杜仲葉片6種主要活性成分的遺傳變異研究

慶　軍，魏艷秀，王鼎涵，王　璐，劉攀峰，杜紅巖，杜慶鑫*

(1 中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，鄭州 450003；2 國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，鄭州 450003；3 國家林業(yè)局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，北京 100010；4 西北工業(yè)大學 附屬中學，西安 710072)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為單科單屬單種，是第四紀冰川侵襲后僅留存于中國的孑遺樹種，是中國特有的珍稀瀕危二級保護植物和國家戰(zhàn)略樹種，具有很高的藥用價值、營養(yǎng)價值和生態(tài)維護功能[1-2]。

作為中國傳統(tǒng)中藥材，杜仲以皮入藥已有兩千多年的歷史。近年來研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉片含有與皮相似的活性成分，具有很高的藥用價值。2005年，《中國藥典》(一部)將杜仲葉收錄為杜仲藥材。杜仲葉中活性成分主要有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類和黃酮類等[3-4]。其中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和車葉草苷為環(huán)烯醚萜類成分，具有清除自由基、降血糖、保護肝臟等作用[5-6]；綠原酸為苯丙素類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗癌、提高免疫力等作用；異槲皮苷是黃酮類成分，具有抗氧化、抗抑郁及擴張血管等多種生理活性[7]。杜仲葉除了珍貴的藥用價值外，在食品、保健品及飼料添加劑等領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景[8]。

目前對杜仲葉的研究多集中于活性成分提取、分離及藥理作用評價，而對中國豐富的杜仲種質(zhì)資源葉片活性成分的測定分析還未有系統(tǒng)研究。本研究通過對105份杜仲種質(zhì)資源葉片主要活性成分(綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、車葉草苷、異槲皮苷及總黃酮)進行系統(tǒng)測定分析，對杜仲葉主要活性成分的多樣性進行評價，以期篩選出活性成分含量高的優(yōu)良葉用杜仲資源，從而為發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源、選育新品種提供基礎(chǔ)材料，同時為杜仲資源的開發(fā)利用提供重要的理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

試驗在中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心杜仲基因庫進行，基因庫定植行間距為 3 m×3 m。利用混合取樣法對105份杜仲種質(zhì)材料的成熟葉片進行采集，包括雌株葉片58份，雄株葉片47份，種質(zhì)來源及數(shù)量見表1。每份種質(zhì)選擇長勢旺盛、無病蟲害的6株樣株進行葉的采集，每一單株從東南西北四個方向分別在枝條的中部采集典型葉片2片，共48片杜仲葉，低溫冷藏帶回實驗室備用。

1.2　儀器與試劑

儀器：髙相液相色譜儀(配water 1525 泵、2998 PDA 檢測器、2707 Autosampler)；AL204電子天平(海特勒-托利多儀器上海有限公司)；紫外可見分光光度計(Agilent CARY300)；HT-300BQ型數(shù)控超聲波清洗器(濟寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司)

試劑：桃葉珊瑚苷、蘆丁對照品購于中國食品藥品檢驗所，綠原酸、京尼平苷酸、車葉草苷、異槲皮苷對照品均購自于曼思特生物科技有限公司；實驗所用甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1　種質(zhì)來源與數(shù)量

1.3　測定方法

總黃酮含量采用 AlCl3 顯色法[9]。綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、車葉草苷及異槲皮苷等5種活性成分含量測定采用改進HPLC法[10]。

1.4　數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel計算各成分含量的平均值(X)、標準差(S)、變異系數(shù)等基本描述。根據(jù)計算結(jié)果把105份杜仲種質(zhì)6種活性成分劃分為10個等級，從第1級[Xi<(X-2S)]到第10級[Xi>(X+2S)]，每0.5S為1級，并對6種活性成分在每一級占有的種質(zhì)數(shù)作頻次分布圖。每一級的相對頻率(pi)用于計算遺傳多樣性指數(shù)，即香農(nóng)-維納指數(shù)計算公式如下：H′=-∑piLnpi[11]，其中pi為某一性狀第i級別試驗材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比[12]。采用SPSS 20.0對不同來源的杜仲種質(zhì)葉片活性成分含量進行單因素方差分析和Duncan多重比較分析，利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析各成分間的相關(guān)性，采用歐式平方距離Ward法對105份種質(zhì)進行聚類分析，對聚類結(jié)果進一步作單因素方差分析和Duncan多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　杜仲種質(zhì)葉片6種活性成分含量變異分析

