曲美他嗪預(yù)處理對缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制及機(jī)制研究

熊 果，馬康華

（四川省宜賓市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，宜賓644000）

本文涉及的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)蛋白結(jié)合元件（cAMP-response element binding protein,CREB）是真核細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[1]，受多因素激活，G蛋白-環(huán)化單磷酸腺苷-蛋白激酶A系統(tǒng)（G蛋白-cAMP-PKA）途徑是CREB的經(jīng)典調(diào)節(jié)通路，活化的PKA轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，磷酸化激活CREB；pser133-CREB是CREB的活性形式，p-CREB形成同源二聚體（有活性）或與其他蛋白形成異源二聚體（無活性），再與真核生物啟動子中的CRE結(jié)合，并在其輔因子（CREB結(jié)合蛋白)協(xié)同作用下，通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因（如Bcl-2，Caspase3等）的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡[2-3]。本研究通過構(gòu)建大鼠缺血/再灌注心肌模型，旨在探討曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）抑制缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的效果及其與CREB、p-CREB、Bcl-2及Caspase-3的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量260～300g(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、缺血/再灌注組（I/R組），TMZ預(yù)處理缺血/再灌注組（T+I/R組)，3組各20只。

1.2動物模型構(gòu)建將大鼠固定在手術(shù)臺上，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉（10 mL·kg-1），氣管插管后用小動物專用呼吸機(jī)輔助通氣（頻率80次·min-1；吸呼比 1:1；潮氣量 4~5 mL·kg-1）；然后在其胸骨左緣3、4肋間打開胸腔暴露心臟，在肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約3 mm處用6-0帶針絲線結(jié)扎左前降支（LAD）（墊以3 mm長橡皮筋），待缺血45 min后松開結(jié)扎線，再灌注180 min。建模成功的標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎LAD后缺血區(qū)立即變蒼白，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段出現(xiàn)弓背樣向上抬高，表示心肌缺血；松解LAD后缺血區(qū)由蒼白漸變?yōu)榧t潤，抬高的ST段下降1/2以上，表示再灌注成功，Sham組只穿線不結(jié)扎。

T+I/R組大鼠的曲美他嗪預(yù)處理方法：本組在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建前給予曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1喂養(yǎng)大鼠14 d，然后按上述辦法造模。另外，所有大鼠喂養(yǎng)相同專用飼料，除T+I/R組灌胃曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1外，Sham 組及 I/R 組灌胃等體積的生理鹽水，每天灌胃時(shí)間15:30～16:00。

1.3標(biāo)本采集與制作各組大鼠均在無菌條件下被分離出建模成功的心臟，然后以冰焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水灌洗，并剪去大血管、左右心房及右心室，在結(jié)扎線以下將左心室分離成兩部分：一份用4%多聚甲醛固定24 h，最后在70%乙醇中保存以備石蠟包埋切片；在另一份中取100 mg左右心肌組織，用無菌錫箔紙包裹，經(jīng)液氮冷凍24 h后在-80℃冰箱保存以備檢測逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。

1.4心肌細(xì)胞凋亡的原位末端標(biāo)記分析法（TUNEL） 試劑購于武漢博士德公司。把石蠟包埋的心肌組織切片（2 μm），脫蠟至水，然后用3%雙氧水及甲醇處理，再經(jīng)PBS漂洗3×5 min，加入蛋白酶K工作液常溫20 min，再次PBS漂洗3×5 min后，加入TUNEL反應(yīng)液37℃濕盒避光孵育1 h，又以PBS漂洗3×5 min后，在HRP抗體37℃濕盒中避光孵育30 min后循環(huán)進(jìn)行PBS漂洗3×5 min、DAB顯色 8 min、PBS 漂洗 3×5 min、蘇木素復(fù)染 5~10 s，最后以流水沖洗后脫水，用透明、中性樹膠封片。其中，上述實(shí)驗(yàn)陰性對照用PBS代替HRP抗體。

