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    超敏熒光定量PCR法核酸檢測與乙肝兩對半聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用

    2018-04-02 07:00:44陳建仁李馳關(guān)惠恒
    中國實用醫(yī)藥 2018年9期
    關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒

    陳建仁 李馳 關(guān)惠恒

    【摘要】 目的 探討超敏熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法核酸檢測與乙型肝炎(乙肝)兩對半聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用。方法 155例乙肝患者分別采集血清樣本, 利用化學(xué)發(fā)光法和基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法分別進行乙肝兩對半和乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)檢測。結(jié)果 155例樣本中乙肝兩對半共檢出12種血清類型, 其中小三陽占58.06%, 大三陽占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽性率為62.58%, 檢測下限低至10 IU/ml, 其中小三陽陽性率為66.67%, HBV-DNA平均含量(6.17±0.91)lgIU/ml;大三陽陽性率為90.32%, HBV-DNA平均含量(6.98±1.02)lgIU/ml。小三陽和大三陽組超敏熒光定量PCR陽性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法可準確測定病毒載量, 檢測下限低至10 IU/ml, 與傳統(tǒng)乙肝兩對半聯(lián)用有助于乙肝的臨床診斷、用藥指導(dǎo)及療效監(jiān)測。

    【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒;磁珠法;核酸提?。怀?;熒光定量;聚合酶鏈反應(yīng)

    DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.049

    乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種嗜肝DNA病毒, 可引起急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎等, 部分患者可演變成肝硬化或肝癌。乙肝已成為世界性公共衛(wèi)生問題, 我國為乙肝高發(fā)區(qū), 人群表面抗原攜帶率高達7.18%, 慢性乙肝患者約2000萬[1]。乙肝流行形勢嚴峻, 及時并準確檢測HBV對防控乙肝尤為重要。目前臨床多采用免疫學(xué)方法檢測HBV血清標志物, 包括乙肝表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)和乙肝核心抗體(HBcAb), 即乙肝五項或乙肝兩對半, 可反映機體感染后的免疫狀態(tài), 但不能直接反映病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀況, 且對空窗期或者隱匿性乙肝患者易漏檢[2]。隨著分子診斷技術(shù)的進步, HBV-DNA檢測技術(shù)應(yīng)運而生, HBV-DNA含量是HBV復(fù)制最直接、最可靠的檢測指標, 在及時診斷、療效評價與預(yù)后判定方面發(fā)揮著重要作用[3]。本研究分別采用化學(xué)發(fā)光法和超敏熒光定量PCR法對155例乙肝患者的乙肝兩對半及HBV-DNA進行檢測, 以期闡明二者聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用價值?,F(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1. 1 一般資料 選取2016年7~9月陽江市公共衛(wèi)生醫(yī)院就診的155例乙肝患者, 男112例, 女43例, 男女比例約為2.60∶1;年齡14~81 歲, 平均年齡42.17歲。

    1. 2 試劑 乙肝五項檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司;Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒(64 T/盒, 預(yù)封裝)及HBV核酸定量檢測試劑盒(熒光PCR法)(32 T/盒)均購自西安天隆科技有限公司。

    1. 3 設(shè)備 全自動化學(xué)發(fā)光儀(MAGLUMI 2000 Plus)購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司;磁珠法自動核酸提取儀(NP968-C)購自西安天隆科技有限公司;熒光定量PCR儀(LightCycler480)購自美國羅氏公司。

    1. 4 方法 分別按照相應(yīng)要求各采集5 ml靜脈血, 于3 h 內(nèi)分離血清, 低溫保存待檢。

    1. 4. 1 乙肝五項檢測 采用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝五項, 即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。具體操作按照說明書嚴格執(zhí)行, 根據(jù)相應(yīng)標準判定陰陽性。

    1. 4. 2 HBV-DNA檢測

    1. 4. 2. 1 磁珠法自動化核酸提取 采用磁珠法自動核酸提取系統(tǒng)提取血清樣本的HBV-DNA, 按照說明書進行操作, 將核酸產(chǎn)物低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    1. 4. 2. 2 超敏熒光定量PCR法檢測 利用超敏熒光定量PCR法定量檢測低溫保存的核酸產(chǎn)物, 按照說明書進行操作, 根據(jù)定量結(jié)果判定陰陽性。

    1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    155例樣本中乙肝兩對半共檢出12種血清類型, 其中小三陽占58.06%, 大三陽占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽性率為62.58%(97/155), 檢測下限低至10 IU/ml, 其中小三陽陽性率為66.67%, HBV-DNA平均含量(6.17±0.91)lgIU/ml;大三陽陽性率為90.32%, HBV-DNA平均含量(6.98±1.02)lgIU/ml。小三陽和大三陽組超敏熒光定量PCR陽性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    3 討論

