唐古特虎耳草譜系地理學研究

更吉卓瑪，李　彥，賈留坤，夏銘澤，高慶波

(1 中國科學院西北高原生物研究所 中國科學院高山植物適應與進化重點實驗室，西寧 810001；2 中國科學院大學，北京 100039；3 中國科學院西北高原生物研究所 青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810001)

由于復雜的地理拓撲結(jié)構(gòu)、微環(huán)境以及更廣泛的生態(tài)位，高山地區(qū)往往具有較高的生物多樣性，如高加索山、安第斯山、阿爾卑斯山等[1-3]。青藏高原及其周邊的高山地區(qū)包含了3個全球生物多樣性熱點地區(qū)，即東部的橫斷山區(qū)、南部的喜馬拉雅山系及西部的阿爾泰和天山山脈[4]。一般認為，與造山運動相關(guān)的地理隔離和異域分化是導致青藏高原地區(qū)植物多樣性較高的原因之一[5-6]。快速輻射分化在青藏高原地區(qū)的很多植物類群中被檢測到，如馬先蒿屬(PedicularisL.)[7]、紅景天屬(RhodiolaL.)[8]、風毛菊屬(SaussureaDC.)[9]、虎耳草屬(SaxifragaL.)[10-11]、槖吾屬-垂頭菊屬-蟹甲草屬復合群(LigulariaCass.-CremanthodiumBenth.-ParasenecioW. W. Sm. & J. Small)[12]等。然而，與較高分類階元的分化模式不同，青藏高原地區(qū)植物種內(nèi)居群間的分化可能更多的受到第四紀冰期氣候波動的影響。更新世晚期以來，青藏高原經(jīng)歷了至少4次規(guī)模較大的冰期，其中聶聶雄拉冰期(第二冰期，約720～500 ka)強度最大，冰川擴張最廣，此后冰期強度逐漸減弱[13-14]。而全球末次盛冰期時青藏高原冰川的擴張程度非常有限，這與歐洲和北美大陸末次冰期形成統(tǒng)一的冰蓋不同[15]。第四紀冰期與間冰期交替所引起的氣候波動對于現(xiàn)存生物類群的地理分布格局和遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了極大的影響[16-17]。由于復雜的地理地貌特征、未被統(tǒng)一的大冰蓋覆蓋以及東亞季風氣候和印度季風氣候的影響，青藏高原地區(qū)的植物可能具有更復雜的第四紀冰期進化歷史[18-19]。一方面，某些植物，如祁連圓柏(Juniperusprzewalskii)[20]、青海云杉(Piceacrassifolia)[21]等，在第四紀冰期時由高原臺面退縮到海拔較低的東南部邊緣避難所內(nèi)，間冰期或冰期后再從邊緣避難所回遷到高原臺面，從而形成現(xiàn)有的地理分布格局。另一方面，由于第四紀冰期時青藏高原未被統(tǒng)一的大冰蓋覆蓋，僅有不同程度的山地冰川發(fā)育，高原臺面可能存在適宜的局部微環(huán)境而成為某些耐寒植物的避難所。對銀露梅(Potentillaglabra)[22]、露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)[23]和西川紅景天(Rhodiolaalsia)[24]等的研究揭示，在第四紀冰期時高原臺面的居群并沒有退縮到高原邊緣避難所，而是在高原臺面上的一個或幾個較大的避難所中保留下來，間冰期或冰期后再由避難所向附近擴散。此外，對西藏圓柏復合群(Juniperustibeticacomplex)[25]、西藏沙棘(Hippophaetibetana)[26]、菊葉紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia)[27]等的研究發(fā)現(xiàn)，這些物種第四紀冰期時在高原臺面存在多個微型避難所，這些微型避難所在物種的分布范圍內(nèi)呈均勻分布。然而，具有不同分布范圍、生境和生活史特征的植物可能具有不同的第四紀冰期進化歷史。對青藏高原地區(qū)更多的植物進行譜系地理學研究，不但可為高山植物演化歷史與第四紀冰期的關(guān)系提供依據(jù)，同時對青藏高原生物多樣性保護具有重要啟示。

