丹參酮II?A磺酸鈉對大鼠油酸致急性肺損傷纖維化的干預(yù)效應(yīng)

劉志平　羅力　李粉英　陳遠(yuǎn)彬　秦少萍　賀明　曾昭智　鄭名華

1廣東藥科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州新海醫(yī)院）（廣州 510300）；2廣東省中醫(yī)院（廣州 510120）；3廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（廣州 510006）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床常見的急重癥，是由多種原因引起的以肺泡毛細(xì)血管膜通透性增高為特征的肺損傷，是臨床重癥監(jiān)護(hù)患者主要的死亡原因，現(xiàn)有研究［1-4］表明炎癥細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子擴(kuò)大和加重了肺損傷中的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞因子構(gòu)成的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)在其中發(fā)揮重要的作用。已有的研究表明，ALI早期即可出現(xiàn)纖維化，而肺纖維化對病情進(jìn)展及預(yù)后有顯著影響。因此，研究ALI中炎癥因子的表達(dá)及相互關(guān)系，對更好地了解ALI纖維化發(fā)生機(jī)制及藥物干預(yù)是非常重要的，并可為其治療和預(yù)防提供新的途徑。目前而言仍沒有一種藥物對此有確切療效，為此本研究嘗試用丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對油酸誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷纖維化進(jìn)行干預(yù)作用，通過檢查與其相關(guān)的白介素1（IL?1）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF?β1），探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉注射液：上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號：1603102；IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1 ELISA檢測試劑盒：上海哈靈生物科技有限公司，批號：201705；油酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2016110142；10%中性福爾馬林：廣州化學(xué)試劑廠，批號：20150303。SD大鼠，雄性，180～220 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2016-0041。實(shí)驗(yàn)期動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2012-1125。

1.2儀器FA2004B電子天平（上海精科天美），HZT?A1000電子天平（廈門華志），RM2235切片機(jī)（德國徠卡），AE2000倒置顯微鏡（廈門麥克奧迪）、HCP246恒溫培養(yǎng)箱（德國Memmert），3K15冷凍離心機(jī)（德國SIGMA），Infinite 200 pro酶標(biāo)儀（瑞士tecan），血?dú)夥治鰞x（美國ABBOTT公司），F(xiàn)orma 902超低溫冰箱（美國Thermo）。

1.3方法1.3.1急性肺損傷大鼠模型建立66只大鼠一次性尾靜脈注射油酸0.13 mL/kg建立急性肺損傷大鼠模型，12 h后經(jīng)尾動脈取血約0.2 mL，用手持式血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治?，以氧合指?shù)PaO2/FiO2≤300為造模成功。

1.3.2分組及給藥取同批正常24只大鼠尾靜脈注射生理鹽水0.13 mL/kg作為正常對照組。選取建模成功的大鼠48只，隨機(jī)分成模型組和丹參酮治療組2組，每組動物24只，正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，丹參酮治療組腹腔注射丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉注射液10 mg/kg，每天1次，連續(xù)14 d。分別于停藥第7天和14天每組隨機(jī)處死12只大鼠進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定。

1.3.3指標(biāo)測定給藥前和停藥第7、14天進(jìn)行大鼠體重測定。大鼠尾動脈采血約0.2 mL，利用血?dú)夥治鰞x檢測大鼠給藥前和停藥第7、14天血液PaO2、PaO2/FiO2值。分別于停藥第7和14天取大鼠全肺稱重，并按如下公式計(jì)算肺指數(shù)：肺指數(shù)=肺重（mg）/體重（g）。取左肺稱重，置烘箱烘60℃烘干72 h，再次稱重，進(jìn)行濕/干質(zhì)量比（W/D）計(jì)算，以此判別大鼠肺部的水腫程度。

