LncRNA NNT-AS1對胃癌細胞增殖、凋亡作用機制研究

帥勇鋒　王小軍　張一中

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在所有腫瘤中排第4位，病死率排第2位；據(jù)統(tǒng)計，2012年全球共有951 600人診斷為胃癌，723 100人死于胃癌[1]。約70%的胃癌病例發(fā)生于發(fā)展中國家，以55～80歲人群高發(fā)，5年生存率為10%～30%[2]；而日本得益于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早手術(shù)，胃癌的5年生存率為50%～70%[3]。深入研究胃癌的發(fā)病機制對研制有效的治療藥物，提高治療效果具有重要意義。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是一類長度超過200個核甘酸的RNA，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，其可通過染色質(zhì)重塑介導(dǎo)基因的沉默或激活[4]，在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用[5-6]。LncRNA NNT-AS1由5p12染色體編碼，在結(jié)腸癌細胞中高表達，下調(diào)LncRNA NNT-AS1表達可降低結(jié)腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力[7]。然而，LncRNA NNT-AS1在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用，目前報道少見。本實驗在體外條件下研究LncRNA NNT-AS1對胃癌細胞增殖、凋亡的作用機制，以供臨床參考，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料正常人胃成纖維細胞系NSFC、胃癌細胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87均購自中國醫(yī)學科學院，DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，Trizol購自美國Invitrogen公司；Western blot所用一抗購自美國BD公司，HRP標記的二抗購自英國Abcam公司；羅氏HP DNA轉(zhuǎn)染試劑、polybrane購自Sigma公司，慢病毒及轉(zhuǎn)染序列設(shè)計由廣州銳博生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1慢病毒包裝與感染取慢病毒包裝質(zhì)粒1.5μg、shRNA慢病毒質(zhì)粒0.5μg，用羅氏轉(zhuǎn)染試劑以DNA（μg）：轉(zhuǎn)染試劑（μl）為1∶2的比例，共轉(zhuǎn)染至接種于6孔板的HEK293T細胞中，轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞培養(yǎng)液，即慢病毒液。此慢病毒液可直接感染KATO-Ⅲ細胞，加入終濃度為8μg/ml的polybrane，慢病毒感染24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入puromycin篩選3～5d，待細胞不死亡，即提示穩(wěn)定細胞株構(gòu)建成功。

1.2.2細胞培養(yǎng)、慢病毒感染及分組將胃癌細胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87及正常人胃成纖維細胞系NSFC培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%二氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)。將KATO-Ⅲ細胞系分成對照組、sh-vector組及sh-NNT-AS1組共3組，分別不感染慢病毒、感染陰性shRNA慢病毒及感染lenti-sh-NNT-AS1慢病毒，構(gòu)建成穩(wěn)定細胞株后進行后續(xù)實驗。

1.2.3RNA提取和實時熒光定量PCR檢測LncRNA NNT-AS1采用Trizol提取細胞總RNA，并按TaqMan RNA reverse transcription kit（ABI,USA）說明書，將5ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在ABI 7500實時熒光定量PCR儀中，使用SYBR Green PCR master mix試劑（Roche,USA），以β-actin作為內(nèi)參，量化LncRNA NNTAS1的表達水平。選取的引物如下：LncRNA NNT-AS1上游引物5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，下游引物5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；β-actin正向引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物3′-CTAAGTCATAGTCC-GCCTAGAAGCA-5′，使用2-ΔΔCt方法定量，計算LncRNA NNT-AS1的相對表達水平。

1.2.4MTT細胞增殖實驗3組細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后添加5mg/ml MTT溶液40μl，孵育4h后每孔加入200μl DMSO，搖床上充分震蕩。接著培養(yǎng)12、24、48、72h，490nm波長測定吸光度值（OD490值），OD490值越高表示細胞增殖能力越強。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5細胞克隆形成實驗將3組細胞按600個細胞/孔培養(yǎng)7d后，測定克隆形成數(shù)。先去除培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，再用甲醇固定細胞20min，然后1%亞甲基藍染色40min，去離子水清洗2遍，晾干。顯微鏡下計算＞50個細胞的克隆形成數(shù)量。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡采用Annexin V/PI染色檢測，將3組細胞消化成單細胞懸液后，PBS清洗2次，Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin V陽性細胞比例來確定細胞凋亡情況。

