白番紅花CrCBF1基因的克隆及功能分析

張克闖，楊紅蘭，李小雙，張道遠*，王玉成

(1 中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所 干旱區(qū)生物地理與生物資源重點實驗室，烏魯木齊830011；2 中國科學院大學，北京100049)

白番紅花(CrocusalatavicusRegel et Sem.)屬鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬(CrocusL.)藥用植物，產于中國新疆伊犁河谷，中亞也有分布，生于海拔1 200～3 000 m的寒冷山坡及河灘草地[1]。常形成層片或小群落。本種花白色，可作園林早春花卉，新疆民間用球莖作藥用[1-2]。屬多年生早春類短命植物，能在積雪覆蓋下完成開花結實，具有極強的抗寒性[2]。

CBFs/DREB1蛋白(C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factors 1)屬于AP2/EREBP家族轉錄因子[3]。在逆境條件下CBFs/DREB1蛋白能有效地與CRT/DRE(C-repeat /dehydration responsive element)脫水響應元件結合，并激活其下游COR(cold-regulated)基因的轉錄，提高植物抵抗低溫、干旱以及高鹽等非生物脅迫的能力[4]。1997年首次從擬南芥中克隆得到CBF1/DREB1B轉錄因子，并證明其參與擬南芥的抗冷信號通路[5]。CBF1轉錄因子雖然是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，但研究表明，CBF冷反應信號通路的各個組成因子在開花植物中高度保守。近些年來在不同的物種中均證明CBF1基因參與植物的冷調控，如水稻[6]、胡楊[7]、葡萄[8]、桑樹[9]、蘋果[10]、大豆[11]、棉花[12]、玉米[13]、短柄草[14]等植物中均證明CBF1基因參與抗冷調控。但上述研究多見于重要的經濟作物及經濟果木中，有關野生的、抗寒性強的(類)短命植物中CBF1基因卻鮮見詳細研究。本研究首次克隆得到多年生早春短命類植物白番紅花CrCBF1基因序列，在對CrCBF1的基因特性進行研究的同時，通過酵母功能驗證發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1中過表達CrCBF1基因可以提高重組酵母的抗寒性，初步驗證CrCBF1基因參與冷調控信號通路。

1　材料和方法

1.1　實驗材料

實驗材料為野生白番紅花，采自新疆新源縣(82°15′ E，43°29′ N)，材料連同根系土壤一并帶回實驗室，洗凈、去土液氮冷凍，放入-80℃超低溫冰箱保存。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株、酵母Y2H菌株、酵母自激活陽性對照菌株、農桿菌EHA105菌株、酵母表達載體pYES2及pGBKT7、亞細胞定位載體pBI121-GFP均由本實驗室保存；植物組織總RNA提取試劑盒Plant RNA Kit、質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit及瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒Gel Extraction Kit均購自OMEGA公司；反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA Marker 2000、限制性內切酶等均購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、載體連接試劑盒pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit均購自北京全式金公司；引物合成及序列測定由北京華大基因有限公司完成。

1.2　總RNA的提取和cDNA的合成

取0.1 g白番紅花葉片材料(-80 ℃超低溫冰箱保存)，利用Plant RNA Kit試劑盒提取總RNA，提取的RNA用NanoDrop 2000檢測，利用1%凝膠電泳檢測RNA質量。選擇A260/A280值在1.9到2.1之間，質量濃度大于200 ng·μL-1且條帶清晰的RNA用于反轉。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉試劑盒進行總RNA的cDNA反轉錄,合成第一鏈cDNA。

1.3　白番紅花CrCBF1基因的克隆

根據(jù)NCBI已發(fā)表的鳶尾科植物馬藺[IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.]的IlCBF1基因序列(GenBank登錄號DQ131497)設計特異性引物CrCBF1-F/R(表1)。以cDNA為模板，使用TaKaRa Ex Taq RR001聚合酶進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測并回收，產物純化后連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落搖菌，菌液PCR鑒定陽性菌株測序。

1.4　白番紅花CrCBF1基因的生物信息學分析

根據(jù)CrCBF1基因的cDNA序列，利用NCBI的ORF finder工具尋找開放閱讀框，再將ORF序列翻譯成氨基酸序列。利用ExPASy網站的ProtParam工具計算CrCBF1蛋白的理論分子量、等電點等基本參數(shù)。利用NCBI CDD工具分析序列的結構域及功能元件。利用MEGA5.0軟件通過鄰近法構建蛋白系統(tǒng)進化樹。利用Phyre2分析CrCBF1蛋白的二級及三級結構。

