以亞甲基藍(lán)為雜交指示劑的電化學(xué)適配體鼠傷寒沙門氏菌傳感技術(shù)

徐連應(yīng)，彭海霞，邵玉宇，王畢妮，張富新

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

0　引言

【研究意義】長久以來，沙門氏菌一直是食品加工貯藏中污染最為嚴(yán)重的致病菌之一[1]。消費(fèi)者食用了被沙門氏菌污染的食物后會出現(xiàn)腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡[2]，這對人體健康造成了極大的威脅，而鼠傷寒沙門氏菌在沙門氏菌感染中常居首位。因此，如何實(shí)現(xiàn)對鼠傷寒沙門氏菌的快速靈敏檢測一直是食品安全領(lǐng)域的熱門研究方向?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】最傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測法為平板計(jì)數(shù)法（SPC），但由于其耗時(shí)過長且準(zhǔn)確度低，故實(shí)用性較差。近年來建立的酶聯(lián)免疫法（ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）以及膠體金免疫層析法（GICA）在食源性致病菌的檢測上實(shí)現(xiàn)了重大突破，但仍存在部分缺陷。ELISA法通常要對抗原或抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，存在成本較高、耗時(shí)較長且表征復(fù)雜等弊端；PCR法通過對細(xì)菌特定序列進(jìn)行指數(shù)倍的擴(kuò)增使其變得易于檢測，然而這種技術(shù)常會出現(xiàn)錯(cuò)檢和漏檢的問題[3]；GICA法依靠固相載體纖維的毛細(xì)管作用，使待測物沿膜表面前移與檢測區(qū)膠體金標(biāo)記物結(jié)合顯色，它先將抗體固定在硝酸纖維素（NC）膜上，膜上有控制線和顯示結(jié)果的測試線，當(dāng)樣品中抗原與抗體特異性結(jié)合，著色物膠體金使該區(qū)域顯色，通過對比測試線與控制線顏色實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速檢測。該方法憑借其操作簡便、檢測迅速、肉眼直觀可見等優(yōu)勢在食源性致病菌檢測中也較為常用，但由于細(xì)菌的體積較大，會受到 NC膜的孔徑限制，使得免疫層析法的檢測靈敏度較差，另外細(xì)菌易團(tuán)聚，使得紙層析受阻，從而影響試紙條的靈敏度[4-5]。電化學(xué)傳感器可以監(jiān)測反應(yīng)體系中由組分變化而導(dǎo)致的電信號變化來完成檢測，它具有高度的檢測靈敏性與特異性，并且操作便捷、成本較低[6]。在各類電化學(xué)傳感器中，電化學(xué)生物傳感器有著不可替代的優(yōu)勢，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用最廣的為酶傳感器、適體傳感器與免疫傳感器3大類[7]。核酸適配體通常是一段由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選獲得的長度為15—40個(gè)堿基長的DNA或RNA寡核苷酸片段[8]。這些核酸序列類似抗體，可以緊密且特異地與目標(biāo)分子結(jié)合，但又具備抗體所不具有的易于修飾、合成迅速、穩(wěn)定、成本低廉等優(yōu)勢。由于適配體的空間三維構(gòu)象易折疊形成一些如螺旋、發(fā)卡、莖環(huán)、凸環(huán)、三葉草和假結(jié)等穩(wěn)定的三環(huán)空間結(jié)構(gòu)，使其能夠依靠范德華力、氫鍵和疏水作用等方式與目標(biāo)物緊密結(jié)合，并可以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)[9-10]。此外，適配體的靶標(biāo)分子種類豐富，既可以捕獲包括蛋白質(zhì)、小分子、離子、核酸等多種靶目標(biāo)，也可以與完整的細(xì)胞結(jié)合[11-12]。因此，適配體傳感器非常適宜用于食品加工貯藏中致病菌的檢測。亞甲基藍(lán)（MB）作為一種電活性有機(jī)染料，其能夠嵌入核酸雙鏈中。近年來，亞甲基藍(lán)作為一種無標(biāo)的電化學(xué)指示劑被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)適配體傳感器中[13-14]。還原氧化石墨烯（rGO）是對石墨烯進(jìn)行一系列氧化還原反應(yīng)后，制得的可用于提高電子傳輸?shù)男滦图{米材料[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組在以往的研究中，曾成功構(gòu)建出一種基于復(fù)合納米材料和酶切信號放大的沙門氏菌適配體傳感器，最低檢測限為200 cfu/mL[16]，其檢測性能仍有待提升。目前國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)用電化學(xué)適配體傳感器檢測食源性致病菌的文獻(xiàn)已不罕見，且多數(shù)研究取得了令人滿意的成果，但成功用于鼠傷寒沙門氏菌定量檢測的電化學(xué)適配體傳感器的報(bào)道非常少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以MB為電化學(xué)活性物質(zhì)，利用Apt與鼠傷寒沙門氏菌的高特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)MB的定量脫落，同時(shí)引入rGO和AuNPs兩種納米材料以及 Exo I協(xié)助電信號的放大，通過監(jiān)測電極表面的電信號變化情況來完成鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，為食品工業(yè)中鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速定量檢測提供一種高效便捷、靈敏準(zhǔn)確的新型檢測方法。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2016年9月至2017年3月在陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1　菌株和DNA序列

鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115、大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、福氏志賀氏菌CMCC 51572、單核增生李斯特菌ATCC 19115、副溶血性弧菌ATCC 17802均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鼠傷寒沙門氏菌適配體：

（Apt，5′-GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAA CATCCTTGGCGGTGC-3′）；

鼠傷寒沙門氏菌適配體互補(bǔ)鏈：

（S，5′-HS-(CH)6-ATCATTGCACCGCCAAGTAT GTTCCCACCTTGTATTCATTAACTC-3′）。

上述 DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　儀器和試劑

本研究全部電化學(xué)試驗(yàn)操作均于 CHI660C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）上進(jìn)行。試驗(yàn)均為三電極系統(tǒng)，其中工作電極：裸玻碳電極（GCE）或修飾后的玻碳電極；對電極：鉑絲；參比電極：銀/氯化銀（飽和氯化鉀）電極。KQ-100V型超聲波清洗器（上海京工實(shí)業(yè)有限公司），HJ-1型磁力攪拌器（江蘇省金壇市精達(dá)儀器制造廠），漩渦振蕩器（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），離心機(jī)（HERMLE），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（賽福實(shí)驗(yàn)儀器公司），真空干燥箱（南京蘇恩瑞干燥設(shè)備有限公司）。

核酸外切酶I（Exo I），紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；氯金酸（HAuCl4）、亞甲基藍(lán)（MB）、6-巰基-1-己醇（97%，MCH），美國 Sigma Aldrich公司；鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2P04）、氯化鉀（KCl）、檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H20）、濃硫酸（98% H2SO4）、無水乙醇（C2H6O）等，西安三浦化學(xué)試劑有限公司；石墨烯（Gra），南京吉倉納米科技有限公司；其余所用試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3　溶液的配制

鼠傷寒沙門氏菌適配體、鼠傷寒沙門氏菌適配體互補(bǔ)鏈均于12 000 r/min下離心30—60 s后加入無菌水稀釋到 2 μmmol·L-1，震蕩均勻后于-20℃凍藏。

核酸外切酶I反應(yīng)緩沖液：將隨酶提供的10×外切酶 I反應(yīng)緩沖液用無菌水稀釋到 1×核酸外切酶 I反應(yīng)緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

各濃度菌液均以 0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液（pH 7.0）配制，4℃保存。

亞甲基藍(lán)以0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液（pH 7.0）配制成 120 μmmol·L-1的溶液，4℃保存。

巰基乙醇以去離子水稀釋為2 mmol·L-1的溶液，4℃保存。

1.4　樣品處理

參照GB4789.17—2003《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 肉與肉制品檢驗(yàn)》對豬肉樣品進(jìn)行處理。新鮮豬肉首先進(jìn)行表面消毒處理（沸水燙3—5 s），然后于超凈臺中以無菌剪刀取深層肌肉20 g，剪碎，置于無菌研缽中搗碎，加入無菌水180 mL混勻后制得1∶10樣品稀釋液。在豬肉樣品稀釋液中加入不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌，混勻，于4℃保存。

