不同階段的腫瘤樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證其作為腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。此外，研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的高通量miRNAs檢測(cè)方法也是目前需要考慮的問(wèn)題。

3.2.2lncRNAs外泌體lncRNAs在腫瘤診斷方面也有一定的應(yīng)用。例如，膀胱癌(bladder cancer，BC)患者血清外泌體lncRNA-UCA1的水平與健康個(gè)體相比明顯升高。同時(shí)，BC細(xì)胞通過(guò)分泌含有致癌性lncRNA-UCA1的外泌體重塑TME，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[30]。尿液外泌體相關(guān)lncRNAs的水平上調(diào)與非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)較差的總生存期相關(guān)，在BC診斷和預(yù)后中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[31]。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者血清外泌體HOX 轉(zhuǎn)錄反義 RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)的表達(dá)水平比健康個(gè)體更高，可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)情況，并作為GBM對(duì)溴結(jié)構(gòu)域和末端外蛋白抑制劑的反應(yīng)型分子標(biāo)志物[32]。此外， HOTAIR的過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者的低生存率和化療耐藥相關(guān)，可作為乳腺癌的診斷標(biāo)記物[33]。

3.2.3circRNAs研究表明，外泌體circRNAs可作為腫瘤診斷與篩查的指標(biāo)[34]。Li等[35]最早證實(shí)人血清外泌體中存在超過(guò)1000個(gè)完整且穩(wěn)定的circRNAs。此外，部分血清外泌體circRNAs可用于結(jié)腸癌的臨床診斷。近期研究表明環(huán)狀RNA IARS(circular RNA IARS，circ-IARS)存在于胰腺癌外泌體中，其過(guò)表達(dá)能引發(fā)一系列促癌行為，包括顯著上調(diào)致癌基因、F-肌動(dòng)蛋白和黏著斑的表達(dá)；下調(diào)纖連蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[36]。

外泌體circRNAs由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達(dá)廣泛、序列保守和含量豐富而易于檢測(cè)。然而， circRNAs的調(diào)節(jié)機(jī)制和分子選擇機(jī)制在很大程度上仍未知[14]。此外，還需要進(jìn)一步闡明外泌體circRNAs的基因調(diào)控機(jī)制、表達(dá)模式以及與腫瘤耐藥性之間的關(guān)系。

3.2.4mRNAs盡管外泌體mRNAs的豐度較低，但其仍攜帶關(guān)于基因表達(dá)和突變的重要信息，可作為腫瘤診斷和治療的輔助手段[37]。例如，HCC患者血清外泌體hnRNPH1的水平比其他對(duì)照組明顯升高并與Child-Pugh分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移和總生存期相關(guān)，可作為HCC診斷的候選標(biāo)記物[38]。此外，研究證明血漿外泌體程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1) mRNAs的表達(dá)與黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的抗PD-1抗體治療反應(yīng)密切相關(guān)，這使外泌體mRNAs成為腫瘤免疫治療的分子標(biāo)志物，可能用于指導(dǎo)腫瘤化療合理用藥[39]。

3.2.5DNA外泌體DNA也逐漸用于臨床診斷，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的縱向監(jiān)測(cè)、評(píng)估和分層[40]。Thakur等[18]證實(shí)了TEXs含有代表整個(gè)基因組并反映親本細(xì)胞突變信息的dsDNA。Wang等[41]在比較嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma，PCC)和副神經(jīng)節(jié)瘤(paraganglioma，PGL)患者的血清外泌體DNA和腫瘤組織DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體中存在部分與配對(duì)致癌基因組高度一致、能反映易感基因突變狀態(tài)并覆蓋大部分染色體基因的dsDNA片段，這表明外泌體dsDNA可作為PCC和PGL診斷和術(shù)前評(píng)估的非侵入性基因標(biāo)記物。

