Notch1蛋白胞內(nèi)段重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞中的功能驗(yàn)證

趙潤(rùn)然，沈忱悠，嚴(yán)沁，盧春

（南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇南京211166）

作為進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路，Notch通路借助于相鄰細(xì)胞間受體與配體的通訊，參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育等重要的生物學(xué)過(guò)程。Notch受體（Notch1～4）與配體（DLL1／3／4、JAG1／2）結(jié)合后觸發(fā)Notch信號(hào)，γ-分泌酶識(shí)別并切割受體細(xì)胞Notch蛋白，釋放具有活性的胞內(nèi)Notch片段（intracellular Notch，ICN）到胞質(zhì)中。ICN繼而轉(zhuǎn)移入核，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，激活下游Hes、Hey等轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)［1－2］。

大量研究表明，Notch信號(hào)通路失調(diào)在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［3－6］，其中包括卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染導(dǎo)致的卡波氏肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）。KSHV又稱為人皰疹病毒8型，屬于皰疹病毒γ2亞科，由美國(guó)學(xué)者于1994年在AIDS相關(guān)的KS（AIDS-related KS，AIDS-KS）的病損組織中首次鑒定［7］。KSHV感染除了引起KS外，同時(shí)還與原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）以及多中心Castleman病（multicentric Castleman′s disease，MCD）的發(fā)生密切相關(guān)。Notch信號(hào)通路不僅參與KSHV潛伏／裂解的轉(zhuǎn)換，而且在KSHV誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤的形成過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成等發(fā)揮重要作用［8－9］。

本研究構(gòu)建了含Notch1受體胞內(nèi)段基因的ICN重組質(zhì)粒，包裝了表達(dá)ICN的重組慢病毒，以期通過(guò)過(guò)表達(dá)ICN激活Notch信號(hào)通路，從而探索其對(duì)KSHV潛伏感染的PEL細(xì)胞增殖能力的影響。

1　材料與方法

1.1　質(zhì)粒與細(xì)胞

真核表達(dá)質(zhì)粒pIP-Flag-ICN和慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen分別由武漢大學(xué)藍(lán)柯研究員和黃贊教授惠贈(zèng)。慢病毒包裝系統(tǒng)的包膜質(zhì)粒pMD2.G以及包裝質(zhì)粒psPAX2為本實(shí)驗(yàn)室保存。人胚腎上皮293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%滅活胎牛血清（美國(guó) Gibco公司）的 DMEM培養(yǎng)基（美國(guó) Hyclone公司）中；BCP-1細(xì)胞（從PEL中分離的KSHV陽(yáng)性、EB病毒陰性的B淋巴細(xì)胞）培養(yǎng)于含有10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）中。上述培養(yǎng)基中均加入鏈霉素（100μg／mL）和氨芐西林（100 U／mL），細(xì)胞培養(yǎng)于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2　試劑

PCR所用的高保真酶（Fanta酶）為南京諾唯贊科技有限公司產(chǎn)品；PCR引物由南京擎科有限公司合成；T4連接酶（美國(guó)Thermo Scientfic公司）；限制性內(nèi)切酶NheⅠ與Bam HⅠ（日本TaKaRa公司）；質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒（美國(guó)Omega公司）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000（美國(guó) Invitrogen公司）；α-微管蛋白抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG以及抗ICN單克隆抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；抗Flag單克隆抗體和抗Hes-1單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；臺(tái)盼藍(lán)染液為本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.3　方法

1.3.1ICN基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)真核表達(dá)質(zhì)粒p IP-Flag-ICN序列分別設(shè)計(jì)ICN的上下游引物，上游引物引入NheⅠ限制性酶切位點(diǎn)，下游引物引入Bam HⅠ限制性酶切位點(diǎn)。上游引物序列為5′-CTA（下劃線部分為 NheⅠ識(shí)別序列），下游引物序列為5′-（下劃線部分為Bam HⅠ識(shí)別序列）。

1.3.2重組質(zhì)粒pHAGE-ICN的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和Bam HⅠ雙酶切PCR回收產(chǎn)物和慢病毒載體 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen，并運(yùn)用瓊脂糖凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌DH5α。隨機(jī)選取具有氨芐西林抗性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒。雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，同時(shí)進(jìn)行核酸序列測(cè)定并經(jīng)DNAssist比對(duì)，比對(duì)正確后將該質(zhì)粒命名為pHAGE-ICN。