心肌細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)方法：在缺血再灌注損傷區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)非重疊高倍視野（×400），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=心肌細(xì)胞凋亡數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5p-CREB蛋白表達(dá)的免疫組化分析方法按照SP試劑盒說明書操作（美國ABCAM公司）。抗p-CREB抗體稀釋度為1∶250，以PBS代替一抗作為陰性對照。其中，棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)（p-CREB主要在胞核中表達(dá)）。在重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行圖像分析，用標(biāo)準(zhǔn)灰度校正后，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野，測量平均積分光密度值（IDP），其均值為該標(biāo)本所得值。

1.6Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)的免疫熒光分析方法操作步驟嚴(yán)格按照試劑（Santa Cruz公司）說明書?？笲cl-2及Caspase抗體稀釋濃度均為1∶100，同時(shí)以PBS代替一抗作陰性對照。標(biāo)本中加入綠色熒光二抗（1∶100），經(jīng)37℃孵育后，加胞核染色劑，在激光共聚焦顯微鏡下成像。在北航計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行圖象分析，標(biāo)準(zhǔn)灰度校正后，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野，測量平均積分光密度值(IDP)，其均值為該標(biāo)本所得值。

1.7CREB、Bcl-2、Caspase-3的 mRNA 表達(dá)的 RTPCR分析方法以異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取心肌組織總RNA，并且進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA作為PCR反應(yīng)模板，β-actin為內(nèi)參。引物、目的片段長度及核酸解鏈溫度（Tm）見表1。

表1　RT-PCR引物序列、代碼、堿基大小及退火溫度Tab 1　RT-PCR primer sequences,code,base sizes and annealing temperature

PCR反應(yīng)條件：94℃5 min（預(yù)變性），94℃50 s（變性），退火50 s，72℃ 2 min（延伸），72℃ 5 min（再延伸），總共35個(gè)循環(huán)。取反應(yīng)產(chǎn)物10 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)處理，目的片段與內(nèi)參β-actin吸光度比值為目的片段mRNA的相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)以±s表達(dá)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)Sham組偶見心肌細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)2.20%（2.20±0.15）；I/R組可見大量細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)高達(dá)36.5%（36.5±2.45），與Sham組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；T+I/R組細(xì)胞凋亡指數(shù)16.5%（16.5±1.25），高于Sham組（P<0.01），低于 I/R 組（P<0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1）。

圖1　TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡(×400)Fig 1　Cardiocyte apoptosis detected by TUNEL(×400)

2.2各組心肌 CREB、Bcl-2、Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)CREB蛋白及mRNA在Sham組蛋白有一定量表達(dá)，在I/R組表達(dá)最少，T+I/R組表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p-CREB蛋白及mRNA在Sham組少量表達(dá)，在I/R組表達(dá)適當(dāng)增加，在T+I/R組表達(dá)最多（P＜0.05）。Sham組的Bcl-2在蛋白與基因水平均高表達(dá)，在I/R組呈低表達(dá)，在T+I/R組表達(dá)水平較I/R組顯著增加（P＜0.05），仍明顯少于Sham組（P＜0.05）。Sham組的Caspase-3在基因及蛋白水平少量表達(dá)，在I/R組呈高表達(dá)，在T+I/R組表達(dá)水平較I/R組低，但仍高于Sham組（P<0.05）（圖 2～5，表 2，3）

圖2　各組p-CREB免疫組化表達(dá)的比較(×400)Fig 2 Comparison of the expression of CREB among groups(immunohistochemistory,×400)

圖3　各組Bcl-2免疫熒光表達(dá)的比較(×400)Fig 3 Comparison of the expression of Bcl-2 among groups(immunofluorescence,×400)

圖4　各組Caspase-3免疫熒光表達(dá)的比較(×400)Fig 4 Expression of Caspase-3 among groups(immunofluorescence,×400)

圖5　各組CREB、Bcl-2、Caspase-3的mRNA表達(dá)情況Fig 5 Comparison of the mRNA expression of CREB,Bcl-2 and Caspase-3 among groups(RT-PCR)

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞CREBmRNA、p-CREB蛋白表達(dá)比較(±s，%)Tab 2 Expression of CREBmRNA and p-CREB protein in ratscardiocyte among three groups(±s，%)

