炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的Siglec-G分子對(duì)DAMPs和PAMPs的識(shí)別及調(diào)節(jié)作用

樊亞童，鄭鑒，肖俊，張學(xué)軍

（天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070）

免疫系統(tǒng)對(duì)“自我”和“非我”識(shí)別及其相關(guān)分子機(jī)制是當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。免疫細(xì)胞表面存在豐富的糖鏈結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與病原體表面的糖鏈結(jié)構(gòu)存在較大差異。巨噬細(xì)胞中唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素（Siglecs）是識(shí)別細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的重要受體，具有參與“自我”和“非我”識(shí)別和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等多方面的作用。Siglec-G是Siglecs家族重要成員之一，通過(guò)識(shí)別含有唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞間相互作用，此外還可以識(shí)別內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)和病原微生物，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1-2]。DAMPs是組織或細(xì)胞受到損傷和低氧等因素刺激后釋放到細(xì)胞間或血液循環(huán)中的一類(lèi)物質(zhì)[3]；PAMPs則是病原體上的分子結(jié)構(gòu)[4]。二者均被模式識(shí)別受體（PRR）識(shí)別引起免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞參與免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等多種免疫反應(yīng)過(guò)程，然而Siglec-G在巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其與免疫識(shí)別和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)性尚有待進(jìn)一步證明。本研究通過(guò)提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用HMGB1（具有代表性的DAMPs）與LPS（具有代表性的PAMPs）在體外刺激，探討在DAMPs和PAMPs存在下，巨噬細(xì)胞中Siglec-G的表達(dá)情況及其對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象C57BL/6野生型小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，Siglec-G基因敲除小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院曹雪濤教授惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)小鼠均在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育，所有的程序按照天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的操作規(guī)范流程進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用健康雄鼠，8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g。

1.1.2主要試劑和儀器巰基乙醇酸鹽購(gòu)自美國(guó)BD公司，小鼠HMGB1蛋白（Fc標(biāo)簽）購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司，LPS購(gòu)自Sigma公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promage公司,Real time PCR Master Mix（SYBR Green）購(gòu)自 Roche公司，TNF alpha Mouse ELI SA Kit和IL-6 Mouse ELISA Kit購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，Real-timePCR儀（LightCycler?96）購(gòu)自Roche公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取和純化選取8周以上雄鼠，腹腔注射2 mL巰基乙醇酸鹽48 h后，處死小鼠，以無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液灌洗小鼠腹腔數(shù)次，收集得到的細(xì)胞懸液離心5 min（2 000 r/min），棄上清，收集細(xì)胞，1×PBS洗1遍，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h后分離培養(yǎng)，用1×PBS沿培養(yǎng)板內(nèi)壁沖洗細(xì)胞3至4遍，貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后可做實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與刺激方案 （1）提取野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以適當(dāng)細(xì)胞密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，棄掉細(xì)胞上清，用無(wú)FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6至8 h后，棄去上清，換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)在培養(yǎng)液中加 10 μg/mL 的 HMGB1 刺激不同時(shí)間（0、3、6、12、18 h和24 h）后提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)Siglec-G的基因表達(dá)；（2）提取野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，其余操作方法同上，最后用不同濃度的HMGB1（1、5和10 μg/mL）刺激24 h后提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)Siglec-G的基因表達(dá)；（3）提取野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，操作方法同上，用100 ng/mL的LPS刺激不同時(shí)間（0、3、6、12、18 h和 24 h）后提取細(xì)胞 RNA，檢測(cè)Siglec-G的基因表達(dá)；（4）提取野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，操作方法同上，最后用不同濃度LPS（10、100和1 000 ng/mL）刺激24 h后提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)Siglec-G的基因表達(dá)；（5）提取野生型和Siglec-G-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以適當(dāng)細(xì)胞密度接種于48孔板中，操作方法同上，最后用 HMGB1（10 μg/mL）和LPS（100 ng/mL）刺激24 h后收集細(xì)胞上清，檢測(cè)TNF-α和IL-6分泌情況。

