Glu在適量飲用貴州某食用白酒1型糖尿病小鼠表達的變化

李容瑢，梁文妹，夏白娟，李一欣，王燕林，尹　丹

（貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州貴陽 550025）

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)發(fā)病率近年來呈升高趨勢，主要患病群體為兒童及青少年。胰島α及β細胞的穩(wěn)態(tài)被打破是T1DM發(fā)病的直接因素。胰島α細胞主要分泌胰高血糖素（Glucagon,Glu），Glu促進肝糖原分解及糖異生等作用而升高血糖[1]，同時可調(diào)控β細胞分泌胰島素（Insulin,Ins）的功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除實驗動物Glu受體基因后破壞其胰島β細胞，并不會引發(fā)高血糖，且可以修復(fù)β細胞部分功能[3-4]，故Glu在T1DM發(fā)病過程中也具有重要作用。

中國白酒成分除酒精與水外還含有豐富的生物活性物質(zhì)，適量飲酒與健康的關(guān)系也受到越來越多的關(guān)注。有關(guān)飲酒對胰島Glu的分泌影響的報道并不多見，有研究認為，適量飲酒能夠降低正常人血漿Glu水平[5]，Aagaard[6]則發(fā)現(xiàn)健康不定期飲酒者，飲酒后Glu分泌有所增加。本實驗通過建立小鼠單純飲酒、T1DM飲酒模型，觀察小鼠胰島Glu表達變化并檢測胰腺Glu mRNA表達水平，探討適量飲酒在T1DM小鼠發(fā)病過程中對α細胞可能的作用。

1　材料與方法

1.1　實驗動物與試劑

6～8周正常雄性C57BL/6J小鼠210只，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供；鏈脲佐菌素（streptozotocin ，STZ），Sigma公司；54%vol董酒；小鼠抗Glu多克隆抗體，新西蘭Watpa公司；免疫組織化學(xué)SABC試劑盒，武漢博士德公司；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GCG、β-actin引物由上海生工生物有限公司合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司。

1.2　動物分組

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為單純飲酒低劑量組(liquor consumption-low dose group,L-LDG,2.5 mL/kg·d,n≥6)、單純飲酒高劑量組(liquor consumption-high dose group,L-HDG,5.0 mL/kg·d,n≥6)；糖尿病組(diabetes group,DG,n≥6)；糖尿病-飲酒低劑量組(diabetes-low dose group,D-LDG,2.5 mL/kg·d,n≥6)，糖尿病-飲酒高劑量組(diabetes-high dose group,D-HDG,5.0 mL/kg·d,n≥6)、空白對照組(blank control group,BCG,n=3)。

1.3　模型制作及標本處理

單純飲酒組及糖尿病飲酒組均通過灌胃飲酒，每天1次，4:00 PM，連續(xù)灌胃至取材。灌胃第5周起糖尿病飲酒組及糖尿病組通過腹腔注射STZ 40 mg/kg，每天1次，連續(xù)5次，建立T1DM小鼠模型[7]?？瞻讓φ战M不做特殊處理。

各組小鼠均分別于開始注射STZ后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d取尾尖血測空腹血糖。每組分別取胰尾組織：（1）4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，每例3張切片，切片間隔56 μm；（2）液氮速凍，用于real-time PCR。

1.4　免疫組織化學(xué)SABC法

切片常規(guī)化蠟入水，10%甲醇-H2O2，羊血清（1:10），滴加一抗Glu(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，羊抗小鼠 IgG（1∶100），SABC 復(fù)合物（1∶100），DABH2O2顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，中性樹脂封片。0.01%PBS液代替一抗作陰性對照。

1.5　Real-time PCR檢測胰組織Glu mRNA表達

引物序列：GCG上游引物5'TTTACTTTGTGGCTGGATTGC 3'，下游引物 5'CCTGTGAGTGGCGTTTGTCT 3'，擴增產(chǎn)物長度156 bp；β-actin 上游引物 5'TGCTATGTTGCTCTAGACTTCG3'，下游引物5'ATGCCACAGGATTCCATACC 3'，擴增產(chǎn)物長度174 bp。將各組胰組織勻漿按TRIzol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并將RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各 0.4 μL，SYBR 溶液10 μL，超純水7.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃7 s，55 ℃ 10 s，72℃15 s重復(fù)45個循環(huán)。以上反應(yīng)在LightCycler480 Software Setup中進行。以β-actin作為內(nèi)參，每個標本3個復(fù)孔進行結(jié)果分析。結(jié)果采用相對定量法，目的基因相對表達差異倍數(shù)采用2－△△CT法計算。

1.6　圖像分析及形態(tài)學(xué)計量

隨機取各時間點各組小鼠免疫組織化學(xué)切片3張，40倍物鏡下，每張切片用BioMias圖像分析系統(tǒng)計數(shù)5個胰島。用Image pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測α細胞的Glu平均光密度；測胰島面積、有核α細胞數(shù)，按下列公式計算得α細胞面數(shù)密度(個/4000 μm2)：

其中：NA為面數(shù)密度，Nx為計數(shù)有核陽性細胞總數(shù)，Ar為計數(shù)胰島總面積。

1.7　統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS l6.0軟件包對所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用x±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　空腹血糖值

