油菜主花序角果密度及其相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

任義英，崔翠，王倩，唐章林，徐新福，林吶，殷家明，李加納，周清元

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

0　引言

【研究意義】油菜是世界上主要的油料作物，在中國(guó)是繼水稻、小麥、玉米、大豆之后的第五大作物，也是中國(guó)食用植物油和動(dòng)物飼料的重要來(lái)源[1-2]。角果是主要的光合器官，具有“庫(kù)”和“源”的雙重作用[3-4]。適宜的角果密度可以提高光能利用率，增加籽粒數(shù)量，從而提高油菜產(chǎn)量[5-6]。主花序角果數(shù)和主花序長(zhǎng)是主花序角果密度的組成型性狀，分別反應(yīng)了主花序角果的分布情況和植株的松散程度，對(duì)油菜產(chǎn)量有直接或間接的影響。因此，鑒定和定位控制主花序角果密度及其相關(guān)性狀的 QTL，對(duì)挖掘高產(chǎn)基因和培育高產(chǎn)品種具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】角果密度、主花序角果數(shù)和主花序長(zhǎng)的廣義遺傳率都較高，遺傳比較穩(wěn)定，受環(huán)境因素的影響較小[7-9]。余鳳群等[10]發(fā)現(xiàn)角果密度和主花序長(zhǎng)都受多基因控制，且控制角果密度的基因存在互補(bǔ)作用，控制主花序長(zhǎng)性狀的基因存在重疊作用。也有研究表明，主花序有效長(zhǎng)、主花序角果數(shù)和角果密度受顯性效應(yīng)、顯性與環(huán)境互作效應(yīng)以及上位性效應(yīng)的影響，其中主花序有效長(zhǎng)和主花序角果數(shù)也受加性效應(yīng)控制[12-14]。隨著QTL定位方法和分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，推動(dòng)了甘藍(lán)型油菜角果相關(guān)性狀QTL的研究進(jìn)展。CHEN等[15]檢測(cè)到15個(gè)與主花序角果密度有關(guān)的QTL，單個(gè)位點(diǎn)的表型貢獻(xiàn)率在 2.79%—7.59%，其中 A06、C05、C06和C08上的4個(gè)QTL在2個(gè)群體之間共有；發(fā)現(xiàn)13個(gè)與主花序長(zhǎng)度有關(guān)的QTL，單個(gè)位點(diǎn)的QTL貢獻(xiàn)率在2.58%—9.22%，在2個(gè)群體中檢測(cè)到7個(gè)重疊的QTL。高必軍[16]在第12連鎖群上檢測(cè)到1個(gè)與主花序角果密度相關(guān)的QTL，解釋17.3%的表型變異；5個(gè)與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的QTL，依次位于第6、12、13連鎖群，單個(gè)位點(diǎn)可解釋性狀表型變異的11.25%—25%；15個(gè)控制主花序長(zhǎng)的QTL，分別位于第1、2、6和17連鎖群，每個(gè)QTL分別解釋7.4%—26.6%的表型變異。陰濤[17]檢測(cè)到位于A02染色體上的2個(gè)與主花序角果密度相關(guān)的QTL，單個(gè)位點(diǎn)分別解釋5.25%和8.07%的表型變異；在A02染色體上發(fā)現(xiàn)1個(gè)與主花序長(zhǎng)相關(guān)的QTL，可解釋6.25%的表型變異。目前，油菜角果密度及其相關(guān)性狀的QTL研究還停留在初步定位階段，后續(xù)研究報(bào)道較少。近年來(lái)，隨著一些植物全基因組測(cè)序的完成，分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，關(guān)聯(lián)分析己成為植物數(shù)量性狀基因研究的熱點(diǎn)之一。關(guān)聯(lián)分析又叫連鎖不平衡作圖（linkage disequilibrium mapping，LD mapping），是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，根據(jù)特定的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)鑒定某一自然群體內(nèi)目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記（或候選基因）關(guān)系的定位方法，可以直接鑒定出控制目標(biāo)性狀的功能基因或基因內(nèi)的功能多態(tài)性[18]。關(guān)聯(lián)分析以自然群體為研究對(duì)象，無(wú)需構(gòu)建專(zhuān)門(mén)的分離群體，用時(shí)少，可以節(jié)約成本；可以檢測(cè)群體內(nèi)與目標(biāo)性狀相關(guān)一個(gè)基因座位上的多個(gè)等位基因，檢測(cè)量大；自然群體積累的重組信息大，分辨率高，能夠精細(xì)定位目標(biāo)性狀，精確到單基因水平[19-20]。隨著甘藍(lán)型油菜全基因組序列的公布[21]及蕓薹屬 60 K SNP（single nucleotide polymorphism）芯片的開(kāi)發(fā)，關(guān)聯(lián)分析在甘藍(lán)型油菜中的運(yùn)用也取得了較大的成果，并鑒定出一些與重要農(nóng)藝、品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)[21-25]。【本研究切入點(diǎn)】盡管已有油菜角果密度及其相關(guān)性狀的QTL的研究報(bào)道，但多數(shù)為初步定位階段，未能進(jìn)一步定位和預(yù)測(cè)候選基因?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用不同遺傳背景和地理來(lái)源的213份甘藍(lán)型油菜構(gòu)建自然群體，結(jié)合SNP芯片數(shù)據(jù)及重慶北碚2年的表型數(shù)據(jù)，擬對(duì)主花序角果密度、主花序有效長(zhǎng)和主花序有效角果數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)與性狀相關(guān)的重要候選基因，為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇等方式提高油菜產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　植物材料