1.2.3RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Real-time PCR用Trizol裂解細(xì)胞，振蕩并室溫靜置3 min后12 000×g離心15 min，吸取上層無(wú)色透明溶液并加入500 μL異丙醇混勻，室溫靜置 10 min后，12 000×g離心20 min，去掉上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀兩遍，離心后棄上清，所得沉淀即為RNA，加入DEPC水溶解RNA，于56℃水浴10 min后放在冰上即可。用DEPC水適當(dāng)稀釋RNA后，測(cè)定OD值，計(jì)算RNA純度及產(chǎn)量。根據(jù)Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time PCR采用 Roche的SYBR green染料說(shuō)明指導(dǎo)，用LightCycler?96儀器檢測(cè)基因表達(dá)情況。Siglec-G正向：5′-TGGTCATCGTGAAGACCCTC-3′，反向：5′-TGAGCTCCTAGAAGGGGCAT-3′；β-actin 正向：5′-AGAAGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，反向：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α和IL-6分泌情況按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前一晚包被捕獲抗體，轉(zhuǎn)天晨洗板3次，加入200 μL封閉液，室溫封閉1 h后洗板1次，加入100 μL待檢測(cè)細(xì)胞上清原液，室溫孵育2 h后洗板3次，加入100 μL檢測(cè)抗體，室溫孵育1 h后洗板5次，加入100 μL HRP，室溫避光孵育 30 min，洗板 5至 7次后加入顯色液，最后加入終止液在酶標(biāo)儀上檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DAMPs和PAMPs作用巨噬細(xì)胞后Siglec-G的基因表達(dá)情況應(yīng)用HMGB1在不同時(shí)間點(diǎn)刺激野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)Siglec-G的基因表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖1，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Siglec-G的表達(dá)逐漸升高，尤其在第18 h和 24 h，其表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.001，P<0.01，圖1A）。應(yīng)用不同濃度的HMGB1刺激巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的增加，Siglec-G的表達(dá)量也明顯增高（P<0.001，圖1B）。而用LPS在不同時(shí)間點(diǎn)刺激巨噬細(xì)胞后，Siglec-G的表達(dá)沒(méi)有明顯升高（圖1C）。同樣地，用不同濃度的LPS刺激巨噬細(xì)胞，Siglec-G的表達(dá)也沒(méi)有升高（圖1D）。以上結(jié)果表明DAMPs能夠影響巨噬細(xì)胞中Siglec-G的表達(dá)，而PAMPs對(duì)Siglec-G的表達(dá)無(wú)明顯影響，說(shuō)明Siglec-G可以特異識(shí)別DAMPs并具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。

栽培要點(diǎn)：河北北部、內(nèi)蒙古全部在4月底5月初播種。播種前18～20天將種薯提前出窖以10cm厚度平鋪于暖室，18℃催芽12天，待芽基催至0.5～0.7cm時(shí)轉(zhuǎn)到室外曬種8天。切塊重30g左右，每個(gè)切塊確保1～2芽。切刀用0.4%高錳酸鉀溶液消毒，防止病害傳播。每畝種植3500～4000株。結(jié)合播種每畝施優(yōu)質(zhì)農(nóng)家肥3000kg，混施馬鈴薯專(zhuān)用肥50kg；苗高20cm時(shí)中耕一次，現(xiàn)蕾前結(jié)合中耕培土一次，主要防治馬鈴薯早疫病和晚疫病。在現(xiàn)蕾期開(kāi)始用藥，可以選擇50%烯酰嗎啉可濕性粉劑等藥劑交替使用，生育期共用藥3～5次。

圖1　巨噬細(xì)胞中Siglec-G的基因表達(dá)Fig 1　The expression of Siglec-G mRNA in macrophages