在6孔板中鋪入狀態(tài)良好的293T細(xì)胞過(guò)夜。次日，用LipofectamineTM2000將pHAGE-ICN質(zhì)粒及其對(duì)照pHAGE質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入?yún)R合度達(dá)到70%～80%的293T細(xì)胞中，于轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，取10μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，再根據(jù)蛋白大小將PVDF膜以含目的蛋白（如α-微管蛋白、Flag標(biāo)簽蛋白、內(nèi)源性ICN蛋白以及Notch通路下游Hes-1蛋白）的一抗孵育過(guò)夜。第2天以相應(yīng)的二抗孵育，隨后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3重組慢病毒ICN的包裝與滴度測(cè)定 在直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪入狀態(tài)良好的293T細(xì)胞過(guò)夜。次日，用LipofectmineTM2000將包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G與重組質(zhì)粒pHAGEICN或其對(duì)照pHAGE質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入?yún)R合度達(dá)到70%～80%的293T細(xì)胞中，10 h后更換為完全培養(yǎng)基。于48 h和72 h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液并經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾，將所獲得的重組慢病毒分別命名為L(zhǎng)v-ICN和Lv-Mock。

采用病毒梯度稀釋法稀釋Lv-ICN和Lv-Mock病毒液，并感染293T細(xì)胞。48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)綠色熒光細(xì)胞計(jì)為1個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（transducing units，TU）。病毒滴度計(jì)算公式如下：病毒滴度（TU／mL）＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)／病毒液體積。

1.3.4重組慢病毒介導(dǎo)ICN在BCP-1細(xì)胞中的表達(dá) 取約1×106個(gè)狀態(tài)良好的BCP-1細(xì)胞鋪入6孔板中，以相同感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的Lv-ICN及其對(duì)照Lv-Mock病毒進(jìn)行感染。感染4 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡觀察到 GFP表達(dá)后提取細(xì)胞總蛋白，按方法“1.3.2”中所述步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。

1.3.5細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)ICN過(guò)表達(dá)對(duì)BCP-1細(xì)胞增殖能力的影響 將Lv-ICN及其對(duì)照Lv-Mock感染的BCP-1細(xì)胞鋪入12孔板中（每孔約1×105個(gè)細(xì)胞），每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。分別在鋪板0、1、2、3天后收集細(xì)胞懸液，將0.1%臺(tái)盼藍(lán)染液與細(xì)胞懸液以1∶1進(jìn)行混合，染色3 min后計(jì)數(shù)未著色的活細(xì)胞數(shù)量。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　ICN基因的PCR擴(kuò)增

以真核表達(dá)質(zhì)粒pIP-Flag-ICN為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，在約2 445 bp位置可見與預(yù)期大小一致的目的片段（圖1）。

圖1　PCR擴(kuò)增ICN基因

2.2　重組質(zhì)粒pHAGE-ICN的鑒定

NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pHAGE-ICN，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在7 740 bp和2 445 bp處出現(xiàn)明顯條帶（圖2），分別代表慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen和ICN基因。重組質(zhì)粒序列測(cè)定后經(jīng)DNAssist軟件比對(duì)證實(shí)，插入的ICN基因片段與基因庫(kù)中已登記的序列一致。

圖2　重組質(zhì)粒pHAGE-ICN的雙酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pHAGE-ICN及對(duì)照pHAGE質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pHAGE-ICN后不僅可以檢測(cè)到標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，而且還可以提高內(nèi)源性ICN蛋白以及Notch通路下游重要轉(zhuǎn)錄因子Hes-1蛋白的表達(dá)水平（圖3）。提示重組質(zhì)粒pHAGE-ICN構(gòu)建成功。

圖3　重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3　ICN重組慢病毒的包裝及滴度測(cè)定

包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒與pHAGE-ICN質(zhì)?；蚱鋵?duì)照質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，48 h后可以觀察到超過(guò)90%的細(xì)胞中有GFP表達(dá)（圖4）。

圖4　重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)（×100）

按照不同倍數(shù)稀釋病毒液后感染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，48 h后可以觀察到不同程度的GFP表達(dá)（圖5）。經(jīng)熒光計(jì)數(shù)法測(cè)得含有ICN基因的重組慢病毒的滴度約為2×107TU／mL，對(duì)照慢病毒的滴度約為3×107TU／mL。