105份杜仲種質(zhì)葉片6種活性成分含量見表2。桃葉珊瑚苷含量在6種成分中最高，均值為31.69 mg·g-1，其次是綠原酸的含量，均值為22.05 mg·g-1，其他活性成分由大到小的順序為總黃酮(15.92 mg·g-1)、京尼平苷酸(9.60 mg·g-1)、車葉草苷(4.56 mg·g-1)、異槲皮苷含量(3.37 mg·g-1)。6種活性成分含量在不同種質(zhì)間變異程度不同，其中異槲皮苷含量的變異系數(shù)34.42%最大，變異幅度為1.16～6.92 mg·g-1；京尼平苷酸含量變異系數(shù)居第二位，為27.71%，變異幅度為4.93～17.71 mg·g-1；總黃酮變異系數(shù)最低，為19.35%，變異幅度為6.70～22.53 mg·g-1。6種活性成分多樣性指數(shù)較高，均在2.0以上，各成分多樣性指數(shù)從大到小的排序為：桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸=車葉草苷、異槲皮苷、綠原酸=總黃酮。對各成分的F值分析發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)杜仲葉片6種主要活性成分差異性均達到極顯著水平(P<0.01)。表明杜仲種質(zhì)資源的6種主要活性成分具有較大的遺傳改良潛力。進一步對杜仲雌、雄株葉片6種活性成分含量比較分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)杜仲雄株葉片6種活性成分含量略高于雌株，但沒有顯著差異。

表2　杜仲種質(zhì)葉中6種活性成分含量基本參數(shù)統(tǒng)計

圖1　杜仲雌雄株葉片活性成分對比Fig.1　Comparison of six active components in male and female leaves of E. ulmoides

圖2　105份杜仲種質(zhì)葉片6種活性成分頻次分布Fig.2　Frequency distribution of six active component contents in leaves of 105 E. ulmoides germplasm resources

以遺傳多樣性測算的分級標準，分析了105份杜仲種質(zhì)葉片綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、車葉草苷、異槲皮苷及總黃酮含量在每一級占有種質(zhì)數(shù)的頻次分布(圖2)。6種活性成分含量分布相對集中，處于兩端的種質(zhì)較少，其中，綠原酸(圖2，A)、桃葉珊瑚苷(圖2，B)及總黃酮(圖2，F(xiàn))含量在1～10級均有分布，綠原酸主要集中在5～7級之間，桃葉珊瑚苷處在3～7級之間種質(zhì)數(shù)較多，總黃酮集中分布于4～7級；京尼平苷酸(圖2，C)、車葉草苷(圖2，D)及異槲皮苷(圖2，E)在2～10級上均有分布，且都集中分布于3～7級。

2.2　不同來源杜仲種質(zhì)葉片6種活性成分含量差異分析

不同來源間6種活性成分含量方差分析及多重比較結(jié)果見表3，除桃葉珊瑚苷，綠原酸、京尼平苷酸、車葉草苷、異槲皮苷和總黃酮含量在不同來源間均存在顯著差異。雖然不同來源間桃葉珊瑚苷差異不顯著，但仍存在一定的差別，河南洛陽資源的含量(36.45 mg·g-1)最高，比最低湖南株洲資源的含量高8.49 mg·g-1；綠原酸、異槲皮苷和總黃酮含量最高的是河北安國地區(qū)種質(zhì)，平均含量分別達到24.90、4.09和18.65 mg·g-1，綠原酸和總黃酮含量極顯著高于山西運城和河南開封的種質(zhì)，河南開封地區(qū)3種成分含量均最低，分別為15.75、2.27和13.29 mg·g-1。其中，河南洛陽地區(qū)的京尼平苷酸含量最高，其平均值達到11.33 mg·g-1，顯著高于湖南株洲和貴州遵義地區(qū)，且湖南株洲地區(qū)的含量(7.25 mg·g-1)最低，僅為河南洛陽的63.99%；車葉草苷含量最高的是江蘇響水地區(qū)種質(zhì)，平均含量達5.05 mg·g-1，顯著高于山西運城和湖南株洲地區(qū)，且湖南株洲地區(qū)的含量(3.77 mg·g-1)最低。