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞CREBmRNA、p-CREB蛋白表達(dá)比較(±s，%)Tab 2 Expression of CREBmRNA and p-CREB protein in ratscardiocyte among three groups(±s，%)

vs I/R group，aP<0.05，bP<0.05

組別　n　C R E B（m R N A）　p-C R E B蛋白S h a m　2 0　2 7.5±2.0 a　2 0.8±2.4 a I/R　2 0　2 4.5±1.6　4.1±2.3 I/R+T　2 0　3 0.5±2.5 ab　2 8.6±2.0 ab

表3　各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2及Caspase-3蛋白及mRNA的比較(±s，%)Tab 3 Comparison of the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Caspase-3 in rats cardiocyte among three groups

表3　各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2及Caspase-3蛋白及mRNA的比較(±s，%)Tab 3 Comparison of the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Caspase-3 in rats cardiocyte among three groups

vs I/R group，aP<0.05，bP<0.05

組別　n　B c l-2 S h a m　2 0　6 1.9±2.9 a I/R　2 0　2 1.4±3.2 T+I/R　2 0　4 9.7±3.1 ab C a s p a s e 3 3 8.1±4.5 a 7 2.8±5.7 4 7.2±5.1 ab B c l-2(m R N A)3 7.0±2.0 a 1 1.0±2.0 2 5.0±3.0 ab C a s p a s e-3(m R N A)6.2±0.9 a 2 5.5±4.8 1 4.4±3.6 ab

3　討論

3.1曲美他嗪抗心肌缺血及抑制缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡的效果曲美他嗪是臨床上用于缺血性心肌病的一種改善心肌能量代謝的藥物，主要機(jī)制是通過抑制脂肪酸β氧化，促進(jìn)葡萄糖氧化代謝，提高心肌細(xì)胞產(chǎn)能效率，從而緩解心肌缺血，減少心肌細(xì)胞凋亡[4-6]。在心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制[7]主要包括氧化損傷、影響線粒體功能和能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，而曲美他嗪抗心肌缺血具體環(huán)節(jié)是選擇性的作用于線粒體酶-長鏈3-酮酰輔酶A-硫解酶（3-KAT）、增進(jìn)葡萄糖氧化（低耗氧產(chǎn)能途徑），提高心肌細(xì)胞氧的利用率，從而增加ATP的合成[8]，與此同時(shí)還能顯著減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒、減輕Ca2+超載、減少自由基損害、減少細(xì)胞凋亡以及抑制白介素的抗炎效應(yīng)，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)的短期曲美他嗪預(yù)處理對照發(fā)現(xiàn)，TUNEL法檢測Sham組有少量心肌細(xì)胞凋亡，缺血再灌注組心肌細(xì)胞凋亡明顯，而曲美他嗪預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，但仍顯著高于Sham組，證實(shí)曲美他嗪預(yù)處理能明顯抑制缺血再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡，與Ma等[10]、?Sentürk等[5]、Liu等[11]的動物實(shí)驗(yàn)和McCarthy等[12]、Zhang等[13]報(bào)道的患者臨床研究結(jié)果一致。國內(nèi)僅見個(gè)別曲美他嗪預(yù)處理對大鼠[14-15]、家兔[16]心肌酶學(xué)保護(hù)及提高體內(nèi)自由基清除能力、減輕脂質(zhì)過氧化等機(jī)制從而減輕缺血再灌注損傷的作用報(bào)道，但是還罕見涉及曲美他嗪抗凋亡的問題。