1.5　金納米粒子的制備

根據(jù)Turkevich-Frens法[17-18]，以檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備。

1.6　氧化石墨烯的制備

采用傳統(tǒng)的Hummers方法[19-20]。

1.7　電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)建

整個(gè)構(gòu)建過程如圖1所示。

首先進(jìn)行還原氧化石墨烯-納米金粒子復(fù)合電極的制備，取制得的氧化石墨烯1 mg溶于1 mL PBS溶液中，500 W下超聲30 min混勻后用移液器滴加10 μL于打磨好的玻碳電極表面，室溫下風(fēng)干。為了得到還原氧化石墨烯，將電極于PBS溶液中進(jìn)行電化學(xué)還原。工作參數(shù)如下：循環(huán)伏安法（CV），工作電壓為-0.2—0.6 V，掃速為100 mV·s-1，圈數(shù)為100圈。然后將電極于 1%的氯金酸中進(jìn)行恒電位沉積，以將納米金修飾于電極表面。工作參數(shù)如下：計(jì)時(shí)電流法（CA），工作電壓為-200 mV，工作時(shí)間為20 s。將電極晾干，不用時(shí)置于4℃ PBS緩沖液中保存。

圖1　電化學(xué)適配體傳感器檢測沙門氏菌原理圖Fig. 1　Principle of the electrochemical aptasensor of detection of Salmonella typhimurium

在完成還原氧化石墨烯-納米金粒子復(fù)合電極的制備后，將 10 μL 2 μmol·L-1的互補(bǔ)鏈（S）均勻滴在復(fù)合電極上，室溫下完成孵育，以PBS緩沖液沖洗，再將10 μL 2 mmol·L-1的巰基己醇均勻滴在電極表面反應(yīng) 1 h 完成電極的封閉[21]。然后將 10 μL 2 μmol·L-1的適體鏈（Apt）均勻滴在電極表面，一段時(shí)間后用PBS緩沖液沖洗。隨后將電極浸入含不同濃度鼠傷寒沙門氏菌和一定濃度核酸外切酶I（Exo I）中37℃下孵育30 min后，用PBS緩沖液沖洗。最后將修飾好的電極浸入120 μmol·L-1亞甲基藍(lán)（MB）溶液中1 h，充分反應(yīng)后用PBS緩沖液反復(fù)沖洗。通過循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗法（EIS）記錄復(fù)合電極上 MB的電化學(xué)信號，以實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測。

1.8　電化學(xué)測試方法

循環(huán)伏安（CV）、差分脈沖伏安（DPV）和電化學(xué)阻抗（EIS）檢測均為三電極系統(tǒng)，裸玻碳電極（GCE）或修飾后的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極。具體檢測環(huán)境與參數(shù)參照徐連應(yīng)等[16]的研究。

2　結(jié)果

2.1　還原氧化石墨烯-納米金粒子復(fù)合電極的電化學(xué)表征

以循環(huán)伏安法（CV）來驗(yàn)證復(fù)合電極制備構(gòu)程中的每一步修飾情況，如圖 2-A所示。檢測環(huán)境為K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液，當(dāng)電極電勢在-0.2—0.6 V反復(fù)掃描時(shí)，[Fe(CN)6]3-被還原為[Fe(CN)6]4-，[Fe(CN)6]4-被氧化為[Fe(CN)6]3-，致使電極表面氧化還原反應(yīng)得以不間斷進(jìn)行，產(chǎn)生一組相互對稱的氧化還原峰，如裸玻碳電極曲線a所示。當(dāng)在裸玻碳電極上修飾了一層氧化石墨烯后，由于帶負(fù)電性的含氧官能團(tuán)的引入，使電極表面的電活性位點(diǎn)被大量占據(jù)，不利于電子的傳遞[22]，導(dǎo)致峰電流顯著降低，如曲線 b所示。將氧化石墨烯用電化學(xué)還原的方法去掉含氧官能團(tuán)后，導(dǎo)電性能得到部分恢復(fù)，峰電流升高，如曲線c所示，生成的還原氧化石墨烯與石墨烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似。最后用電沉積法在電極表面修飾一層納米金，峰電流大幅度升高，如曲線d所示，這是因?yàn)榧{米金具有良好的電催化活性，且表面帶有大量的負(fù)電荷，電子密度極高。同時(shí)采用電化學(xué)阻抗法（EIS）進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，如圖2-B所示，曲線的半圓直徑越大，電阻越大，通過觀察圓弧半徑的大小即可得出電阻的變化。通過觀察可知，EIS法所得結(jié)果與CV法保持一致，說明復(fù)合電極制備的每一步均得到了準(zhǔn)確的修飾。