213份關(guān)聯(lián)分析材料為具有不同遺傳背景和廣泛地理來(lái)源的常規(guī)品種、品系（電子附表 1），由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心收集并提供。

1.2　田間試驗(yàn)和性狀調(diào)查

將213份材料分別在2014年和2015年10月種植于重慶市油菜工程技術(shù)研究中心歇馬實(shí)驗(yàn)基地，11月份田間移栽，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每種材料種植 3行，每行10株，行距40 cm，株距20 cm，重復(fù)2次。待油菜成熟時(shí)，選取10株長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的單株，測(cè)定各單株的主花序有效長(zhǎng)（valid length on racemes，VLR）和主花序有效角果數(shù)（valid silique on racemes，VSR），并計(jì)算主花序角果密度（silique density on racemes，SDR）。主花序角果密度為主花序有效角果數(shù)/主花序有效長(zhǎng)，以“個(gè)/cm”為單位；主花序有效長(zhǎng)為從主花序底端第一個(gè)有效角果（有效角果，即角果中有飽滿的種子）著生部位到頂端最后一個(gè)有效角果著生部位長(zhǎng)度，以“厘米（cm）”為單位；主花序有效角果數(shù)為主花序上著生的有效角果數(shù)，以“個(gè)”為單位。表型數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行初步整理，取2個(gè)重復(fù)的平均值，計(jì)算每個(gè)性狀的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；采用 DPS7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和性狀間的Spearman相關(guān)性分析。

1.3　基因型測(cè)定與分析

利用油菜60 K Illumina Infinium SNP芯片對(duì)213份材料進(jìn)行基因型分析，該芯片包括覆蓋甘藍(lán)型油菜全基因組的52 157個(gè)SNP標(biāo)記。采用 Genome Studio（Illumina公司）軟件對(duì)213份油菜種質(zhì)進(jìn)行SNP基因型的檢測(cè)，挑選出雜合率（heterozygosity，H）、缺失率（miss rate，M）小于 20%，同時(shí)最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于10%[26]，且均勻分布于染色體上的23 767個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于后續(xù)全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.4　群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

