超敏熒光定量PCR法核酸檢測與乙肝兩對半聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用

陳建仁 李馳 關(guān)惠恒

【摘要】 目的 探討超敏熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法核酸檢測與乙型肝炎（乙肝）兩對半聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用。方法 155例乙肝患者分別采集血清樣本， 利用化學(xué)發(fā)光法和基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法分別進行乙肝兩對半和乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）檢測。結(jié)果 155例樣本中乙肝兩對半共檢出12種血清類型， 其中小三陽占58.06%， 大三陽占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽性率為62.58%， 檢測下限低至10 IU/ml， 其中小三陽陽性率為66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三陽陽性率為90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三陽和大三陽組超敏熒光定量PCR陽性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法可準確測定病毒載量， 檢測下限低至10 IU/ml， 與傳統(tǒng)乙肝兩對半聯(lián)用有助于乙肝的臨床診斷、用藥指導(dǎo)及療效監(jiān)測。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；磁珠法；核酸提?。怀?；熒光定量；聚合酶鏈反應(yīng)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.049

乙肝病毒（hepatitis B virus， HBV）是一種嗜肝DNA病毒， 可引起急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎等， 部分患者可演變成肝硬化或肝癌。乙肝已成為世界性公共衛(wèi)生問題， 我國為乙肝高發(fā)區(qū)， 人群表面抗原攜帶率高達7.18%， 慢性乙肝患者約2000萬[1]。乙肝流行形勢嚴峻， 及時并準確檢測HBV對防控乙肝尤為重要。目前臨床多采用免疫學(xué)方法檢測HBV血清標志物， 包括乙肝表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）和乙肝核心抗體（HBcAb）， 即乙肝五項或乙肝兩對半， 可反映機體感染后的免疫狀態(tài)， 但不能直接反映病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀況， 且對空窗期或者隱匿性乙肝患者易漏檢[2]。隨著分子診斷技術(shù)的進步， HBV-DNA檢測技術(shù)應(yīng)運而生， HBV-DNA含量是HBV復(fù)制最直接、最可靠的檢測指標， 在及時診斷、療效評價與預(yù)后判定方面發(fā)揮著重要作用[3]。本研究分別采用化學(xué)發(fā)光法和超敏熒光定量PCR法對155例乙肝患者的乙肝兩對半及HBV-DNA進行檢測， 以期闡明二者聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年7～9月陽江市公共衛(wèi)生醫(yī)院就診的155例乙肝患者， 男112例， 女43例， 男女比例約為2.60∶1；年齡14～81 歲， 平均年齡42.17歲。

1. 2 試劑 乙肝五項檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（64 T/盒， 預(yù)封裝）及HBV核酸定量檢測試劑盒（熒光PCR法）（32 T/盒）均購自西安天隆科技有限公司。

1. 3 設(shè)備 全自動化學(xué)發(fā)光儀（MAGLUMI 2000 Plus）購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；磁珠法自動核酸提取儀（NP968-C）購自西安天隆科技有限公司；熒光定量PCR儀（LightCycler480）購自美國羅氏公司。

1. 4 方法 分別按照相應(yīng)要求各采集5 ml靜脈血， 于3 h 內(nèi)分離血清， 低溫保存待檢。

1. 4. 1 乙肝五項檢測 采用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝五項， 即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。具體操作按照說明書嚴格執(zhí)行， 根據(jù)相應(yīng)標準判定陰陽性。

1. 4. 2 HBV-DNA檢測

1. 4. 2. 1 磁珠法自動化核酸提取 采用磁珠法自動核酸提取系統(tǒng)提取血清樣本的HBV-DNA， 按照說明書進行操作， 將核酸產(chǎn)物低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4. 2. 2 超敏熒光定量PCR法檢測 利用超敏熒光定量PCR法定量檢測低溫保存的核酸產(chǎn)物， 按照說明書進行操作， 根據(jù)定量結(jié)果判定陰陽性。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