圖5　不同稀釋度的ICN重組慢病毒感染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)（×100）

2.4　ICN過(guò)表達(dá)對(duì)BCP-1細(xì)胞增殖的影響

以相同MOI的Lv-ICN及其對(duì)照Lv-Mock感染BCP-1細(xì)胞，觀察到GFP后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果顯示，Lv-ICN感染后可在預(yù)期大小處出現(xiàn)特異性的標(biāo)簽蛋白條帶，同時(shí)內(nèi)源性ICN蛋白以及Notch通路下游Hes-1蛋白的表達(dá)水平明顯提高（圖6A），表明重組慢病毒成功介導(dǎo)ICN蛋白在BCP-1細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，且感染Lv-ICN后有效活化了BCP-1細(xì)胞中的Notch通路。

臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示，從鋪板第3天起，經(jīng)Lv-ICN感染的BCP-1細(xì)胞增殖能力比對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05，圖6B）。提示重組慢病毒介導(dǎo)ICN蛋白的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)BCP-1細(xì)胞的增殖能力。

圖6　重組慢病毒介導(dǎo)的ICN蛋白在BCP-1細(xì)胞中的功能驗(yàn)證

3　討論

病毒感染后能夠依賴細(xì)胞信號(hào)通路在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行感染和復(fù)制，而細(xì)胞信號(hào)通路的改變則是宿主對(duì)病毒感染的反應(yīng)以及病毒修飾感染環(huán)境的綜合結(jié)果。類似地，KSHV可以通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路服務(wù)于自身生命周期以及誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在KS病灶組織及KSHV感染細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的多種組分呈現(xiàn)高水平表達(dá)［10］，其中包括 Notch1、Notch2、Notch3、JAG1等［11］。在 PEL細(xì)胞中，KSHV編碼的潛伏相關(guān)核抗原（latency-associated nuclear antigen，LANA）通過(guò)阻止ICN的泛素化降解，提高ICN在細(xì)胞中的穩(wěn)定性和表達(dá)水平，并增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力［12］。同時(shí)，KSHV感染B細(xì)胞后還可以通過(guò)促進(jìn)ICN的表達(dá)，上調(diào)Cyclin D1從而加速細(xì)胞的增殖［13］。因此，KSHV感染后活化的Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。在PEL細(xì)胞中，使用 γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitor，GSI）抑制Notch信號(hào)通路可以使細(xì)胞維持在G1期并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。更重要的是，GSI處理后可以減緩小鼠體內(nèi) KS腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［14］。提示Notch信號(hào)通路可以作為治療KSHV感染引起的惡性腫瘤的潛在靶點(diǎn)。

目前尚無(wú)針對(duì)Notch信號(hào)通路的特異性激動(dòng)劑。為此，構(gòu)建表達(dá)特定Notch信號(hào)通路組分的表達(dá)載體成為最常用的活化Notch信號(hào)的方式。Notch受體蛋白由胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，其蛋白編碼序列全長(zhǎng)近7.6 kb，一般很難進(jìn)行完整克隆。由于Notch信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能主要通過(guò)ICN［15］，因此對(duì)ICN進(jìn)行選擇性克隆是目前研究Notch信號(hào)通路的主要方法之一。作為一種常用的分子生物學(xué)工具，病毒載體能夠通過(guò)病毒基因組將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞中。目前應(yīng)用較多的是慢病毒載體，該載體具有容納的外源性目的基因片段大、包裝周期短等特點(diǎn)，且外源性基因插入細(xì)胞基因組后能夠穩(wěn)定地持續(xù)地表達(dá)［16］。鑒于ICN片段較長(zhǎng)，且對(duì)病毒感染效率要求較高，本文在構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAGE-ICN的基礎(chǔ)上，選擇通過(guò)慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝了攜帶ICN基因的重組慢病毒，從而達(dá)到激活Notch信號(hào)通路的目的。

以表達(dá)ICN的重組慢病毒感染含有KSHV的PEL細(xì)胞，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡證實(shí)ICN蛋白得到有效過(guò)表達(dá)，并且能夠促進(jìn)Notch信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ICN能顯著增強(qiáng)KSHV潛伏的PEL細(xì)胞的增殖能力。提示本研究構(gòu)建的ICN重組慢病毒可以顯著活化Notch通路信號(hào)，為后續(xù)研究Notch信號(hào)通路在KSHV生命周期和相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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