利用 Structure 2.3.4軟件對(duì)該群體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[27]，設(shè)置亞群數(shù)目K為1—10，5次模擬運(yùn)算，模擬參數(shù)迭代（length of burn-in period）和蒙特卡羅迭代（markov chain monte carlo，MCMC）都設(shè)置為1×105次循環(huán)，在混合模型和頻率相關(guān)模型下運(yùn)算。輸出的后驗(yàn)概率值結(jié)果輸入STRUCTURE HARVESTER（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/），計(jì)算2個(gè)連續(xù)的后驗(yàn)概率值的變化速率（Δk）和每個(gè)材料分別來(lái)自1—10亞群的Q值，以Q值0.8為分界線，最終確定群體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)[28]。

利用 Tassel 5.1.0軟件對(duì)自然群體進(jìn)行親緣關(guān)系（relative kinship）評(píng)估，計(jì)算親緣關(guān)系K矩陣[29]。親緣關(guān)系代表兩特定材料之間的遺傳相似度與任意材料之間遺傳相似度的相對(duì)值，因此當(dāng)材料之間的親緣關(guān)系值為負(fù)值時(shí)，直接將其定義為0[20]。

1.5　連鎖不平衡分析

利用Tassel 5.1.0分析連鎖不平衡（LD）在甘藍(lán)型油菜各染色體上的分布，繪制各染色體的LD衰減圖[31]，LD類(lèi)型參數(shù)設(shè)置為 Full Matrix，以決定系數(shù)（coefficient of determination）r2=0.2為衰減閾值，計(jì)算顯著關(guān)聯(lián)SNP所在染色體的LD衰減距離，用于候選基因預(yù)測(cè)和功能注釋分析。

1.6　最優(yōu)模型的選擇和全基因組關(guān)聯(lián)分析

將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入Tassel5.1.0后進(jìn)行主成分分析（PCA矩陣），再將Q和K矩陣導(dǎo)入Tassel5.1.0，以Q、K和PCA矩陣作協(xié)變量，采用基于一般線性模塊（general linear model，GLM）的GLM、Q和PCA模型和混合線性模塊（mixed linear model，MLM）的K、Q+K和PCA+K共6種模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。以ggplot2[30]繪制Quantile-Quantile散點(diǎn)圖（QQ plot）表示不同模型的檢測(cè)效力，以實(shí)際P值與期望P值最接近的模型為每個(gè)性狀GWAS分析的最佳模型。最后基于最優(yōu)統(tǒng)計(jì)模型，對(duì)群體內(nèi)主花序角果密度及其相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)檢測(cè)。用P值來(lái)衡量關(guān)聯(lián)標(biāo)記的顯著性，顯著關(guān)聯(lián)SNP閾值設(shè)為1/23767=4.21×10-5。利用qqman[31]繪制Manhattan圖顯示關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到的與目標(biāo)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)。

1.7　候選基因分析

在關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，用與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP所在染色體上r2=0.2時(shí)的衰減距離為候選基因的LD區(qū)間。根據(jù)這個(gè)區(qū)間在油菜基因組中的位置，以已公布的甘藍(lán)型油菜“Darmor-Bzh”的基因組注釋信息（http://www.Genoscope.cns.fr/brassicanapus）分析區(qū)間內(nèi)的基因，并與擬南芥的基因序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)，以同源性最高的擬南芥基因注釋候選基因功能，篩選可能控制目標(biāo)性狀的候選基因。

2　結(jié)果

2.1　表型統(tǒng)計(jì)分析

連續(xù)2年（2015年和2016年）分別對(duì)213份油菜種質(zhì)的主花序角果密度、主花序有效長(zhǎng)和主花序有效角果數(shù)的表型進(jìn)行考察和統(tǒng)計(jì)分析（表1、圖1），結(jié)果表明，3個(gè)性狀在2年內(nèi)品種間差異均達(dá)到極顯著水平，變異系數(shù)介于15.38%—26.42%，變幅較大。正態(tài)檢驗(yàn)（表1）和頻數(shù)分布圖（圖1）也表明，目標(biāo)性狀2年Shapiro-Wilk檢驗(yàn)的W值均在0.991—0.996，且 P＞0.05，符合正態(tài)分布；兩年 3個(gè)性狀都呈連續(xù)性分布，符合典型的數(shù)量性狀特點(diǎn)，適合進(jìn)行GWAS分析。3個(gè)性狀的廣義遺傳率分別為68.06%、67.47%和69.05%，也表明其主要受遺傳因素影響。