3.2曲美他嗪抑制缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制盡管已經(jīng)有不少研究明確了曲美他嗪預(yù)處理具有抑制缺血再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡作用，但曲美他嗪抗凋亡的確切機(jī)制目前仍未完全釋清，CREB和p-CREB是否參與曲美他嗪對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，目前少見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sham組CREB及p-CREB均有一定量表達(dá)，I/R組CREB表達(dá)減少，p-CREB表達(dá)明顯減少，而曲美他嗪組CREB及p-CREB表達(dá)則明顯增加，提示曲美他嗪預(yù)處理上調(diào)了CREB和p-CREB表達(dá)水平，這可能是其減少心肌細(xì)胞凋亡的主要作用機(jī)制之一。因?yàn)榛A(chǔ)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p-CREB與真核生物啟動子中的CRE結(jié)合后在其輔因子（CREB結(jié)合蛋白)協(xié)同作用下，能夠調(diào)控凋亡相關(guān)基因（如Bcl-2，Caspase-3等）的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用；而本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究看到了曲美他嗪預(yù)處理組下游環(huán)節(jié)發(fā)生了Bcl-2上調(diào)（產(chǎn)生抗凋亡作用）、Caspase-3（具有致凋亡作用）下調(diào)的相應(yīng)效應(yīng)改變，再加上上述曲美他嗪預(yù)處理組心肌凋亡明顯減少的直接結(jié)果，初步說明了曲美他嗪對CREB和p-CREB表達(dá)水平的影響就是其抗凋亡機(jī)制或者環(huán)節(jié)的假設(shè)；而I/R組心肌細(xì)胞CREB表達(dá)減少可能與該區(qū)域心肌細(xì)胞壞死或凋亡增加有關(guān)，這一組缺乏曲美他嗪預(yù)處理保護(hù)的結(jié)果就是上述結(jié)論的強(qiáng)有力的陰性對照說明。

上述機(jī)制可用基礎(chǔ)研究結(jié)果解釋：組織缺血再灌注后氧化應(yīng)激增加主要?dú)w因于線粒體功能的損害[17]，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，而死亡的主要形式有腫脹壞死、壞死性凋亡、細(xì)胞凋亡和自噬；關(guān)于凋亡，線粒體功能受損時(shí)，線粒體膜腫脹，膜通透性增高，使線粒體內(nèi)促凋亡分子如抑制細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）等釋放，啟動細(xì)胞凋亡機(jī)制[17]。細(xì)胞凋亡過程受多種基因的調(diào)控，其中最重要的是Bcl-2與Caspase-3。Bcl-2也可通過干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞凋亡[18]，Bcl-2基因家族是目前公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因[19]，Bcl-2基因產(chǎn)物主要位于線粒體膜、核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，Bcl-2基因可抑制許多因素引起的細(xì)胞凋亡，成為抗凋亡主要蛋白[19]。這與本實(shí)驗(yàn)Sham組細(xì)胞凋亡最少，但是Bcl-2表達(dá)最高；缺血再灌注組細(xì)胞凋亡最多，但是Bcl-2呈低水平表達(dá)；而曲美他嗪預(yù)處理組Bcl-2表達(dá)雖低于Sham組，但明顯高于缺血再灌注組的結(jié)果完全契合，這是曲美他嗪預(yù)處理減少凋亡的機(jī)制環(huán)節(jié)之二，也與Cook等[20]報(bào)道相似。另外，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，一旦被激活便激發(fā)下游的級聯(lián)反應(yīng)，啟動細(xì)胞凋亡[21]。本研究異曲同工地發(fā)現(xiàn)曲美他嗪預(yù)處理能顯著下調(diào)Caspase-3的蛋白及基因表達(dá)水平，從而使心肌細(xì)胞凋亡顯著減少，強(qiáng)烈提示曲美他嗪抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制之三是抑制Caspase-3活化，下調(diào)Caspase-3表達(dá)。

3.3本實(shí)驗(yàn)的不足及臨床應(yīng)用建議本研究僅僅是一個(gè)橫斷面的初步、短期預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)研究，其價(jià)值具有初步闡明曲美他嗪預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷之心肌凋亡有抑制作用及其具有分子水平的可能機(jī)制的意義，但是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)樣本量偏小，尚需大樣本的動物實(shí)驗(yàn)及基礎(chǔ)、臨床研究，進(jìn)一步研究他們之間是否確切存在上下游調(diào)控關(guān)系，以及相關(guān)的具體信號通路之間是如何更加細(xì)致地實(shí)現(xiàn)調(diào)控的；今后還需要中長期的研究、隨訪進(jìn)一步證明該作用是否具有持久性。臨床上可以觀察冠心病患者分成常規(guī)治療組及加用曲美他嗪治療組發(fā)生急性心肌梗死后相同處理方法的不同心肌存活、臨床轉(zhuǎn)歸差異來加以詮釋。

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