2.3　杜仲葉片6種活性成分含量的相關(guān)性分析

杜仲葉片6種活性成分含量的相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明，杜仲種質(zhì)資源葉片中6種活性成分含量之間存在不同程度的相關(guān)性，其中，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和車葉草苷3種環(huán)烯醚萜類物質(zhì)間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸、車葉草苷的相關(guān)系數(shù)分別為0.570和0.579，京尼平苷酸和車葉草苷的相關(guān)系數(shù)為0.256；綠原酸含量與異槲皮苷含量、桃葉珊瑚苷含量、車葉草苷含量和總黃酮均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與京尼平苷酸無顯著相關(guān)性；總黃酮與異槲皮苷和綠原酸呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.543和0.346，而與其他均無顯著相關(guān)性。

表3　不同來源間杜仲種質(zhì)6種活性成分含量分析

注：表中數(shù)據(jù)為均值±標準差；同列不同字母表示該成分在0.05水平上差異顯著；下同

Note: Data in table were X±S；The different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level； The same as below

表4　杜仲種質(zhì)葉片6種成分含量間相關(guān)分析

注：*與**分別表示在0.05和0.01水平上顯著相關(guān)

Note: * and ** represent significant correlation at 0.05 level and 0.01 level

表5　杜仲種質(zhì)各類群性狀特征

注：括號內(nèi)數(shù)字表示變異系數(shù)(%)

Note: Data in the bracket are the coefficient of variation(%)

圖中左側(cè)編號為105份杜仲種質(zhì)編號圖3　杜仲種質(zhì)葉片6種活性成分含量聚類分析105 E. ulmoides germplasm numbers were showed in the left side of the figureFig.3　Cluster analysis of six active components of E. ulmoides germplasm resources

2.4　杜仲種質(zhì)葉中6種活性成分含量的聚類分析

利用 SPSS 20.0對105 份杜仲種質(zhì)的6種成分進行聚類，在遺傳距離為8.5處將參試材料分為 4類(圖3)，各種質(zhì)類群特征見表5。第Ⅰ類群包括19份種質(zhì)材料，僅占總種質(zhì)的18.10%，該類群種質(zhì)總黃酮含量(18.72 mg·g-1)在4個類群種最高，變異系數(shù)(10.02%)在4個類群種最??；綠原酸含量(24.89 mg·g-1)和異槲皮苷含量(4.18 mg·g-1)在4類群中居第二位。 第Ⅱ類群中包括39份材料，占總種質(zhì)的37.14%，是4類群中種質(zhì)資源數(shù)目最多的一個類群，各成分含量表現(xiàn)均一般，其中車葉草苷、桃葉珊瑚苷及京尼平苷酸3種環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量在4類群中居第二位，均值分別為33.81、10.60和5.01 mg·g-1。第Ⅲ類群包括 27份材料，占總種質(zhì)的25.71%，除京尼平苷酸和總黃酮含量在4類群中處于第3位，其他4種活性成分含量在4類群中均最低。第Ⅳ類群包括20份材料，占總種質(zhì)的19.05%，該類群中除總黃酮含量居第二位，其他5種活性成分含量均高于其他類群，其中綠原酸含量均值為25.37 mg·g-1，變異系數(shù)在4類群中最小，10.46%；桃葉珊瑚苷含量均值為39.99 mg·g-1；京尼平苷酸含量均值為11.53 mg·g-1，變異系數(shù)在4類群中最大，21.91%；車葉草苷含量均值為5.60 mg·g-1，變異系數(shù)在4類群中最小，10.40%；異槲皮苷含量均值為4.56 mg·g-1，變異系數(shù)在4類群中最小，22.83%；總黃酮含量均值為17.72 mg·g-1。綜合分析發(fā)現(xiàn)，4類群中第Ⅳ類群20份杜仲種質(zhì)的6種活性成分表現(xiàn)均較好，可為后期葉用杜仲資源的選育提供基礎(chǔ)材料。