1.5　白番紅花CrCBF1蛋白亞細胞定位分析

構建pBI121-CrCBF1-GFP融合植物表達載體，利用SmaI限制性內切酶把環(huán)狀pBI121-GFP載體切成線狀。設計引物CrpBI121-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質粒為模板進行PCR擴增，擴增產物回收，利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，把目的基因片段連入pBI121-GFP線性載體，構建pBI121-CrCBF1-GFP重組載體。轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測為陽性的菌株送北京華大基因公司測序，序列比對正確的菌株搖菌，提取質粒，轉化農桿菌EHA105。利用農桿菌瞬時轉化法，把含有融合表達載體的農桿菌注射到2周大的本氏煙草葉片的組織細胞間隙，共培養(yǎng)3～5 d，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片表皮，同時以不含目的基因的pBI121-GFP空載體為對照。

1.6　白番紅花CrCBF1轉錄因子激活活性分析

構建酵母表達載體pGBKT7-CrCBF1，用BamH I 和EcoR I 限制性內切酶對pGBKT7 載體進行雙酶切，對產物進行純化回收。設計引物CrpGBKT7-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質粒為模板進行PCR擴增，產物純化回收。利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，把目的基因片段連入pGBKT7 線性載體，構建pGBKT7-CrCBF1重組載體。轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測為陽性的菌株送北京華大基因公司測序。序列比對正確的菌株搖菌，提取質粒，轉化酵母Y2H，酵母的轉化采用PEG/LiAc法[15]，轉化后的酵母經SD/-Trp固體篩選培養(yǎng)基30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落接種于SD/-Trp單缺液體培養(yǎng)基，30 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600為2.0。菌液分別點于SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-His/X-α-Gal 固體篩選培養(yǎng)基上。30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落的生長及顯色情況，并以轉入空載pGBKT7的酵母作為陰性對照，同時以含有pGBKT7-EsDREB2B載體的酵母菌株作為陽性對照[16]。

1.7　白番紅花CrCBF1基因酵母功能驗證分析

構建酵母表達載體pYES2-CrCBF1，利用Kpn1單酶切質粒pYES2，設計特異性引物CrpYES2-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質粒為模板進行PCR擴增，產物純化回收，利用pEASY?Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，目的基因片段連入pYES2線性載體，構建酵母表達載體pYES2-CrCBF1，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測為陽性的菌株送北京華大基因公司測序，序列比對正確的菌株搖菌，提取質粒，轉化釀酒酵母INVSc1，酵母的轉化采用PEG/LiAc法[15]。酵母涂布于SC-U尿嘧啶缺陷型固體篩選培養(yǎng)基(終濃度2%葡萄糖為碳源)中30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取單克隆酵母菌落于SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.8，之后菌體重懸于SC-U(終濃度2%半乳糖為碳源)誘導培養(yǎng)基中，調整OD600為0.4，30 ℃誘導培養(yǎng)36 h。收集菌體重懸于SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)液體培養(yǎng)基中，調整OD600為2.0。-20 ℃冷脅迫72 h[17-18]。脅迫后的菌液在SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)固體培養(yǎng)基上進行梯度稀釋驗證，觀察菌株的存活狀況，并以轉入空載pYES2的酵母作為對照。

2　結果與分析

2.1　白番紅花CrCBF1基因的克隆及生物信息學分析

以白番紅花cDNA為模板，以設計的全長引物進行PCR擴增，把純化的PCR產物連接到pMD19-T載體后送樣測序，得到CrCBF1完整的cDNA序列。結果顯示白番紅花CrCBF1基因開放閱讀框長度為642 bp,共編碼213個氨基酸。