1.2.7Western blot法檢測細胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表達提取sh-vector組和sh-NNT-AS1組細胞總蛋白，每孔30μg總蛋白上樣，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h；分別加入caspase3、8、9、β-actin一抗（1∶200），孵育過夜，PBS漂洗，再加入二抗1∶1 000，孵育2h，ECL液發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Quantity One 1-D分析軟件（美國Bio-Rad公司）對蛋白質(zhì)印跡條帶進行定量。以目的蛋白測定值與GAPDH的比值作為蛋白的相對表達水平。

1.3觀察指標（1）比較胃癌細胞與正常胃成纖維細胞LncRNA NNT-AS1表達水平；（2）比較sh-NNT-AS1組、sh-vector組、對照組細胞增殖情況；（3）比較sh-NNTAS1組、sh-vector組、對照組細胞凋亡情況；（4）比較sh-NNT-AS1組、sh-vector組細胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表達水平。

1.4統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌細胞與正常胃成纖維細胞LncRNA NNT-AS1表達水平比較見圖1。

圖1　胃癌細胞與正常胃成纖維細胞LncRNA NNT-AS1表達水平比較（**P＜0.01）

由圖1可見，LncRNA NNT-AS1在胃癌細胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87的相對表達水平分別為5.33±0.67、4.82±0.97、3.86±0.54及4.13±0.44，在正常胃成纖維細胞NSFC的相對表達水平為1.0±0.03。胃癌細胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87 LncRNA NNT-AS1的表達水平均明顯高于正常胃成纖維細胞系NSFC（均P＜0.01）。

2.2sh-NNT-AS1組、sh-vector組、對照組細胞增殖情況比較見圖2。

圖2　sh-NNT-AS1組、sh-vector組、對照組細胞增殖情況比較（a:OD490值比較；b：克隆形成數(shù)比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

由圖2可見，細胞培養(yǎng)12、24、48、72 h后，相比sh-vector組、對照組，sh-NNT-AS1組OD490值明顯降低（均P＜0.05）。細胞培養(yǎng)7d后，sh-NNT-AS1組克隆形成數(shù)明顯低于sh-vector組、對照組（均P＜0.05）。即LncRNA NNT-AS1沉默抑制胃癌細胞增殖。

2.3sh-NNT-AS1組、sh-vector組、對照組細胞凋亡情況比較見圖3。

圖3　sh-NNT-AS1組、sh-vector組、對照組細胞凋亡情況比較（a：流式細胞圖比較；b：凋亡率比較；**P＜0.01）

由圖3可見，sh-NNT-AS1組細胞凋亡率明顯高于sh-vector組、對照組（均P＜0.01），即LncRNA NNTAS1沉默促進胃癌細胞凋亡。

2.4sh-NNT-AS1組、sh-vector組細胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表達水平比較見圖4。

由圖4可見，sh-NNT-AS1組細胞凋亡蛋白Caspase3、9表達水平均高于sh-vector組（均P＜0.05），而Caspase 8表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。即LncRNA NNT-AS1沉默促進胃癌細胞凋亡的機制是通過上調(diào)凋亡蛋白Caspase3、9表達來誘導(dǎo)。

圖4　sh-NNT-AS1組、sh-vector組細胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表達水平比較（a:蛋白電泳圖比較；b：蛋白表達水平比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