表1　甘藍(lán)型油菜主花序角果密度、主花序有效長(zhǎng)和主花序有效角果數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析Table 1　Statistical analysis of SDR, VLR and VSR in B. napus

2.2　油菜主花序角果密度及其相關(guān)性狀的相關(guān)性分析

2015年，主花序角果密度與主花序有效長(zhǎng)、主花序有效角果分別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著負(fù)相關(guān)和顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.265和 0.144；2016年，主花序角果密度與主花序有效長(zhǎng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的有極顯著負(fù)相關(guān)。兩年主花序角果密度與主花序有效長(zhǎng)呈極顯著負(fù)相關(guān)，意味著主花序增長(zhǎng)，但沒(méi)有相應(yīng)地增加有效角果數(shù)，因此，研究主花序角果密度對(duì)增加主花序有效角果數(shù)，提高油菜產(chǎn)量有重要意義。

2.3　群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

選擇8 923個(gè)在染色體上均勻分布且最小等位基因頻率大于0.3的SNP標(biāo)記，利用軟件Structure2.3.4對(duì)每個(gè)可能的K值模擬運(yùn)算，輸出結(jié)果分析后驗(yàn)概率LnP(D)值得到方差以及變化速率，當(dāng)K=2時(shí)，模型中顯示△K有最大變化（圖2-A）。213份甘藍(lán)型油菜分為P1和P2 2個(gè)亞群，P1亞群包含50份材料（23.5%），絕大多數(shù)源自于國(guó)內(nèi)的湖北省、春性油菜和少量的半冬性材料及國(guó)外引進(jìn)的材料；P2亞群包含163份材料（76.5%），主要是中國(guó)的半冬性油菜品系（電子附表1）?；跀?shù)學(xué)模型對(duì)群體的類(lèi)群劃分，基本與油菜的地理栽培屬性一致。親緣關(guān)系分析顯示群體中約89.74%的材料之間的親緣關(guān)系值小于0.2（圖2-B），其中約有59.91%材料的親緣關(guān)系值為0，約12.01%材料的親緣關(guān)系值介于0—0.05。說(shuō)明整個(gè)自然群體材料之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果影響較小。

圖1　自然群體主花序角果密度、主花序有效長(zhǎng)和主花序有效角果數(shù)的頻次分布Fig. 1　Frequency distribution of SDR, VLR and VSR from the natural population

表2　主花序角果密度及其相關(guān)性狀表型間的相關(guān)性Table 2　Correlation of phenotype among SDR and its component traits in two years

圖2　213份甘藍(lán)型油菜的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析Fig. 2　Analysis of population structure and relative kinship in 213 B. napus

2.4　連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減

對(duì)A基因組的10條染色體（A01—A10）和C基因組的9條染色體（C01—C09）分別繪制帶平滑線的LD衰減散點(diǎn)圖（圖3）。由圖3可以看出A和C基因組的 r2隨著遺傳距離的增加而下降，衰減距離也各不同。在r2的閾值為0.2標(biāo)準(zhǔn)下（表3），A基因組的平均衰減距離為450 kb，其中A08染色體的衰減速度最慢，衰減距離最大，約為1 350 kb；A02和A04染色體衰減速度最快，衰減距離約為200 kb。C基因組的平均衰減距離為950 kb，其中C02的衰減距離最大，約為1 400 kb；C07染色體的衰減距離最小，約為500 kb。A基因組的衰減距離整體比C基因組的衰減距離小得多。這可能與中國(guó)半冬性甘藍(lán)型油菜A基因組在育種中發(fā)生大規(guī)模重組，打破連鎖不平衡有關(guān)。