ProtParam工具計算顯示，CrCBF1蛋白的分子量為23.8 kD，理論等電點為4.99。利用NCBI中BLASTP同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該序列和馬藺(Irislacteavar.lactea)IlCBF1(AAZ57434.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBF1(NM118681)、蘿卜(Raphanussativus)RsCBF1(ACX48435.1)的相似性分別達到97%、98%和77%。利用ExPASy的SOPMA工具對CrCBF1氨基酸序列的二級結構進行分析，顯示CrCBF1蛋白由32.39%的α-螺旋(alpha helix)，7.98%的β-折疊(beta turn)，15.02%的延伸主鏈(extended strand)和44.60%的無規(guī)卷曲(random coil)組成，可以看出，無規(guī)卷曲是CrCBF1蛋白的主要組成部分，α-螺旋、β-折疊以及延伸主鏈則散布在蛋白序列中。利用NCBI蛋白保守結構域分析工具CDD分析顯示，CrCBF1蛋白在第46～106個氨基酸之間是AP2/ERF保守序列(圖1)。利用Phyre 2.0工具分析CrCBF1蛋白的AP2結構域，顯示這個結構域由3條反向的β折疊、1條α螺旋和一段無規(guī)卷曲組成，其對應的序列在圖1中標出。利用MEGA5.0軟件，通過鄰近法構建CrCBF1蛋白與其他物種的同源關系進化樹(圖2)，系統(tǒng)進化樹分析顯示：白番紅花CrCBF1蛋白除了與單子葉植物馬藺蛋白進化樹關系相近，與其他單子葉植物大麥、水稻及羅漢竹的CBF1蛋白進化樹關系較遠，而與雙子葉植物親緣關系較近，發(fā)現(xiàn)與十字花科物種的擬南芥、小白菜和蘿卜CBF1蛋白進化樹關系相近。

DQ074478.蘋果；ABV27087.擬南芥；AAL84170.大麥；.β-折疊；.α-螺旋圖1　白番紅花CrCBF1與其他植物CBF1蛋白的多重序列比對DQ074478.Malus domestica；ABV27087.Arabidopsis thaliana；AAL84170.Hordeum vulgare；.β-sheet；.α-helixFig.1　Multiple alignment of CBF1 proteins in Crocus alatavicus and other plants

2.2　白番紅花CrCBF1蛋白亞細胞定位分析

含有融合表達載體pBI121-CrCBF1-GFP的農桿菌注射到2周大的本氏煙草幼苗中，使得農桿菌進入到煙草的組織細胞間隙，利用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片表皮，顯示目的蛋白攜帶的GFP發(fā)出的綠色熒光定位在細胞核(圖3)，在空載的對照中，GFP發(fā)射的熒光定位于細胞核和細胞膜(圖3)。結果表明白番紅花CrCBF1蛋白定位于細胞核，此結果和擬南芥AtCBF1蛋白定位結果一致[5]。

2.3　白番紅花CrCBF1轉錄因子激活活性分析

觀察在涂有X-α-Gal的篩選培養(yǎng)基上陽性菌株的生長及顯色情況來檢測基因的自激活活性,結果如圖4所示,結果表明：陰性對照，即轉pGBKT7空載Y2H酵母，在單缺培養(yǎng)基上可以生長，在雙缺培養(yǎng)基及涂有X-α-Gal的雙缺培養(yǎng)基上不能生長不顯色，陽性對照(實驗室保存)和重組酵母均可以在雙缺培養(yǎng)基上生長，并在涂有X-α-Gal雙缺培養(yǎng)基上生長顯藍色，表明CrCBF1蛋白具有轉錄自激活活性。

圖4　CrCBF1自激活活性分析Fig.4　Transactivation activity assay of CrCBF1 in yeast cells

A～C. CrCBF1在煙草中的定位情況；D～F. 空載pBI121-GFP在煙草中的定位情況。A、D. 熒光通道；B、E. 明場；C、F. 疊加圖；圖3　白番紅花CrCBF1蛋白在煙草中的亞細胞定位A-C.Nicotiana tabacum L. cells were transformed with CrCBF1； D-F.N. tabacum L. cells were transformed with pBI121-GFP. A， D. Fluorescence；B， E. Bright field；C， F. MergeFig.3　Subcellular localization of CrCBF1 protein in N. tabacum L.