圖2　在鐵氰化鉀溶液中電極的表征圖CV（A）和EIS（B）Fig. 2　CV(A) and EIS(B) at different electrodes in Fe(CN)63-/4-

圖3　在鐵氰化鉀溶液中傳感器的表征圖EIS（A）和CV（B）Fig. 3　EIS and CV of aptasensor at different conditions in Fe(CN)63-/4-

2.2　適配體傳感器的電化學(xué)表征

采用電化學(xué)阻抗法（EIS）對本研究所構(gòu)建的適配體傳感器進(jìn)行檢測。[Fe(CN)6]3-/4-耦合作為氧化還原探針，電荷轉(zhuǎn)移所受到的阻力（Ret）由阻抗圖譜來判斷，半圓直徑越大，電阻越大。如圖3-A所示，曲線a還原氧化石墨烯-納米金復(fù)合電極在初始狀態(tài)下的半圓很小，因?yàn)榇藭r(shí)電子可以自由移動。當(dāng)互補(bǔ)鏈自組裝到復(fù)合電極表面后，DNA鏈上顯負(fù)電性的磷酸鹽骨架對電子在電極和[Fe(CN)6]3-/4-緩沖液中的轉(zhuǎn)移起到阻礙作用，導(dǎo)致Ret增大（曲線b）。當(dāng)?shù)渭舆m配體后，其與其互補(bǔ)鏈雜交成雙鏈 DNA結(jié)構(gòu)，復(fù)合電極上負(fù)電荷的增加會導(dǎo)致 Ret再次增加（曲線 c）。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌被檢測到后，由于鼠傷寒沙門氏菌與適配體的高度特異性結(jié)合將適配體帶離復(fù)合電極表面，此時(shí)電極上負(fù)電荷減少，對電子移動的空間阻力Ret減小（曲線d），同時(shí)，Exo I將適配體不斷剪切從而釋放鼠傷寒沙門氏菌循環(huán)作用，帶離電極上更多的適配體。加入甲苯胺藍(lán)（MB）后，由于 MB是一種電化學(xué)活性物質(zhì)，可以促進(jìn)電子的傳遞，故半圓直徑明顯減?。ㄇ€e）。同時(shí)用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3-B所示，由圖可知CV法與EIS法所得結(jié)論保持一致，說明該傳感器已成功構(gòu)建。

2.3　Exo I對傳感器的信號放大效能

在本研究中，Exo I能作用于鼠傷寒沙門氏菌適配體，使其沿著3′到5′的方向水解為單個(gè)核苷酸，導(dǎo)致與適配體緊密結(jié)合的鼠傷寒沙門氏菌被釋放后循環(huán)作用于電極，帶離更多的適配體，從而實(shí)現(xiàn)響應(yīng)信號的放大。為了驗(yàn)證Exo I的效能，在還原氧化石墨烯-納米金復(fù)合電極上修飾鼠傷寒沙門氏菌互補(bǔ)鏈與適配體后，直接浸入亞甲基藍(lán)（MB）溶液中，用差分脈沖伏安法（DPV）來記錄響應(yīng)值，如圖4曲線a所示。隨后再取兩根經(jīng)上述步驟處理后的電極，一根浸入2×107cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液中，另外一根浸入2×107cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液與0.8 U·mL-1的Exo I的混合液中，用DPV法記錄下響應(yīng)值。如圖4中曲線b與曲線c可知，加入Exo I與未加Exo I相比，加入Exo I后DPV響應(yīng)值明顯降低，說明Exo I的加入使本研究所構(gòu)建的傳感器在鼠傷寒沙門氏菌檢測上的靈敏度得到了大幅提升。