表3　連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減距離Table 3　The Linkage disequilibrium attenuation decline in A and C genome

此外，A和C基因組中有些染色體在進(jìn)入衰減距離后仍存在不同程度和數(shù)量的波峰（圖 3）。A基因組中的A06染色體在1 800 kb左右有明顯的峰，A01、A04、A05、A08和A10染色體在1 400—1 900 kb范圍內(nèi)均出現(xiàn)了明顯且數(shù)量不同的峰。C基因組C07染色體在1 800和3 300 kb左右出現(xiàn)了明顯的峰，除C04、C05和C09染色體外的其他染色體也在不同的遺傳距離上出現(xiàn)了不同程度和數(shù)量的波峰。表明A和C基因組中同一條染色體上即使是距離較遠(yuǎn)的2個(gè)標(biāo)記之間，也可能存在一定的連鎖不平衡。

2.5　油菜主花序角果密度相關(guān)性狀的6種模型比較

從圖4可以看出，可能由于群體較小以及目標(biāo)基因座與群體結(jié)構(gòu)高度相關(guān)，除了2016年的主花序角果密度外，其他性狀的K、K+Q和K+PCA模型都表現(xiàn)出一定的假陰性。在 2015年的主花序角果密度（圖4-A）和2016年的主花序有效長(zhǎng)（圖4-D）檢測(cè)到Q模型有效地控制了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；2015年的主花序有效長(zhǎng)（圖4-C）以PCA為最佳模型；2015和2016年的主花序有效角果數(shù)（圖4-E和圖4-F），MLM模型下的K、K+Q和K+PCA模型雖然表現(xiàn)為假陰性，但它們的P值較Q和GLM模型更接近期望值，因此，選用K+Q作為主花序有效角果數(shù)的最優(yōu)模型；2016年的主花序角果密度（圖4-B）MLM模型下的K+Q和K+PCA模型均能較好地控制假陽(yáng)性，但K+Q模型檢測(cè)到P值更接近期望值。

圖3　連鎖不平衡在A、C基因組不同染色體的衰減Fig. 3　The linkage disequilibrium decline in different chromosomes for A and C genome

2.6　全基因組關(guān)聯(lián)分析

GWAS分析2年數(shù)據(jù)共檢測(cè)到17個(gè)SNP位點(diǎn)與主花序角果密度及其相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)（表4和圖5）。與主花序角果密度關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)有7個(gè)，其中2015年環(huán)境中，僅在 A03染色體上檢測(cè)出Bn-A03-p15240794與主花序角果密度關(guān)聯(lián)（圖5-A），P值為1.03×10-5，可解釋11.76%的表型變異；在2016年環(huán)境中，檢測(cè)到6個(gè)與主花序角果密度性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)（圖5-B），分布于染色體A01、A03、A04、A10和C01上，可解釋11.34%—15.96%的表型變異。與主花序有效長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)共有9個(gè)，其中2015年環(huán)境中，在C03和C09染色體上各檢測(cè)出1個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)（圖5-C），可分別解釋10.67%和9.67%的表型變異；在2016年環(huán)境中，檢測(cè)到7個(gè)與主花序有效長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)（圖5-D），除C05染色體上檢測(cè)到1個(gè)位點(diǎn)，其他6個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)都在C09染色體的6.5—6.8 M區(qū)域被檢測(cè)到，平均相距約50 kb，表型貢獻(xiàn)率在10%—13.10%；僅在2016年環(huán)境中，檢測(cè)到1個(gè)在A01染色體上與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)（圖5-F ）。

2.7　候選基因預(yù)測(cè)