10-1、10-2、10-3、10-4、10-5分別代表菌液稀釋10、100、1 000、10 000、100 000倍A. 無脅迫(對照)；B. -20 ℃冷脅迫72 h圖5　重組酵母和對照酵母在冷脅迫條件下的生長狀況10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 represent 10, 100, 1 000, 10 000, 100 000 times dilutions of yeast cellsA. Non-stress (control)；B. Freezing stress (-20 ℃) for 72 hoursFig.5　Growth of S. cerevisiae yeast cells transformed with the empty vector pYES2 and with the pYES2-CrCBF1 under cold stress conditions

2.4　白番紅花CrCBF1基因酵母功能驗證分析

為研究CrCBF1基因的功能，挑取重組酵母和對照酵母單克隆菌落，在以葡萄糖為碳源的SC-U篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.8，然后在以β-半乳糖為碳源的SC-U誘導培養(yǎng)基中(調整OD600為0.4)誘導培養(yǎng)36 h，進行冷脅迫處理。由圖5可見，在非脅迫條件下重組酵母和對照酵母的生長狀況基本一致(轉基因酵母相對于對照酵母長勢稍差一些)，而在20 ℃黑暗冷處理72 h后，重組酵母的生長狀況明顯優(yōu)于對照酵母的生長狀況，表明在酵母中過表達CrCBF1基因可以提高酵母的抗寒能力。

3　討　論

AP2/ERF轉錄因子是植物特有的大家族轉錄因子，包括4個主要的亞家族：AP2、RAV、ERF和DREB亞家族[19]，CBFs蛋白又稱為DREB1蛋白[20]，屬AP2/EREBP家族轉錄因子，能識別CRT/DRE冷及脫水響應元件，在擬南芥中很多冷及脫水響應相關基因的啟動子中均含CRT/DRE元件[21]，CRT/DRE元件含有保守的5 bp核心基序CCGAC[22]。

本實驗克隆得到了白番紅花CrCBF1基因的cDNA序列，序列分析表明，CrCBF1蛋白有一個由60個氨基酸組成的AP2結構域，且在AP2結構域的上下游分別含有被認為是CBF轉錄因子特征序列的兩段短肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR[23]，分別位于AP2基序的上游和下游，推測可能為CBF蛋白的核定位信號區(qū)及轉錄激活區(qū)[5, 24]，這2段保守序列也表明CrCBF1是典型的CBF轉錄因子。

亞細胞定位實驗顯示，CrCBF1轉錄因子主要作用于細胞核，這一結論與擬南芥AtCBF1轉錄因子[5]、短柄草BdCBF1轉錄因子[14]定位結果一致，但也有些轉錄因子定位于細胞核和細胞膜，如OsDREB2E轉錄因子[25]，有研究表明一些轉錄因子可分布在細胞質中作為結構蛋白參與細胞質的重要反應[26]。轉錄因子主要在轉錄水平發(fā)揮作用，所以一般定位于細胞核，一些轉錄因子含有一個或者多個NLS區(qū)，可引導其進入細胞核，也有些轉錄因子不含NLS，通過和其它轉錄因子形成復合物以進入細胞核，轉錄因子也可以在分子伴侶及其它跨膜蛋白的作用下通過對自身構象的改變以作用于不同的細胞器。

在酵母功能驗證實驗中，對轉CrCBF1基因酵母和轉空載酵母進行干、鹽、冷和熱脅迫，結果顯示，轉基因酵母在冷脅迫下，其耐冷性強于轉空載酵母，而在干(30% PEG6000 48 h)、鹽(5 mol·L-1NaCl 48 h)及熱(45 ℃ 48 h)的脅迫下，其生長狀況和轉空載酵母相比并沒有優(yōu)勢(實驗結果未發(fā)表)，表明CrCBF1基因在酵母中主要參與調控冷相關基因的表達，不響應干、鹽及熱等脅迫，這一結論與在擬南芥中AtCBF1基因的表達只受低溫脅迫調控，而不受干、鹽脅迫調控結果一致[27]。本實驗采用的酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株，冷脅迫處理方法為-20 ℃處理72 h，Rodriguezvargas報道，在釀酒酵母中過表達ERG10基因，在-20 ℃處理5 d后，釀酒酵母出現(xiàn)生存率表型差異[18]，李海燕等報道，在釀酒酵母中過表達齒肋赤蘚ScDREB基因，-20 ℃處理36 h后，釀酒酵母出現(xiàn)表型差異[28]，這些實驗不同的冷處理時間可能和脅迫前菌液的濃度以及脅迫后點樣的量相關，也可能是由于過表達不同的基因對酵母的作用機制不同導致表型差異所需的時間不同。

本實驗克隆得到了白番紅花CrCBF1基因，初步探討了該基因的一些特性，酵母功能驗證表明CrCBF1基因可以提高酵母的耐冷性能，為下一步擬南芥體系功能驗證及基因開發(fā)利用奠定了基礎。

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