1.3.4肺組織形態(tài)學(xué)評價經(jīng)10%福爾馬林固定停藥第7和14天大鼠的右肺上葉，按常規(guī)方法制作石蠟病理切片，染色鏡檢。每組選6張玻片，每張玻片觀察2個視野，按下述標(biāo)準(zhǔn)評定病變程度評分作為肺損傷的組織學(xué)半定量評價指標(biāo)（IQA）。急性肺損傷肺組織學(xué)評分是根據(jù)肺組織充血水腫、紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡腔消失的程度評為0～3分。其中0分為肺組織無充血水腫、無紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔完好；1分為輕度充血水腫、偶見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤，偶見或局限肺泡腔消失；2分為中度充血水腫、紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞部分充盈肺泡、肺泡腔消失＞20%；3分為顯著充血水腫、紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞幾乎充滿肺泡腔、肺泡腔消失大于50%。

1.3.5血清IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1含量測定分別于停藥第7和14天大鼠動脈采血3 mL，1 000 r/min離心10 min離心取血清，ELISA法測定IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1水平，含量測定實(shí)驗(yàn)步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響與模型組比較，正常對照組、丹參酮治療組大鼠在停藥7 d和14 d后其體重差異無顯著性（P＞0.05），見表1，提示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重?zé)o明顯影響。

表1　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響（n=24）Tab.1　The effect of sulfotanshinone sodium on the weight of ALI rats（n=24）±s

表1　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響（n=24）Tab.1　The effect of sulfotanshinone sodium on the weight of ALI rats（n=24）±s

注：△表示n=12，下同

組別正常對照組模型組丹參酮治療組-　-　1 0 205.21±16.39 204.17±9.97 209.48±6.95 262.38±11.68 263.57±13.86 262.20±11.41 291.54±9.86 297.36±17.34 290.74±10.75劑量（mg/kg）給藥前體重（g）停藥7 d體重（g）停藥14 d體重△（g）

2.2丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響模型組和丹參酮治療組大鼠給藥前PaO2、PaO2/FiO2值均顯著低于正常對照組，說明ALI大鼠造模成功，丹參酮治療組停藥7 d和14 d后的PaO2、PaO2/FiO2值與模型組比較差異存在顯著性（P＜0.05），明顯高于模型組大鼠，見表2。

2.3丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數(shù)及濕/干重比的影響與模型組相比，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后其肺指數(shù)及濕/干重比均有不同程度降低，除丹參酮治療組停藥7 d肺指數(shù)外其余指標(biāo)差異存在顯著性（P＜0.05），見表3。

表2　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響（n=24）Tab.2　The effect of sulfotanshinone sodium on the PaO2、PaO2/FiO2of ALI rats blood（n=24）　±s

表2　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響（n=24）Tab.2　The effect of sulfotanshinone sodium on the PaO2、PaO2/FiO2of ALI rats blood（n=24）　±s

注：與模型組相比，*P＜0.05

劑量（mg/kg）組別正常對照組模型組丹參酮治療組--1 0給藥前PaO2（mmHg）76.04±6.37*44.54±3.20 45.50±4.11停藥7 d PaO2（mmHg）79.00±5.79*44.41±4.76 54.50±4.37*停藥14 d PaO2（mmHg）79.17±6.83*44.17±5.31 50.58±5.02*給藥前PaO2/FiO2 358.42±13.79*240.75±14.96 244.04±9.23停藥7 d PaO2/FiO2 353.33±33.89*245.00±18.11 304.83±14.20*停藥14 d PaO2/FiO2 359.75±10.04*240.33±14.46 269.92±13.31*

表3　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數(shù)及濕/干重比的影響（n=12）Tab.3　The effect of sulfotanshinone sodium on the index and wet/dry ratio of ALI rats lung（n=12）　x±s

2.4丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)影響肉眼可見，模型組大鼠肺表面血紅病變區(qū)，肺水腫且體積增大。經(jīng)丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉干預(yù)治療后，肺表面血紅色區(qū)減少，水腫和充血大部分消失，接近正常組。光鏡下正常組肺泡腔完好，肺泡炎細(xì)胞很少，幾乎無肺水腫，支氣管上皮無變形和管周炎，無纖維化。模型組肺泡腔消失，肺泡壁增厚和炎細(xì)胞增多，肺水腫和支氣管上皮變形嚴(yán)重，肺結(jié)構(gòu)破壞和纖維增殖明顯。丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉干預(yù)治療后，肺水腫和支氣管變形等現(xiàn)象明顯減輕或者消失，肺泡炎細(xì)胞和肺間質(zhì)炎細(xì)胞明顯減少，纖維化減輕，見圖1。與模型組相比，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后其肺損傷的組織學(xué)半定量評分（IQA）均有不同程度降低，差異存在顯著性（P＜0.05），見表4。