基于甘藍(lán)型油菜參考基因組序列，對(duì) LD區(qū)間的候選基因進(jìn)行分析，篩選出了22個(gè)與主花序角果密度及其相關(guān)性狀有關(guān)的候選基因（表 5）。通過(guò)掃描與主花序角果密度顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的LD區(qū)域，共篩選到12個(gè)重要候選基因；在與主花序有效長(zhǎng)關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的LD區(qū)域內(nèi)掃描到8個(gè)可能候選基因；在主花序有效角果數(shù)相關(guān) LD區(qū)間篩選出 2個(gè)候選基因。其中，BnaA01g16940D、BnaC01g38800D和 BnaA04g09170D等主要通過(guò)調(diào)控赤霉素和生長(zhǎng)素等內(nèi)源激素的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)控制主花序角果密度及其相關(guān)性狀，BnaA01g16970D、BnaA03g29180D、BnaA03g29810D、BnaC01g39680D和BnaC03g32770D通過(guò)對(duì)分生組織或花分生組織的調(diào)控來(lái)改變性狀表型，BnaC09g18690D和BnaC09g09210D等主要通過(guò)控制細(xì)胞分裂生長(zhǎng)等過(guò)程改變性狀形態(tài)；而B(niǎo)naA01g22310D在擬南芥中的同源基因 AT1G60420編碼 NRX1，具有典型的硫氧還蛋白（TRX）活性位點(diǎn)（WCG/PPC），在植物體內(nèi)以二聚體的形式被發(fā)現(xiàn)，nrx1突變體表現(xiàn)花粉生育力減弱，導(dǎo)致最終角果數(shù)目顯著減少[32-33]?？傊@些基因主要與赤霉素和生長(zhǎng)素等內(nèi)源激素的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分生組織或花分生組織以及細(xì)胞分裂生長(zhǎng)等過(guò)程有關(guān)，它們可能通過(guò)上述功能影響油菜花序或角果的發(fā)育，導(dǎo)致主花序角果密度及其相關(guān)性狀的表型變異。

圖4　6種統(tǒng)計(jì)模型對(duì)主花序角果密度及其相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的QQ圖Fig. 4　Quantile-quantile plots of estimated -Iog10(p) from association analysis using six models in SDR and its component traits

3　討論

角果密度是油菜理想株型的重要因素之一，其構(gòu)成性狀（主花序長(zhǎng)度和主花序有效角果數(shù)）是影響單株產(chǎn)量的重要因素，主要受多基因控制，遺傳率高[5-10]。本研究利用60 K SNP芯片對(duì)213份油菜的主花序角果密度及其相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析，兩年的主花序角果密度及其相關(guān)性狀的標(biāo)記并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)重復(fù)，且標(biāo)記數(shù)目也相差較大，這可能是兩年環(huán)境差異較大引起的。本研究對(duì)主花序角果密度關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，兩年都在A03染色體上檢測(cè)出顯著關(guān)聯(lián)的SNP，且標(biāo)記之間相距4.4 Mb，說(shuō)明在A03染色體上有控制主花序角果密度的主效基因；CHEN等[15]也在 A03染色體上檢測(cè)到與主花序角果密度關(guān)聯(lián)的 QTL。本研究?jī)赡暝?C09染色體上檢測(cè)到與主花序有效長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)成簇分布，與段秀建[60]在 C09上發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)相距約4.4 Mb，這表明在C09染色體上有控制主花序有效長(zhǎng)的主效QTL。孫美玉[61]在兩年三環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到A01染色體上與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的QTL，與該性狀連鎖的3個(gè)標(biāo)記（GSSR134、BrSF162-9和BrSF49-32）距離較近，僅相距1 Mb左右，與本研究

發(fā)現(xiàn)的 Bn-Scaffold000582-p3247位點(diǎn)也是相距約 1 Mb，認(rèn)為在 A01染色體的該區(qū)段內(nèi)存在控制主花序有效角果數(shù)的主效QTL。