外泌體DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地反映腫瘤進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。此外，它還在腫瘤微小殘留病變和復(fù)發(fā)早期預(yù)警方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，由于腫瘤特異性DNA會(huì)被正常細(xì)胞DNA污染，從而影響其診斷靈敏度。因此，在作為液體活檢手段的外泌體DNA用于臨床診斷前，需要選擇性地富集腫瘤特異性外泌體[42]。

3.3外泌體糖復(fù)合物作為標(biāo)志物

3.3.1 糖蛋白血液中大多數(shù)蛋白質(zhì)是糖蛋白，而腫瘤細(xì)胞的糖蛋白會(huì)發(fā)生異常糖基化，因此糖蛋白可用于腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)。血漿/血清蛋白質(zhì)組含有12個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)蛋白濃度范圍且成分較復(fù)雜，因此血漿/血清糖蛋白不適合作為疾病標(biāo)志物[43]。然而，分析外泌體糖蛋白可在很大程度上消除高豐度血漿或血清成分的干擾，使低含量的糖蛋白能夠在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)被檢測(cè)到[44]。Chen 等[45]開(kāi)發(fā)了基于聚合物的反相糖蛋白陣列技術(shù)，鑒定了乳腺癌患者血漿外泌體中20種高表達(dá)的糖蛋白，也證明了外泌體糖蛋白作為癌癥標(biāo)志物的可行性，同時(shí)也解決了如何高通量地驗(yàn)證特異性糖蛋白的問(wèn)題。

3.3.2糖脂外泌體糖脂也可作為腫瘤生物標(biāo)志物。例如，前列腺癌(prostate cancer，PCa)細(xì)胞外泌體相比于其他對(duì)照細(xì)胞含有更豐富的鞘糖脂，如己糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺[46]。外泌體糖蛋白和糖脂作為生物標(biāo)志物不僅有助于闡明惡性腫瘤的發(fā)展機(jī)制及其生物學(xué)特性，而且增加了現(xiàn)有臨床腫瘤標(biāo)志物的特異性和靈敏性，可能會(huì)成為腫瘤診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療的利器[47]。

3.4外泌體脂質(zhì)作為標(biāo)志物脂質(zhì)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝中不可或缺，其代謝異常也與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[48]。早期研究證明尿磷脂成分能作為 PCa的診斷標(biāo)志物[49]。Skotland 等[50]通過(guò)高通量質(zhì)譜定量脂質(zhì)組學(xué)鑒定了PCa患者和健康個(gè)體中的107種外泌體脂質(zhì)成分。結(jié)果表明，尿液外泌體和PCa細(xì)胞外泌體之間的膽固醇和磷脂酰膽堿含量有顯著差異。更重要的是，磷脂酰絲氨酸和乳糖神經(jīng)酰胺在兩種外泌體之間表現(xiàn)出更明顯的含量差異，表明外泌體脂質(zhì)可作為PCa的非侵入性生物標(biāo)志物。

4 展 望

隨著外泌體的生物發(fā)生及其功能相關(guān)知識(shí)的不斷深入，外泌體作為“液體活檢”手段的研究越來(lái)越多。然而，大部分腫瘤外泌體的研究處于早期階段，對(duì)腫瘤特異性標(biāo)記物富集機(jī)制尚未完全了解，大多數(shù)研究只是在特定時(shí)間分析一種外泌體標(biāo)記物，而忽略了其他因素。此外，外泌體的分離純化方法也尚未標(biāo)準(zhǔn)化，這是限制外泌體診斷研究的主要因素。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種分離純化外泌體的技術(shù)，包括超速離心、聚合物沉淀、尺寸排阻色譜、微流控和免疫親和捕獲等[51]。然而，分離方法的不同會(huì)導(dǎo)致外泌體定性和定量的差異，使不同研究組之間的結(jié)果難以比較或重現(xiàn)。因此，應(yīng)該建立與外泌體分離檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和開(kāi)發(fā)外泌體腫瘤特異性標(biāo)記物的鑒定模式，以提高外泌體腫瘤臨床診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度。隨著分離檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化與新型外泌體標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，外泌體將在腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。