2.2DAMPs和PAMPs作用不同基因型小鼠巨噬細(xì)胞后TNF-α和IL-6的分泌情況為了觀察Siglec-G表達(dá)對(duì)DAMPs和PAMPs作用后巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的影響，我們分別用HMGB1和LPS刺激野生型和Siglec-G-/-小鼠的巨噬細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子的分泌情況。結(jié)果見(jiàn)圖2，LPS刺激兩種基因型小鼠的巨噬細(xì)胞其分泌TNF-α沒(méi)有明顯變化（圖2A），而HMGB1刺激后，Siglec-G敲除的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α明顯多于野生型小鼠的巨噬細(xì)胞（P<0.001，圖2B）。同樣地，LPS刺激兩種基因背景的巨噬細(xì)胞后，IL-6的分泌沒(méi)有變化（圖2C），HMGB1刺激后，Siglec-G敲除的巨噬細(xì)胞分泌IL-6明顯增多（P<0.01，圖2D）。以上結(jié)果表明，Siglec-G特異性抑制DAMPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，而對(duì)于PAMPs引起的炎癥反應(yīng)沒(méi)有影響，說(shuō)明在巨噬細(xì)胞中Siglec-G是通過(guò)識(shí)別DAMPs來(lái)發(fā)揮免疫抑制功能。

圖2　巨噬細(xì)胞上清中炎癥因子的分泌情況Fig 2 The secretion of inflammatory cytokines in the supernatant of macrophages

3　討論

DAMPs和PAMPs作為特殊的抗原形式，參與宿主免疫細(xì)胞的免疫識(shí)別，是激活和啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的必要條件。HMGB1被認(rèn)為是一種細(xì)胞核內(nèi)固有免疫危險(xiǎn)信號(hào)，也是DAPMs的重要成員之一[5]，它能夠與特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子[6]。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，它屬于PAMPs，TLR4識(shí)別LPS后可直接激活NF-κB信號(hào)通路引發(fā)炎癥反應(yīng)[7-8]。目前看來(lái)，DAMPs和PAMPs在固有免疫應(yīng)答中的研究，尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)的研究越來(lái)越多[1,9-10]，而在巨噬細(xì)胞中的研究還比較少。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1刺激巨噬細(xì)胞后Siglec-G的表達(dá)明顯升高，而LPS刺激后其表達(dá)沒(méi)有變化，該結(jié)果提示Siglec-G特異性識(shí)別DAMPs模式分子，而對(duì)PAMPs模式分子沒(méi)有識(shí)別能力。

Siglecs作為一種免疫識(shí)別受體，它通過(guò)與細(xì)胞表面的多聚糖結(jié)合調(diào)控天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其抗病原體的功能[11]。Siglecs主要包括兩類(lèi):一類(lèi)是序列保守的Siglecs，包括唾液酸黏附素、CD22和Siglec-15等；另一類(lèi)是與CD33相關(guān)的序列可變的Siglecs，包括CD33，Siglec-E和Siglec-G等[11]。在這兩類(lèi)型中，大多數(shù)成員的胞內(nèi)段含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIMs），從而可以發(fā)揮免疫抑制功能[12-14]。Siglec-G作為CD33家族的一員，在免疫識(shí)別和免疫調(diào)控中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[15-16]。目前關(guān)于Siglec-G的研究主要聚焦在樹(shù)突狀細(xì)胞[1,17]，B細(xì)胞[18]和 T 細(xì)胞[19]。為了探討 Siglec-G 表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性的影響，我們利用Siglec-G敲除小鼠，DAMPs和PAMPs兩種模式分子分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，觀察Siglec-G分子對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的調(diào)節(jié)作用。筆者發(fā)現(xiàn)HMGB1作用于Siglec-G敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞后，TNF-α和IL-6等炎性因子的分泌水平明顯升高，但LPS刺激后，其表達(dá)在兩種基因背景的巨噬細(xì)胞中沒(méi)有差異，提示巨噬細(xì)胞可能是通過(guò)表達(dá)Siglec-G來(lái)識(shí)別胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)分子并發(fā)揮免疫抑制作用，而對(duì)病原相關(guān)蛋白分子，Siglec-G缺乏識(shí)別及調(diào)控作用。

鑒于巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性及其功能相關(guān)性，Siglec-G在不同免疫器官中巨噬細(xì)胞及其亞型的表達(dá)，Siglec-G是通過(guò)何種途徑來(lái)發(fā)揮免疫抑制功能和具體的作用機(jī)制如何尚有待深入研究。

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