虎耳草屬是虎耳草科(Saxifragaceae)最大的屬，約有450～500種，主要分布在歐洲和亞洲的高山地區(qū)，某些物種環(huán)北極分布，另有一些物種擴散到南美洲的落基山脈、安第斯山脈和火地島[10-11]。中國產(chǎn)虎耳草屬植物約220種，主要分布在青藏高原-喜馬拉雅地區(qū)[28]。虎耳草屬植物被廣泛地用于譜系地理學和系統(tǒng)發(fā)育學研究，來揭示北極和高山地區(qū)植物的分化式樣[10-11, 29-32]。然而，青藏高原作為虎耳草屬物種多樣性中心之一，該地區(qū)虎耳草屬植物種內(nèi)分化與第四紀冰期的關(guān)系尚不明確。唐古特虎耳草(S.tanguticaEngl.)為多年生草本植物，生于海拔2 900～4 600 m的高山草甸、灌叢、石隙，分布于青海、甘肅、四川、西藏等地，是青藏高原地區(qū)高山草甸的重要組成成分，對維持高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。本研究選取葉綠體DNA(cpDNA)非編碼區(qū)trnL-trnF和rpl16片段對青藏高原地區(qū)的唐古特虎耳草進行譜系地理學研究，目的在于揭示該物種居群內(nèi)與居群間的遺傳分布式樣，討論唐古特虎耳草對于第四紀氣候波動的響應，探討其現(xiàn)有地理分布格局的歷史成因。

1　材料和方法

1.1　實驗材料

研究材料于2007年至2014年采自青海、西藏、四川、甘肅，共采集唐古特虎耳草18個居群209個個體(表1，圖1)。每個居群隨機采集2～24個個體，個體之間相隔至少10 m以上。采集生長良好植株的新鮮嫩葉后立即用硅膠干燥，帶回實驗室存放于-20 ℃冰箱備用。憑證標本由R. J. Gornall教授和高慶波副研究員共同鑒定，館藏于中國科學院西北高原植物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)。

表1　唐古特虎耳草18個居群的采集信息

餅狀圖表示每個居群中單倍型的頻率圖1　唐古特虎耳草18個居群的采樣圖以及葉綠體單倍型分布圖Pie charts show the proportions of haplotypes within each populationFig.1　Map of the 18 sampled populations of S. tangutica and the distribution of cpDNA haplotypes in the species

1.2　DNA提取與PCR擴增

本研究采用改良的CTAB法從硅膠干燥的葉片中提取總DNA[33]。采用通用引物對所有個體的cpDNAtrnL-trnF和rpl16片段進行PCR擴增[34-35]。PCR擴增反應體系為50 μL：包含5 μL的10 × PCR Buffer(含1.5 mmol/L MgCl2)，2 μL的10 mmol/L dNTPs，正反引物各1.0 μL(5 pmol/L)，TaqDNA聚合酶(TaKaRa，大連)0.4 μL，1 μL的DNA模板，用雙蒸水補足到50 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，32循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后送測序公司進行雙向測序。

1.3　數(shù)據(jù)分析

利用Chromas 2.6.2軟件(http://www.technelysium.com.au)對測序峰圖進行肉眼核對。利用MEGA 7.0.26軟件對序列進行對位排列并統(tǒng)計序列的堿基組成[36]，發(fā)現(xiàn)trnL-trnF序列上存在一段約20 bp的poly A結(jié)構(gòu)，為了確保堿基變異的可靠性，poly A及兩側(cè)約40 bp的堿基被刪除。同樣，對rpl16序列中出現(xiàn)的大于11 bp的poly A和poly T結(jié)構(gòu)也進行了類似的刪除處理。利用DnaSP 5.10軟件統(tǒng)計cpDNA聯(lián)合序列的變異位點并確定單倍型[37]?？傔z傳多樣性(HT)、居群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)、居群間遺傳分化系數(shù)GST和NST值均利用PERMUT軟件進行計算[38]。其中GST僅考慮單倍型的頻率，而NST兼顧了單倍型頻率和單倍型之間的相似性。使用U-統(tǒng)計方法對GST和NST進行比較(1 000次重復的置換檢驗)以檢測單倍型變異的地理分布模式。NST大于GST且顯著，表明居群在分布范圍內(nèi)具有顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)。由于PERMUT軟件要求每個居群至少要有3個個體，所以，居群P13(2個個體)在進行PERMUT分析時未包含在內(nèi)。

運用Arlequin 3.5.2計算每個居群的單倍型多樣性(He)和核苷酸多樣性(π)[39]。利用Arlequin軟件包中的分子變異分析(AMOVA)檢測居群內(nèi)和居群間的遺傳變異水平，并對單倍型分布的FST進行評價(1 000次置換檢驗)[40]。Tajima’sD、Fu & Li’sD*兩種無限突變位點模型的中性檢驗及歧點分布分析都在DnaSP 5.10程序中完成[41-42]。