3　討　論

對種質(zhì)資源性狀進行差異性比較分析，了解其資源的多樣性，是育種工作的基礎(chǔ)。本研究對105份不同種質(zhì)杜仲葉中6種主要活性成分含量進行測定，發(fā)現(xiàn)杜仲葉片6種活性成分含量均較高。其中，綠原酸含量與金銀花相近，表明杜仲葉片也可作為綠原酸研究的優(yōu)質(zhì)材料[13]，桃葉珊瑚苷含量遠高于鮮地黃[14]，總黃酮含量略高于銀杏葉[15]，異槲皮苷含量與羅布麻葉相近[16]。說明杜仲葉有很高的藥用價值，開發(fā)利用潛力巨大。

進一步對不同種質(zhì)杜仲葉片活性成分含量比較分析，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)間杜仲葉中綠原酸、異槲皮苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、車葉草苷及總黃酮含量差異性均達到極顯著水平。這與黃玉仙[17]對不同種質(zhì)薯蕷多糖含量研究結(jié)果相一致。而且杜仲葉片6種活性成分含量變異程度均較高，變異幅度較大，表現(xiàn)出豐富的多樣性，其變異系數(shù)的變化范圍介于19.35%～34.42%，6種活性成分多樣性指數(shù)較高，均在2.0以上。表明杜仲種質(zhì)資源的6種主要活性成分具有較大的遺傳改良潛力，為優(yōu)良種質(zhì)選育提供了可能。

通過對各成分相關(guān)性分析，在對于種質(zhì)資源中某一個成分進行選擇時，就可以預(yù)測或優(yōu)先考慮到該成分的篩選可能對其他成分產(chǎn)生的影響。本研究通過對6種成分間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，車葉草苷、桃葉珊瑚苷及京尼平苷酸三種環(huán)烯醚萜類物質(zhì)間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，綠原酸與異槲皮苷、桃葉珊瑚苷、車葉草苷和總黃酮間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與京尼平苷酸無顯著相關(guān)性；總黃酮除與異槲皮苷含量和綠原酸含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系外，與其他成分均無顯著性相關(guān)性，其中相關(guān)系數(shù)分別為0.543、0.346。

聚類分析可以將性狀相似的聚為一類，以便系統(tǒng)分析各種質(zhì)特點，對植物育種和資源利用有較好的指導(dǎo)作用。本試驗采用歐氏平方距離法將105份杜仲種質(zhì)資源分為4大類群，聚類結(jié)果顯示，杜仲種質(zhì)資源葉片中綠原酸、異槲皮苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、車葉草苷和總黃酮含量與種質(zhì)來源無明顯的規(guī)律性。孫建等[18]對芝麻種質(zhì)資源葉片中葉綠素含量進行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與種質(zhì)來源、種質(zhì)類型間無明顯的規(guī)律性，傅建敏等[19]對柿資源葉片總黃酮和多酚研究也得到相似結(jié)論。這可能是由于不同地區(qū)間杜仲大規(guī)模引種栽培，導(dǎo)致杜仲葉片活性成分含量聚類與地理來源無關(guān)。綜合比較4大類群中6種活性成分含量的高低發(fā)現(xiàn)，類群Ⅳ為高含量類群，共有20份種質(zhì)，不僅為后期優(yōu)良葉用品種的開發(fā)利用提供出基礎(chǔ)原材料，也為杜仲活性成分的遺傳改良提供了可能。

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