圖4　不同狀態(tài)下電極對亞甲基藍(lán)的差分脈沖伏安響應(yīng)Fig. 4　DPV signals of MB for different conditions of electrode in PBS

2.4　條件優(yōu)化

圖5-A可以得出電化學(xué)信號與鼠傷寒沙門氏菌孵育時(shí)間的關(guān)系，可知電化學(xué)信號隨著孵育時(shí)間的增加不斷減小，但當(dāng)孵育時(shí)間超過40 min后，電化學(xué)信號的變化趨于平穩(wěn)，說明40 min足夠讓鼠傷寒沙門氏菌將適配體帶離，因此40 min即為最優(yōu)孵育時(shí)間。由圖5-B可知在Exo I濃度達(dá)到0.8 U·μL-1時(shí)，電信號下降到最低，因此選擇0.8 U·μL-1作為最適酶濃度。

圖5　試驗(yàn)條件的優(yōu)化：（A）孵育時(shí)間（B）Exo I濃度Fig. 5　The optimization of experimental conditions: (A) incubation time (B) Exo I concentration

2.5　傳感器檢測分析性能的考察

當(dāng)傳感器電極在不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌菌液中孵育40 min后，所得到的差分脈沖伏安（DPV）曲線圖如圖6-A所示。當(dāng)菌液濃度增大，峰電流隨之逐漸減小，并且在菌液濃度為 2×102—2×107cfu/mL，傳感器DPV曲線的峰電流值與菌液濃度的對數(shù)保持良好的線性關(guān)系，線性方程為 I（μA）=-30.422x+302.49（R2=0.9975），檢測限為 67 cfu/mL（S/N=3）（圖6-B）。

圖6　不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌（0—2×107 cfu/mL）下的DPV曲線（A）及DPV峰電流值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的校正曲線（B）Fig. 6　The DPV curves obtained when detecting Salmonella typhimurium in different concentrations(0—2×107 cfu/mL) and the calibration curve

為了驗(yàn)證該傳感器的特異性，在相同的條件下對另外5種細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌以及副溶血弧菌）進(jìn)行了檢測。由圖7可知，5種非目標(biāo)菌的電化學(xué)響應(yīng)信號接近于空白信號，且明顯高于鼠傷寒沙門氏菌的電化學(xué)響應(yīng)信號，表明所構(gòu)建的傳感器特異性良好。

圖7　不同細(xì)菌的電化學(xué)信號柱狀圖Fig. 7　Comparison of DPV peak currents after reaction with different target bacteria

本研究以相同的方法制備同批次的 7根工作電極，進(jìn)行了一組平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證該傳感器的重復(fù)性。將工作電極在2×102cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液中孵育40 min，隨后測量各峰電流值，得RSD為4.0%（n=7），證明所構(gòu)建的傳感器重復(fù)性良好。

2.6　實(shí)際樣本測定和加標(biāo)回收試驗(yàn)

以1.4中預(yù)處理的含不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的豬肉樣品作為待檢測的實(shí)際樣本，利用本研究構(gòu)建的傳感器進(jìn)行檢測，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法作對比，求回收率。由表1可知本方法回收率為97.3%—106.7%，與平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果高度吻合。證明所構(gòu)建的傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌準(zhǔn)確性高，可以應(yīng)用于實(shí)際樣本的檢測。