以最大簡約法為原則，利用NETWORK 4.6.1.3軟件構(gòu)建單倍型中央連接網(wǎng)狀圖[43-44]。在運行該軟件時，對于多堿基的插入、缺失或突變位點，被認為是通過一步突變形成。在單倍型Network圖中，原始的單倍型多存在于網(wǎng)絡圖的內(nèi)部，而近代起源的單倍型發(fā)生在網(wǎng)絡圖的邊緣位置[45-46]。

2　結(jié)果與分析

2.1　唐古特虎耳草的單倍型分布

對18個居群209個個體的trnL-trnF和rpl16片段進行測序，MEGA軟件對位排列后的矩陣長度為1 626 bp，通過DnaSP軟件鑒定出74個單倍型，有25個簡約信息位點(表2)。在檢測出的74個單倍型中，有53個單倍型是居群特有單倍型，單倍型H5出現(xiàn)的頻率最高，有46個個體擁有此單倍型。表3顯示在18個居群中，16個居群擁有特有單倍型。居群的遺傳多樣性(He)范圍為0.490 9～1.000 0，平均為0.853 6；居群的核苷酸多樣性(π)范圍為0.007 506～0.046 481，平均為0.022 145。

2.2　居群遺傳結(jié)構(gòu)特征

通過PERMUT程序計算得出唐古特虎耳草居群內(nèi)平均遺傳多樣性HS值(0.843)、總遺傳多樣性HT值(0.933)、居群間遺傳分化GST(0.097)和NST值(0.109)。使用U-統(tǒng)計方法對唐古特虎耳草單倍型變異的地理結(jié)構(gòu)進行檢驗后發(fā)現(xiàn)NST大于GST，但不顯著(P> 0.05)，且居群間的遺傳分化水平很低，表明唐古特虎耳草在現(xiàn)有分布區(qū)域內(nèi)沒有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。分子變異分析(AMOVA)的結(jié)果表明，居群間的遺傳變異僅為8.15%(FST= 0.081 45；P< 0.01)，而居群內(nèi)的遺傳變異為91.85%(表4)，進一步揭示了唐古特虎耳草遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。

2.3　基于cpDNA聯(lián)合序列的居群歷史動態(tài)分析

對唐古特虎耳草cpDNA聯(lián)合序列所有個體進行中性檢驗，結(jié)果表明，Tajima’sD(-2.045 07，P< 0.05)和Fu & Li’D*(-3.629 27，P< 0.05)均為顯著的負值，推測其分布范圍或者個體數(shù)近期經(jīng)歷過擴張。歧點分布分析結(jié)果顯示，在唐古特虎耳草整個分布范圍內(nèi)觀測到的歧點分布呈單峰曲線(圖2)，其SSD值(0.007 2)和Raggednes index值(0.007 6)均不顯著(P> 0.05)，說明該物種在整個分布范圍內(nèi)經(jīng)歷過近期擴張現(xiàn)象，這與中性檢驗結(jié)果一致。

2.4　單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

最大簡約法(maximum parsimony, MP)、最大似然法(maximum likelihood, ML)、貝葉斯法(Bayesian inference, BI)構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹均呈現(xiàn)“刷子”結(jié)構(gòu)，不能很好地揭示單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，也表明了唐古特虎耳草單倍型的快速輻射分化(結(jié)果未顯示)。NETWORK軟件可更好揭示遺傳分化較淺序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?；谧畲笏迫环?gòu)建74個單倍型的中央鏈接網(wǎng)狀圖，結(jié)果顯示(圖3)，居群共享單倍型，如H1、H2、H3、H5、H16等位于網(wǎng)狀圖的中央位置，而居群特有單倍型一般位于網(wǎng)狀圖的邊緣。根據(jù)溯祖理論，共享單倍型為較古老的單倍型，而居群特有單倍型可能是通過近期輻射分化衍生而來的較年輕的單倍型。

表2　唐古特虎耳草74個單倍型trnL-trnF和rpl16片段簡約信息位點

續(xù)表2Continued Table 2

單倍型Hap簡約信息位點ParsimonyinformativesitetrnL-trnFrpl16230355414456611792813928966988100010901124119213341352135913601414145114571465147915511562H53-------------------------H54--------------?A----------H55---------?C--?A------------H56--------?T--------?GC-----?TH57-----------?T-?A------?A---?TH58-------------------------H59-------------------------H60----------------?A--------H61----------?A--------------H62-------------------------H63---------?C--?A------------H64--------?T---------------?TH65-C-----C-?C---------------H66----C------?T-----------?GTH67--------?T--?T-------?AA-?A-?TH68-------------------------H69-C----A-------?A----------H70--------------?A----------H71-------------------------H72A----T------------------?TH73----------------?A--------H74----------?A--------------

