普奈洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞生長機制的實驗研究

徐永飛　武海龍　趙哲媛　石英光

[摘要]目的：探討普奈洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的機制。方法：選擇本院瘢痕疙瘩患者病理組織，分離培養(yǎng)，獲取成纖維細胞，并分別于含有普萘洛爾的培養(yǎng)基（實驗組）和單純培養(yǎng)基（對照組）中進行培養(yǎng)，應用CCK-8法檢測兩組瘢痕疙瘩成纖維細胞生長曲線，酶標儀檢測450-630nm的吸光度值。結果：實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞生長能力明顯受到抑制，且吸光度值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：普萘洛爾可明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長，為整形外科中瘢痕疙瘩的預防及治療提供了新方向。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；成纖維細胞；普萘洛爾；生長曲線

[中圖分類號]R619⁺.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）02-0091-03

瘢痕疙瘩常繼發(fā)于皮膚傷口的不良愈合，不僅影響美觀，?？砂榘l(fā)局部感覺異常，嚴重者甚至可形成局部破潰，嚴重影響患者身心健康。普萘洛爾常用于整形外科中血管瘤的治療，其在抑制血管瘤侵襲性生長方面，療效顯著?；诖?，DE Mesquita CJ曾大膽假設將普萘洛爾應用于瘢痕疙瘩的治療，并做了大量的臨床實驗。本研究主要從普萘洛爾對瘢痕疙瘩的生物學特性方面出發(fā)，明確其影響瘢痕組織成纖維細胞生長的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1實驗藥品及試劑：鹽酸普萘洛爾片（東北制藥生產，批準文號：國藥準字HP1021682），PBS液，0.075%Ⅱ型膠原酶，10%FBS，低糖DMEM，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，青鏈霉素，0.25%胰蛋白酶，二甲基亞砜（DMSO）溶液，PBS溶液。

1.2瘢痕疙瘩組織：瘢痕疙瘩組織來源于本院整形外科瘢痕疙瘩切除患者，并經病理證實，且所有患者對本研究知情并簽署相關知情同意書。納入標準：①患者6個月內病變組織無破潰、感染及癌變等；②患者6個月內未口服抗瘢痕藥物或激素類藥物；③患者6個月內未接受放射治療；④無精神性疾病及相關器質性疾病者。

2方法

2.1瘢痕疙瘩成纖維細胞的制備：用PBS液沖洗所獲取的脂肪組織，用Ⅱ型膠原酶消化獲取脂肪顆粒，過濾上清液及未消化的脂肪組織，并放入離心機中以1200r/min離心10min，得到單核細胞，調整細胞濃度至104個細胞/ml，進行培養(yǎng)，獲取所取種子細胞，并進行免疫鑒定。

2.2實驗分組：根據(jù)培養(yǎng)基不同，將實驗分為2組，實驗組為含有50ng/L普萘洛爾的培養(yǎng)基；對照組為單純培養(yǎng)基。將獲取的瘢痕疙瘩成纖維細胞分別放入兩組培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，48h后，兩組培養(yǎng)基中分別加入10ul的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.3檢測指標：使用酶標儀檢測兩組瘢痕疙瘩成纖維細胞生長因子450～630nm的吸光度值，吸光度值越高，表明瘢痕成纖維細胞增殖能力越強；并連續(xù)檢測其7d生長曲線，從而明確普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長能力的影響。

2.4統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1瘢痕疙瘩成纖維細胞鑒定結果：利用免疫細胞化學技術，可見瘢痕成纖維細胞表面標記物CD73、CD90及CD105均為陽性，表達率較高，說明細胞具有成纖維細胞特性。結果見圖1。

3.2一般形態(tài)學觀察：實驗組細胞數(shù)目較少，體積較小，排列疏松，呈梭形或長方形，核小，輪廓清晰；對照組細胞數(shù)目較多，體積較大，排列緊密，呈突出的紡錘形或星形扁平細胞，核大，輪廓清晰。

3.3兩組瘢痕成纖維細胞吸光度值檢測結果：實驗組瘢痕成纖維細胞吸光度值明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），觀察組瘢痕成纖維細胞增殖能力較差。見表1。

3.4兩組瘢痕成纖維細胞生長曲線：兩組細胞總體生長趨勢大致相同，第1～2天生長緩慢，第3～4天生長迅速，第5天達到高峰，第6～7天相對平穩(wěn)，形成一個平臺期。實驗組細胞生長能力明顯低于對照組。見圖2。

4討論

瘢痕疙瘩與普通瘢痕不同，常突出于體表，且不穩(wěn)定，不僅影響美觀，甚至局部可出現(xiàn)疼痛、瘙癢等不適癥狀，影響工作和休息，其無法自行消失，長期存在可發(fā)生破潰，嚴重影響患者身心健康。目前國內外學者比較認可的發(fā)病機制是組織細胞的功能異常，即成纖維細胞的過度增殖，成纖維細胞是瘢痕疙瘩發(fā)生的始動細胞，也是形成肉芽組織、合成膠原等細胞外基質、進行傷口重塑的重要細胞，它通過活化、增殖、合成膠原來修復創(chuàng)面，可一旦成纖維細胞的功能發(fā)生異常將導致瘢痕疙瘩的形成。瘢痕疙瘩的治療是臨床上的難題，單一的治療方法效果差，臨床上治療瘢痕疙瘩的方法有手術切除、放療、局部注射藥物、激光治療、壓力療法以及聯(lián)合治療等，國內外學者一致認為聯(lián)合療法的效果較單一療法好。目前瘢痕內注射藥物在治療瘢痕疙瘩中起到了重要作用。因此對于瘢痕疙瘩，早期干預，使瘢痕疙瘩喪失生長的始動力，尤為重要。

普萘洛爾最早應用于整形外科中嬰幼兒血管瘤的治療，其機制可能與抑制血管瘤成纖維細胞生長因子有關，研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾作為常用的β受體拮抗劑，具有抑制膠原蛋白形成、抗纖維化作用，其作用機理是通過競爭性抑制TGF-β、受體，從而抑制了成纖維細胞的生物學活性，減少膠原分泌，達到抗纖維化的效果。

本研究探討了普耐洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞生長，從而抑制瘢痕疙瘩生長，實驗標本來源于本院瘢痕疙瘩患者，并經病理證實，采用中性蛋白酶消化分離瘢痕表皮細胞，避免表皮細胞對實驗結果帶來干擾，進一步傳代培養(yǎng)，將所獲得的種子細胞應用其特異性標志物進行鑒定，從而保證實驗結果的準確性。將含有50ng/L普萘洛爾的培養(yǎng)基作為實驗組，對照組選用單純培養(yǎng)基，通過繪制兩組瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長曲線，并測定第1～7天吸光度值來反應瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長能力，結果發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組瘢痕疙瘩成纖維細胞均呈S形生長，但實驗組細胞生長能力明顯低于對照組，且實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞吸光度值明顯低于對照組，進一步證明，普萘洛爾可在一定程度上抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長，從而抑制瘢痕疙瘩的生長及其纖維化，為臨床上瘢痕疙瘩的預防及治療提供了新方向，但本研究僅僅通過細胞方面的基礎研究提供理論支持，要全面應用于臨床，有待于進一步的臨床實驗研究。

[收稿日期]2017-09-27 [修回日期]2017-11-20

編輯/朱婉蓉