3　討論

近年來，納米材料在傳感器構(gòu)建中起到了關(guān)鍵性作用。LABIB等[23]于2012年成功構(gòu)建首個(gè)可以用于特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌活菌的核酸適體阻抗傳感器。該傳感器直接將鼠傷寒沙門氏菌DNA適體鏈固定到納米金修飾絲網(wǎng)印刷電極上，鼠傷寒沙門氏菌在適體鏈上結(jié)合量的對數(shù)與電極阻抗呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由此可以實(shí)現(xiàn)定量檢測。該傳感器的最低檢測限為600 cfu/mL，在食品檢測領(lǐng)域其性能仍需進(jìn)一步提升。MA等[24]于2014年將滴涂在玻碳電極上的氧化石墨烯（GO）進(jìn)行電化學(xué)還原，于電極上修飾了一層石墨烯納米片，構(gòu)建了基于復(fù)合納米材料的沙門氏菌適體傳感器。石墨烯納米材料的引入大大增強(qiáng)了電極對于捕獲探針沙門氏菌適配體鏈的固定作用，同時(shí)也增強(qiáng)了電子在電極處的轉(zhuǎn)移能力。該傳感器的最低檢測限可以達(dá)到3 cfu/mL，但檢測時(shí)間需要 90 min，且檢測范圍較窄，最高僅為 2.4×103cfu/mL。

表1　豬肉樣品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測回收率Table 1　The recovery of Salmonella typhimurium detection in pork

為了進(jìn)一步優(yōu)化傳感器的性能，本研究在應(yīng)用還原氧化石墨烯和納米金兩種納米材料的同時(shí)，引入了核酸外切酶I與電化學(xué)指示劑亞甲基藍(lán)。在裸玻碳電極（GCE）上修飾還原氧化石墨烯（rGO）和納米金（AuNPs）后，將巰基化的鼠傷寒沙門氏菌適配體互補(bǔ)鏈及適配體先后固定在rGO-AuNPs復(fù)合電極上，隨后復(fù)合電極被置于滴加了核酸外切酶I的鼠傷寒沙門氏菌菌液中孵育，并于孵育完成后加入電化學(xué)指示劑亞甲基藍(lán)，最后通過監(jiān)測電極表面的電信號變化完成對鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測。作為一種吩噻嗪類有機(jī)染料，亞甲基藍(lán)在電化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域經(jīng)常被用作雜交反應(yīng)指示劑[25-26]。亞甲基藍(lán)與DNA的作用包括插入作用與靜電作用模式，可以插入雙鏈DNA中[27-29]。在本研究中，鼠傷寒沙門氏菌帶離電極表面的鼠傷寒沙門氏菌適配體鏈，導(dǎo)致電極上雙鏈DNA結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湥赏ㄟ^監(jiān)測嵌入雙鏈的 MB電化學(xué)信號的強(qiáng)弱來測定鼠傷寒沙門氏菌的含量。MB的加入大大提高了傳感器的檢測性能，作為一種電化學(xué)活性物質(zhì)，MB可以明顯放大響應(yīng)電流，這使檢測更加便利，同時(shí)也減小了測量誤差。核酸外切酶 I（Exo I）的引入也使傳感器的性能得到了提升。作為一種僅作用于單鏈的3′—5′核酸外切酶，Exo I能沿著3′-OH末端將其剪切為單個(gè)核苷酸，且不依賴特定的核酸序列[30-31]。在本研究中，當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入到檢測體系后，由于其與適體鏈間的高度特異性結(jié)合作用，鼠傷寒沙門氏菌會將適體鏈從電極上帶離，此時(shí) Exo I能迅速作用于適體鏈，將其分解成單個(gè)核苷酸，同時(shí)鼠傷寒沙門氏菌被從適體鏈上釋放，得以循環(huán)作用于電極上的適配體，將更多的適配體帶離，這樣即便是微量的鼠傷寒沙門氏菌也可以通過循環(huán)作用產(chǎn)生較大的電信號，保證了傳感器的靈敏度，且整個(gè)過程快速高效。

4　結(jié)論

本研究以電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)為信號探針，通過在玻碳電極上修飾還原氧化石墨烯與納米金以提高電極的性能，并引入核酸外切酶I進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)信號的放大，成功構(gòu)建一種新型的用于鼠傷寒沙門氏菌定量檢測的電化學(xué)適配體傳感器。該傳感器最低檢測限為67 cfu/mL，檢測范圍在2×102—2×107cfu/mL，檢測時(shí)間為 40 min，綜合性能良好。在鼠傷寒沙門氏菌定量檢測上，該傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏度、特異性以及重復(fù)性，加上操作簡便、檢測迅速，有望推廣應(yīng)用于食品工業(yè)中鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測和有效防控。

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