注：-代表與單倍型H1相同的堿基

Note: - stands for the same base ashaplotypeH1

表3　唐古特虎耳草18個居群的單倍型組成、遺傳多樣性和核苷酸多樣性

表4　唐古特虎耳草18個居群的分子遺傳變異(AMOVA)分析結(jié)果

圖2　唐古特虎耳草209個個體葉綠體DNA2個片段聯(lián)合數(shù)據(jù)的歧點分布分析Fig.2　Mismatch distribution for 209 individuals of S. tangutica based on two cpDNA fragments

3　討　論

3.1　唐古特虎耳草的居群遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳變異分析表明唐古特虎耳草cpDNA片段總遺傳多樣性水平較高，HT= 0.933。類似的結(jié)果也在青藏高原很多高山植物中被檢測到，如偏花報春(Primulasecundiflora,HT= 0.966)[47]、西藏沙棘(Hippophaetibetana,HT= 0.956)[26]、綿參(Eriophytonwallichii,HT= 0.979)[48]、西川紅景天(Rhodiolaalsia,HT= 0.950)[24]、菊葉紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia,HT= 0.937)[27]等。然而，這些物種大多數(shù)都具有低的居群內(nèi)平均遺傳多樣性。在本研究中，唐古特虎耳草不僅具有較高的總遺傳多樣性，居群內(nèi)的平均遺傳多樣性也很高(HS= 0.843)，表明唐古特虎耳草較高的遺傳變異主要由居群內(nèi)遺傳變異所致。這一結(jié)果也得到了分子變異分析(AMOVA)的證實。AMOVA分析表明，唐古特虎耳草居群內(nèi)遺傳變異占總變異的91.85%，而居群間遺傳變異僅為8.15%，進一步揭示了唐古特虎耳草遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。如此高的居群內(nèi)遺傳變異在青藏高原的植物中并不多見，推測造成該遺傳結(jié)構(gòu)的原因如下：一方面，由于檢測到的74個單倍型中只有少數(shù)共享單倍型，但其個體數(shù)所占比例很高(67.46%)，并且這些共享單倍型在居群中隨機分布，因此降低了居群間的遺傳差異；另一方面，居群特有單倍型比例高(53/74)，某些居群固定多個特有單倍型，從而增加了居群內(nèi)的遺傳變異。特有單倍型比例較高的物種往往不能揭示出明顯的譜系地理格局[22, 24, 27]。 此外，對虎耳草屬山羊臭組(Saxifragasect.CiliataeHaw.)系統(tǒng)發(fā)育和物種形成的研究表明，唐古特虎耳草所在的唐古拉亞組(subsect.HirculoideaeEngl. & Irmsch.)具有較快的分化速率，該亞組約110個物種是在最近的2.12百萬年(Ma)分化而來[10]。由此推測，唐古特虎耳草具有更短的居群分化歷史。事實上，基于NETWORK構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，大量的特有單倍型位于NETWORK圖的邊緣，揭示了唐古特虎耳草單倍型的近期快速分化。在第四紀冰期前，唐古特虎耳草可能廣泛分布于青藏高原及其周邊地區(qū)，并廣泛固定某些古老單倍型(如H5)。隨著第四紀冰期氣候的波動，原來連續(xù)的居群片段化，形成了相互隔離的居群，并經(jīng)歷了異域分化，產(chǎn)生大量特有單倍型。在此過程中，瓶頸效應和遺傳漂變等作用使得特有單倍型在居群中固定下來，抹去了居群原有的部分遺傳結(jié)構(gòu)。由于單獨進化時間較短，特有單倍型之間的差異大多表現(xiàn)在單個堿基的變異。

圓的大小表示單倍型頻率，實心方塊代表缺失單倍型圖3　唐古特虎耳草cpDNA聯(lián)合片段74種單倍型的中央連接網(wǎng)狀圖Circle size is proportional to haplotype frequencies, parallelograms represent missing haplotypesFig.3　Median-joining network of 74 haplotypes of S. tangutica based on two cpDNA fragments