表4　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺損傷組織學(xué)半定量評分的影響（n=12）Tab.4　The effect of sulfotanshinone sodium on the IQA of ALI rats lung（n=12）　x±s

2.5丹參酮II?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1水平的影響與模型組比較，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后大鼠血液的IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平均明顯降低，差異存在顯著性（P＜0.05），但停藥14 d后血液PCⅢ、TGF?β1水平有一定程度上升，見表5。

3　討論

油酸型ALI模型是急性肺損傷研究中最常使用的模型之一且成模率高特點(diǎn)明顯，本癥是以滲出、炎癥和纖維增殖階段為特點(diǎn)，ALI早期即可出現(xiàn)肺纖維化。

本研究中大鼠注射油酸后出現(xiàn)肺充血水腫，肺泡壁增厚和炎細(xì)胞增多，肺損傷和纖維化增殖明顯，這些變化較好地模擬了臨床上急性肺損傷纖維化的病理變化，另外模型動物的氧合指數(shù)PaO2/FiO2≤300且肺指數(shù)和肺濕干比重明顯高于正常對照組動物，表明動物造模成功，經(jīng)丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉治療后，肺水腫和支氣管變形等現(xiàn)象明顯減輕，炎癥細(xì)胞明顯減少，纖維化癥狀減輕，反映肺損傷病變程度的組織學(xué)半定量評分（IQA）分值降低，同時能提高動物血液中PaO2、PaO2/FiO2指數(shù)，丹參酮治療組大鼠部分指標(biāo)接近正常對照組水平，這提示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對大鼠油酸型ALI模型纖維化有一定治療保護(hù)作用。文獻(xiàn)［5］報(bào)道，丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合吲哚布芬能明顯改善療心源性腦栓塞患者血液流變學(xué)效應(yīng)，丹參酮ⅡA磺酸鈉對小鼠接種人巨細(xì)胞病毒性肝炎有明確的治療作用，機(jī)制與其活血化瘀、降低TGF?β1、抑制小鼠肝微粒體細(xì)胞色素（450）亞型酶酶活性，促進(jìn)肝功能恢復(fù)有關(guān)［6］。

表5　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平的影響Tab.5　The effect of sulfotanshinone sodium on the IL?1、TNF?α、PCⅢ and TGF?β1 of ALI rats blood（n=12）　±s

表5　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平的影響Tab.5　The effect of sulfotanshinone sodium on the IL?1、TNF?α、PCⅢ and TGF?β1 of ALI rats blood（n=12）　±s

注：與模型組相比，*P＜0.05

劑量（mg/kg）組別正常對照組模型組丹參酮治療組-　-　1 0 IL?1（pg/mL）停藥7 d 62.08±15.61*125.42±23.90 89.83±13.23*停藥14 d 62.17±13.73*135.25±23.71 109.91±19.39*TNF?α（pg/mL）停藥7 d 165.01±37.76*414.83±36.21 260.76±24.39*停藥14 d 167.38±34.00*418.29±26.31 332.41±70.84*PCⅢ（ng/mL）停藥7 d 62.33±4.77*75.34±8.80 66.05±6.43*停藥14 d 61.03±5.78*76.01±8.94 74.34±7.93 TGF?β1（ng/mL）停藥7 d 42.95±4.08*59.75±9.68 48.93±5.96*停藥14 d 43.77±3.67*61.73±9.21 59.29±9.18