各時間點小鼠空腹血糖值如圖1所示，BCG、L-LDG及L-HDG無明顯變化（P＞0.05）；DG及DHDG空腹血糖值14 d開始升高，D-LDG 21 d開始升高且至28 d升至最高（P＜0.01），DG、D-LDG和D-HDG血糖均高于小鼠糖尿病成模標準11.1 mmol/L，與BCG、L-LDG、L-HDG相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在21 d及28 d，DG、D-LDG及D-HDG相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2　胰島α細胞形態(tài)和數(shù)量

BCG、L-LDG、L-HDG小鼠胰島呈圓形或卵圓形，散在分布于胰腺外分泌部之間。DG、DLDG、D-HDG小鼠在注射STZ 7 d，即開始出現(xiàn)胰島數(shù)目逐漸減少，面積有所減小。

α細胞主要分布于胰島周邊，數(shù)量較多，其免疫反應(yīng)產(chǎn)物Glu呈棕黃色細顆粒狀，分布于胞質(zhì)內(nèi)。隨注射STZ時間延長DG、D-LDG、D-HDG α細胞數(shù)量有所增多，大部分α細胞表達Glu免疫反應(yīng)強度無明顯變化。

免疫組織化學(xué)顯示胰島α細胞見圖2。圖2中，A為空白對照組；B為飲酒低劑量組；C為飲酒高劑量組；D、E、F分別為糖尿病組7 d、14 d及28 d；G、H、I分別為糖尿病-飲酒低劑量組7 d、14 d及28 d；J、K、L分別為糖尿病-飲酒高劑量組7 d、14 d及28 d。

2.3　胰島α細胞圖像分析及形態(tài)學(xué)計量

各時間點小鼠胰島α細胞Glu平均光密度值測定結(jié)果如圖3所示，單純飲酒及糖尿病各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　空腹血糖值檢測結(jié)果(mmol/L)(x±s)

胰島α細胞的面數(shù)密度值如圖4所示，單純飲酒各組小鼠NA與BCG差異無統(tǒng)計學(xué)意義；DG NA于7 d開始增加，D-LDL及D-HDL NA于10 d開始增加（P＜0.05）。

圖2　免疫組織化學(xué)顯示胰島α細胞

2.4　Glu mRNA的表達

Real-time PCR結(jié)果檢測Glu mRNA的表達在胰組織中的鑒定：Glu及β-actin mRNA的溶解曲線顯示單一溶解峰，未檢測到引物二聚體及其他非特異性熒光信號。

各組Glu mRNA相對表達量見圖5：BCG、LLDG Ins mRNA表達在各個時間點無明顯變化（P＞0.05）；L-HDG Ins mRNA在21 d及28 d有所升高（P＜0.05）；與BCG、L-LDG、L-HDG相比，DG、D-LDG、D-HDG Ins mRNA表達自10 d起逐漸升高（P＜0.05）。

圖3　胰島α細胞的平均光密度值(x±s)

圖4　胰島α細胞的面數(shù)密度值(x±s)

3　討論

Glu是由胰島α細胞分泌的29個氨基酸組成的多肽，對血糖有重要的調(diào)控作用。小鼠Gcg基因編碼產(chǎn)物為Glu、GLP-1及GLP-2。T1DM發(fā)病過程中胰島β細胞分泌的Ins絕對缺乏，同時Glu相對增多[8]，胰島內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，主要表現(xiàn)在空腹血糖及餐后血糖升高；但低血糖時Glu反而分泌相對不足[8-9]，使用小劑量Glu則可減緩T1DM發(fā)病過程中的低血糖癥狀[10]。

本課題組已在前期實驗中觀察了單純飲用某白酒及T1DM小鼠飲酒后胰島Ins的表達無明顯變化[11]。本實驗中單純飲酒組小鼠空腹血糖值、胰島Glu平均光密度值及NA，與BCG相比差異基本無顯著性，顯示該飲酒劑量及時間對小鼠無明顯影響。L-LDG及L-HDG Glu mRNA自21 d起表達有所增加，但相對應(yīng)時間點空腹血糖及Glu平均光密度、NA未見明顯差異，可能與轉(zhuǎn)錄與翻譯的時差性有關(guān)，有待進一步研究證實。

圖5　胰組織中Glu mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(x±s)

DG、D-HDG空腹血糖值自14 d時明顯升高，胰島Glu NA增多、Glu mRNA表達增加，考慮T1DM發(fā)病過程中隨胰島β細胞逐漸被破壞，α細胞數(shù)量增多填充胰島，胰島穩(wěn)態(tài)被打破。而D-LDG空腹血糖值升高較DG及D-HDG時間晚，可能與以下機制有關(guān)：適量飲酒抑制肝臟糖異生而降低空腹血糖水平[12]，增加脂聯(lián)素及高密度脂蛋白分泌等方式提高組織對Ins的敏感性[13-14]。

飲酒量的差異對糖尿病進程有不同程度的影響[15]，急性過量飲酒可導(dǎo)致Ins分泌減少而血糖升高[16]，Shai[12]的研究則表明適量飲酒能夠降低糖尿病患者的空腹血糖值。同時飲酒的種類的差別也對糖尿病有不同程度影響[16]。中國白酒釀造所采用的固態(tài)多微釀造工藝，使其與其他種類的酒相比具有更獨特的風味和多樣生物活性成分，如萜烯類化合物、脂肽類化合物、吡嗪類化合物、亞麻酸等[17-18]，在本實驗中這些生物活性成分也可能對T1DM的進程有一定影響。

綜上所述，在本實驗設(shè)定的劑量及時間內(nèi)，單純飲用該白酒小鼠Glu表達改變不明顯；適量飲酒對糖尿病小鼠Glu表達亦未見明顯影響。

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