3.2　冰期避難所及居群進化歷史的推測

第四紀循環(huán)的氣候波動對生物區(qū)系的分布和遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大的影響[49]。植物對第四紀冰期的反應可以根據(jù)現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)進行追溯。于海彬等[50]綜述了36種高山植物的譜系地理格局，總結(jié)出高山植物面對青藏高原復雜的地理結(jié)構(gòu)、微氣候和生境條件所呈現(xiàn)出的譜系歷史。一部分高山植物在第四紀冰期時退縮到青藏高原邊緣避難所，冰期后回遷到高原臺面。符合這種“退縮-回遷”模式的物種，其遺傳結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為遺傳多樣性較高的居群和古老單倍型往往集中在高原邊緣避難所內(nèi)，居群遺傳多樣性由高原邊緣向高原臺面遞減。此外，一些耐寒植物，在冰期時沒有完全退縮到低海拔的邊緣地區(qū)，而是在高原臺面形成了一個或幾個相互隔離的避難所，冰期后發(fā)生局部擴張。符合這種“高原臺面避難所-局部擴張”模式的物種，其遺傳結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為特有單倍型或者遺傳多樣性較高的居群分布在高原臺面上的一個或幾個相互隔離的區(qū)域。另外，某些物種第四紀冰期時在高原臺面形成多個微型避難所，間冰期或冰期后發(fā)生小范圍的擴張，其遺傳多樣性較高的居群和特有單倍型在物種的分布范圍內(nèi)均勻分布。

本研究沒有揭示出唐古特虎耳草遺傳多樣性較高的某一地理區(qū)域，也沒有發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性由高原邊緣向高原臺面遞減。相反，本研究所涉及的唐古特虎耳草居群普遍具有較高的遺傳多樣性，特有單倍型在分布范圍內(nèi)均勻分布。我們推測，由于青藏高原地形的高度異質(zhì)性以及復雜的局部微氣候和生境條件，在第四紀冰期時，唐古特虎耳草在高原臺面上未被冰川覆蓋的多個微型避難所中存活下來。唐古特虎耳草居群對第四紀冰期氣候波動的反應可能更多地表現(xiàn)為垂直海拔高度的遷移，而非大規(guī)模的水平遷移，這與銀露梅(Potentillaglabra)[22]和西川紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia)[27]的進化歷史相似。居群在垂直遷移的過程中發(fā)生了瓶頸效應和奠基者效應，居群隨機固定少量古老單倍型。隨后的異域分化和遺傳漂變使得較年輕的衍生特有單倍型在居群中固定下來，形成了唐古特虎耳草現(xiàn)有的居群遺傳結(jié)構(gòu)。居群歷史動態(tài)檢驗結(jié)果表明，Tajima’sD和Fu & Li’D*均為顯著的負值，歧點分布分析呈單峰曲線，說明唐古特虎耳草經(jīng)歷過近期分布范圍或者個體數(shù)的擴張[51-53]。物種經(jīng)歷分布范圍擴張事件，其原分布中心應具有較高的遺傳多樣性和特有單倍型，并且原分布中心的居群包含擴散區(qū)域居群所具有的單倍型。但在本研究中，大量的特有單倍型在唐古特虎耳草的整個分布范圍內(nèi)均勻分布，遺傳多樣性和核苷酸多樣性較高的居群也呈現(xiàn)均勻分布，并未檢測到分布范圍擴張的信號。由此推測，該物種可能經(jīng)歷過個體數(shù)快速擴張事件，從而導致了中性檢驗的負值和錯配分布的單峰曲線。

綜上所述，唐古特虎耳草具有較高的遺傳變異，且主要由居群內(nèi)遺傳變異所致，大量特有單倍型是近期輻射分化的結(jié)果。唐古特虎耳草的進化歷史與西藏圓柏復合群(Juniperustibeticacomplex)[25]、西藏沙棘(Hippophaetibetana)[26]、菊葉紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia)[27]相似，第四紀冰期時在高原臺面存在多個微型避難所。第四紀冰期氣候波動使得原來連續(xù)的居群片段化，形成了相互隔離的居群，并發(fā)生異域快速分化，形成大量特有單倍型。唐古特虎耳草居群對第四紀冰期氣候波動的反應可能更多地表現(xiàn)為垂直海拔高度的遷移，而非大規(guī)模的水平遷移。此研究為青藏高原地區(qū)譜系地理學研究提供了一個新的案例，為了解第四紀冰期高山植物的避難所和現(xiàn)有分布格局的成因提供了參考依據(jù)。

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