3　討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是涉及到一系列病因的多步驟、復(fù)雜過程。幽門螺桿菌感染、高鹽飲食、家族史、吸煙都是影響胃癌發(fā)病的因素[8-9]。約95%的胃癌為腺癌，依據(jù)大體形態(tài)可分為彌散型和腸型。早發(fā)現(xiàn)、早手術(shù)仍是治療胃癌的最有效方法，但胃癌在臨床發(fā)現(xiàn)時往往已是晚期，明確胃癌的發(fā)病機制對提高胃癌治療效果顯得尤為重要。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及一系列重要分子和信號通路突變，如miRNA[10-11]、p53[12]、Ras[13]、LncRNAs[14]等。LncRNAs是近年來腫瘤界研究的熱點分子，其被報道在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。Tuo等[15]報道LncRNA UCA1通過下調(diào)miR-143表達在乳腺癌中起促癌作用。Shi等[16]報道LncRNA GAS5過表達可誘導(dǎo)非小細胞肺癌凋亡和生長阻滯。Ding等[17]報道LncRNA PVT1在肝癌組織中表達上調(diào)，且與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)。Li等[18]報道LncRNA HOTAIR通過下調(diào)肝癌干細胞的SETD2表達促進腫瘤發(fā)生。

LncRNA NNT-AS1是種新發(fā)現(xiàn)的LncRNAs分子，包含3個外顯子，定位于5號染色體的43573185-43603230區(qū)[7]。Wang等[7]報道LncRNA NNT-AS1高表達于結(jié)腸癌組織，且是影響結(jié)腸癌無瘤生存和總生存率的獨立影響因素，抑制其表達可在體外及體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。本研究在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在胃癌細胞系中較在正常胃上皮細胞系中高表達，沉默LncRNA NNT-AS1表達可抑制胃癌細胞系KATO-Ⅲ細胞增殖和克隆形成。這表明沉默LncRNA NNT-AS1可在體外抑制胃癌細胞增殖。

細胞凋亡是程序性的細胞死亡，是細胞自殺性的過程，以凋亡小體形成為特征，進而DNA裂解成200bp左右的不等片段。細胞凋亡由一系列信號通路所觸發(fā)，主要包括兩條路徑[19]，其一為外源性路徑，由TNF受體1、Fas/CD95、DR3和TRAIL-R1等死亡受體介導(dǎo)，配體與受體結(jié)合后，進一步激活Caspase 3、8酶活性并誘導(dǎo)凋亡[20]；其二為內(nèi)源性路徑，也即線粒體途徑，各種凋亡刺激導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變，進一步激活Caspase3、8、9，裂解多聚（ADP-核糖）聚合酶，使DNA修復(fù)終止，活化核酸內(nèi)切酶，并將DNA裂解為180～200bp大小的片段，同時破壞細胞骨架蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、核蛋白等，使細胞失去正常形態(tài)，最終誘導(dǎo)細胞走向凋亡[21-22]。本研究對3組分別行流式細胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)sh-NNT-AS1組細胞凋亡率明顯高于對照組、sh-vector組，提示沉默LncRNA NNT-AS1表達可誘導(dǎo)胃癌細胞系KATO-Ⅲ凋亡。進一步對sh-NNT-AS1組、sh-vector組行Western blot，發(fā)現(xiàn)sh-NNT-AS1組凋亡蛋白Caspase 8表達水平與sh-vector組比較差異無統(tǒng)計學意義，而sh-NNT-AS1組Caspase3、9表達水平均高于sh-vector組，這表明其誘導(dǎo)凋亡的機制是通過內(nèi)源性通路誘導(dǎo)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示LncRNA NNT-AS1在胃癌細胞中高表達，沉默NNT-AS1表達可抑制胃癌細胞系KATO-Ⅲ增殖，并誘導(dǎo)胃癌細胞系KATO-Ⅲ凋亡，機制可能與上調(diào)凋亡蛋白Caspase3、9表達有關(guān)。LncRNA NNT-AS1或可作為胃癌治療的一個新靶點。當然，本研究也存在一些不足，如尚缺乏動物體內(nèi)的研究數(shù)據(jù)，LncRNA NNT-AS1靶向調(diào)節(jié)miRNA分子機制也不清楚，均值得進一步深入研究。

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