    乙肝兩對半是臨床上常用檢測HBV的方法, 目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準的這類方法有膠體金、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等。此類方法快速、簡便、成本低, 但靈敏度低、特異性差。對低病毒載量的空窗期或者隱匿性乙肝患者容易漏檢, 且不能直接反映體內(nèi)病毒的復(fù)制狀況 [2]。近年熒光定量PCR、基因芯片和PCR反向點雜交等分子生物學(xué)方法不斷涌現(xiàn), 其靈敏度高、特異性好, 很好地解決免疫學(xué)方法的缺陷, 降低漏檢率[3, 4]。其中, 熒光定量PCR法因其具有更高的靈敏度, 且可對病毒進行精確定量、操作簡便等優(yōu)勢, 在臨床上應(yīng)用最為廣泛[5]。

    HBV病毒載量能反映乙肝患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況和感染性的強弱, 為患者治療方案的選擇和療效評價、治療終點判斷、耐藥和復(fù)發(fā)監(jiān)測提供客觀依據(jù)。傳統(tǒng)乙肝治療中, 常以HBV-DNA<2000 IU/ml作為應(yīng)答的標準之一, 但終止治療后常會出現(xiàn)病毒反跳的狀況。研究表明主要是因為低載量的HBV未被監(jiān)測到, 導(dǎo)致病毒持續(xù)在體內(nèi)復(fù)制。準確而敏感地監(jiān)測患者體內(nèi)HBV-DNA載量的動態(tài)變化對治療方案的選擇和療效評價至關(guān)重要[6-8]。

    經(jīng)CFDA網(wǎng)站查詢, 目前通過審批的大部分HBV-DNA檢測產(chǎn)品的前期核酸提取多采用手工煮沸法, 不能自動化, 費時費力, 據(jù)報道回收率低, 重復(fù)性差, 靈敏度僅為500~1000 IU/ml[6, 9-11]。本研究采用超敏熒光定量PCR檢測試劑, 前期核酸提取采用全自動磁珠法核酸提取系統(tǒng), 通過裂解病毒使DNA充分游離出來, 再利用表面特殊處理的磁珠吸附DNA, 而蛋白質(zhì)、多糖及脂類等雜質(zhì)留在溶液中, 在磁場作用下磁性顆粒與液體分開, 再經(jīng)洗脫得到病毒DNA。磁珠法核酸提取大大提高核酸的純度和得率, 由于采用自動化提取, 重復(fù)性也更好, 交叉污染率更低, 后期熒光PCR的靈敏度高達10 IU/ml, 可以更好地指導(dǎo)臨床診斷、用藥及預(yù)后[10]。

    乙肝兩對半主要反映機體對HBV的免疫狀態(tài), 可間接反映HBV的傳染性及病情嚴重程度。臨床研究表明, 大三陽患者傳染性很強[8], 超敏熒光定量PCR結(jié)果也印證這一點。本研究中大三陽患者熒光PCR陽性率及平均病毒載量均為各組最高, 分別為90.32%和(6.98±1.02)lgIU/ml與小三陽比較, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與王華、譚斌等[12, 13]研究一致。既往臨床認為小三陽患者傳染性較弱, 此次研究表明小三陽HBV-DNA含量高達(6.17±0.91)lgIU/ml僅次于大三陽, 與譚斌等[13]的研究一致, 小三陽病毒載量已超過臨床抗病毒的應(yīng)答標準2000 IU/ml, 具有較強的傳染性, 應(yīng)及時治療[14]。(HBsAg+HBsAb+), (HBsAg+HBcAb+), (HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb+)及(HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb+)四種血清型患者的HBV-DNA也為陽性, 有一定的傳染性, 應(yīng)該引起重視, 國內(nèi)王華、張慶安等[12, 15]研究也對此做相應(yīng)報道。在本研究中, 部分血清學(xué)陽性的患者超敏熒光定量PCR檢測卻顯示為陰性, 分析原因可能如下:①部分患者用藥治療后, HBV-DNA先于血清標志物消失;②HBV整合進宿主肝細胞, 導(dǎo)致血清中無法檢測到游離HBV-DNA[8]。

    綜上所述, 基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法較傳統(tǒng)核酸檢測方法, 靈敏度更高, 前期樣本處理還可全自動化。傳統(tǒng)免疫學(xué)方法又可直接反映機體對HBV的免疫狀態(tài), 且成本和實驗室條件要求都低。超敏熒光定量PCR法和免疫學(xué)方法聯(lián)合使用可在HBV的及時診斷、用藥選擇、療效評估及病程預(yù)測等方面發(fā)揮巨大的臨床價值。

    參考文獻

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    [收稿日期:2018-01-22]

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