炎癥反應(yīng)在ALI纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義，TL?1、TNF?α因子介導(dǎo)造成肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致肺纖維化的病理基礎(chǔ)產(chǎn)生（肺毛細(xì)血管通透性增高、滲出大量富含蛋白質(zhì)的肺泡液及透明膜形成等）。作為肺組織羥脯氨酸（HYP）主要的PCⅢ是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原纖維所特有，是組織纖維化的標(biāo)志物，其含量的變化可作為衡量膠原組織代謝的重要指標(biāo)，可判斷纖維化的程度。TGF?β1在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起重要作用的，它對成纖維細(xì)胞具有促進(jìn)有絲分裂和促趨化作用，增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，抑制基質(zhì)降解酶的生成，在正常修復(fù)過程中亞型TGF?β1的分泌是對纖維化強(qiáng)有力的效應(yīng)劑，僅在它持續(xù)或過分表達(dá)時將會導(dǎo)致病理性的纖維增殖［7-9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在油酸誘導(dǎo)的ALI纖維化模型中 IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1大量表達(dá)，這與其他文獻(xiàn)的研究結(jié)果相吻合，經(jīng)丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉治療后其水平顯著降低，其中PCⅢ、TGF?β1因子水平接近正常對照組水平，揭示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI纖維化模型具有治療保護(hù)作用，該治療保護(hù)作用與調(diào)節(jié)上述4個因子水平的表達(dá)有關(guān)，并分別從3個方面進(jìn)行保護(hù)調(diào)節(jié)：（1）直接減少細(xì)胞因子IL?1、TNF?α的產(chǎn)生；（2）通過降低PCⅢ減少細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白沉積，從而達(dá)到防治急性肺損傷纖維化的作用；（3）可能通過抑制TGF?β1的持續(xù)或過分表達(dá)，導(dǎo)致病理性的纖維化減輕。但本研究尚不能說明在ALI模型纖維化發(fā)生發(fā)展中究竟涉及何種調(diào)節(jié)機(jī)制和信號通路，這有待在后期實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究表明丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對大鼠油酸型ALI模型纖維化有一定治療作用，其作用機(jī)制可能與丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉具有調(diào)節(jié)IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1等細(xì)胞因子的表達(dá)水平有關(guān)。但其對因子水平調(diào)節(jié)機(jī)制和對信號通路的影響需做更進(jìn)一步的研究。

［1］朱瑞芳，周敏，何建林，等.姜黃素對大鼠油酸型急性肺損傷的保護(hù)作用［J］.中國中藥雜志，2008，33（17）：2141?2145.

［2］BULMUS F G，GüRSU M F，MUZ M H，et al.Protective effects of alpha?lipoic Acid on oleic Acid?induced acute lung in?jury in rats［J］.Balkan Med J，2013，30（3）：309?314.

［3］INOUE H，NAKAGAWA Y，IKEMURA M，et al.Molecular?biological analysis of acute lung injury（ALI）induced by heat exposure and/or intravenous administration of oleic acid［J］.Leg Med（Tokyo），2012 ，14（6）：304?308.

［4］陸月明.油酸致急性肺損傷動物模型析評［J］.中華急性醫(yī)學(xué)雜志，2005，14（1）：81?83.

［5］鄭雪松，汪蓉，彭吉霞，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合吲哚布芬對心源性腦栓塞血液流變學(xué)的影響［J］.實(shí)用藥物與臨床，2016，19（1）：26?29.

［6］雷尚芳，白娜，鮑升娟，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉治療先天性人巨細(xì)胞病毒性肝炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用藥物與臨床，2016，19（1）：10?13.

［7］ABD?ALLAH S H，SHALABY S M，ABD?ELBARY E，et al.Human peripheral blood CD34+cells attenuate oleic acid?in?duced acute lung injury in rats［J］.Cytotherapy，2015，17（4）：443?453.

［8］SALMAN A E，YETISIR F，KILIC M，et al.The impact of pre?treatment with bolus dose of enteral glutamine on acute lung in?jury induced by oleic acid in rats［J］.J Anesthesia，2014，28（3）：354?362.

［9］HUANG B，WANG D X，DENG W.Protective effects of dexa?methasone on early acute lung injury induced by oleic acid in rats［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7（12）：4698?4709.