表4　兩年主花序角果密度及其相關(guān)性狀的顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記Table 4　Significance association markers of SDR and its component traits in two years

表5　主花序角果密度及其相關(guān)性狀的候選基因Table 5　A summary of candidate genes associated with SDR and its component traits

圖5　2年主花序角果密度及其相關(guān)性狀的Manhattan圖Fig. 5　Manhattan plot of SDR and its component trait in two year

通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，掃描與性狀顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的 LD區(qū)域，借助擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選到了22個(gè)與性狀相關(guān)的候選基因，其中包含多個(gè)位于關(guān)聯(lián) SNP位點(diǎn)處或在位點(diǎn)附近的基因。這些基因部分與赤霉素和生長(zhǎng)素等內(nèi)源激素的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分生組織或花分生組織以及細(xì)胞分裂生長(zhǎng)等過(guò)程有關(guān)。如BnaA01g16940D與擬南芥AT4G28160同源，在花序中表達(dá)，編碼的富含脯氨酸糖蛋白家族蛋白是細(xì)胞壁的組成成分，參與對(duì)赤霉素刺激的反應(yīng)，誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)和花發(fā)育，通過(guò)調(diào)控最終角果數(shù)目和花序長(zhǎng)影響角果密度[33-34]；C01染色體的BnaC01g39480D與擬南芥的AT3G08510（ATPLC2）同源，編碼磷酸肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解成肌醇 1,4,5-三磷酸和二酰基甘油，參與生長(zhǎng)素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是雌配子發(fā)生和胚胎發(fā)育所必需的，雜合子plc2-2突變體有角果數(shù)較少和胚胎在球狀期前停滯與細(xì)胞分裂異常的表型[49-50]；BnaA01g16970D與擬南芥ULT1同源，編碼 B-box 結(jié)構(gòu)域富含 Cys（半胱氨酸）蛋白，是分生組織細(xì)胞積累在花序和花分生組織的負(fù)調(diào)節(jié)器；ult1突變體使花序分生組織擴(kuò)大，產(chǎn)生額外的花和花器官，并在花分生組織中表達(dá)降低[35-36]；A03染色體的BnaA03g29810D，在擬南芥中的同源基因AT3G07050編碼類(lèi)核干細(xì)胞因子1（nucleostemin- like 1，NSN1），于花序分生組織和花原基中高水平表達(dá)，是維持花序分生組織和花器官發(fā)育所必需的；NSN1雜合和純合植株通過(guò)形成花冠花而終止花序發(fā)育，過(guò)表達(dá)導(dǎo)致頂端優(yōu)勢(shì)喪失和缺陷花的形成[42-43]。雖然，基因與環(huán)境互作導(dǎo)致環(huán)境特異關(guān)聯(lián)SNP很難通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇促進(jìn)其他地區(qū)油菜增產(chǎn)，但通過(guò)基因工程手段對(duì)部分高產(chǎn)基因進(jìn)行操作很可能實(shí)現(xiàn)其他地區(qū)油菜產(chǎn)量的提升，對(duì)中國(guó)油菜生產(chǎn)和發(fā)展具有重要意義。

4　結(jié)論

共檢測(cè)到17個(gè)SNP與主花序角果密度及其相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)，其中與主花序角果密度關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有 7個(gè)，與主花序有效長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有9個(gè)，與主花序有效角果數(shù)相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記僅有1個(gè)，這些SNP均為環(huán)境特異位點(diǎn)，表明其受基因與環(huán)境互作影響。LD區(qū)間內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的合成和轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物細(xì)胞組織發(fā)生、花分生組織發(fā)育、角果數(shù)目和多器官發(fā)育基因BnaA01g16940D、BnaA03g29810D、BnaC01g39480D、BnaA01g16970D和 BnaC09g09210D等 22個(gè)候選基因，可能通過(guò)上述功能影響油菜花序或角果的發(fā)育，導(dǎo)致主花序角果密度及其相關(guān)性狀的差異。

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