155例樣本中乙肝兩對半共檢出12種血清類型， 其中小三陽占58.06%， 大三陽占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽性率為62.58%（97/155）， 檢測下限低至10 IU/ml， 其中小三陽陽性率為66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三陽陽性率為90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三陽和大三陽組超敏熒光定量PCR陽性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

乙肝兩對半是臨床上常用檢測HBV的方法， 目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準的這類方法有膠體金、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等。此類方法快速、簡便、成本低， 但靈敏度低、特異性差。對低病毒載量的空窗期或者隱匿性乙肝患者容易漏檢， 且不能直接反映體內(nèi)病毒的復(fù)制狀況 [2]。近年熒光定量PCR、基因芯片和PCR反向點雜交等分子生物學(xué)方法不斷涌現(xiàn)， 其靈敏度高、特異性好， 很好地解決免疫學(xué)方法的缺陷， 降低漏檢率[3， 4]。其中， 熒光定量PCR法因其具有更高的靈敏度， 且可對病毒進行精確定量、操作簡便等優(yōu)勢， 在臨床上應(yīng)用最為廣泛[5]。

HBV病毒載量能反映乙肝患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況和感染性的強弱， 為患者治療方案的選擇和療效評價、治療終點判斷、耐藥和復(fù)發(fā)監(jiān)測提供客觀依據(jù)。傳統(tǒng)乙肝治療中， 常以HBV-DNA<2000 IU/ml作為應(yīng)答的標準之一， 但終止治療后常會出現(xiàn)病毒反跳的狀況。研究表明主要是因為低載量的HBV未被監(jiān)測到， 導(dǎo)致病毒持續(xù)在體內(nèi)復(fù)制。準確而敏感地監(jiān)測患者體內(nèi)HBV-DNA載量的動態(tài)變化對治療方案的選擇和療效評價至關(guān)重要[6-8]。

經(jīng)CFDA網(wǎng)站查詢， 目前通過審批的大部分HBV-DNA檢測產(chǎn)品的前期核酸提取多采用手工煮沸法， 不能自動化， 費時費力， 據(jù)報道回收率低， 重復(fù)性差， 靈敏度僅為500～1000 IU/ml[6， 9-11]。本研究采用超敏熒光定量PCR檢測試劑， 前期核酸提取采用全自動磁珠法核酸提取系統(tǒng)， 通過裂解病毒使DNA充分游離出來， 再利用表面特殊處理的磁珠吸附DNA， 而蛋白質(zhì)、多糖及脂類等雜質(zhì)留在溶液中， 在磁場作用下磁性顆粒與液體分開， 再經(jīng)洗脫得到病毒DNA。磁珠法核酸提取大大提高核酸的純度和得率， 由于采用自動化提取， 重復(fù)性也更好， 交叉污染率更低， 后期熒光PCR的靈敏度高達10 IU/ml， 可以更好地指導(dǎo)臨床診斷、用藥及預(yù)后[10]。

乙肝兩對半主要反映機體對HBV的免疫狀態(tài)， 可間接反映HBV的傳染性及病情嚴重程度。臨床研究表明， 大三陽患者傳染性很強[8]， 超敏熒光定量PCR結(jié)果也印證這一點。本研究中大三陽患者熒光PCR陽性率及平均病毒載量均為各組最高， 分別為90.32%和（6.98±1.02）lgIU/ml與小三陽比較， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與王華、譚斌等[12， 13]研究一致。既往臨床認為小三陽患者傳染性較弱， 此次研究表明小三陽HBV-DNA含量高達（6.17±0.91）lgIU/ml僅次于大三陽， 與譚斌等[13]的研究一致， 小三陽病毒載量已超過臨床抗病毒的應(yīng)答標準2000 IU/ml， 具有較強的傳染性， 應(yīng)及時治療[14]。（HBsAg+HBsAb+）， （HBsAg+HBcAb+）， （HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb+）及（HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb+）四種血清型患者的HBV-DNA也為陽性， 有一定的傳染性， 應(yīng)該引起重視， 國內(nèi)王華、張慶安等[12， 15]研究也對此做相應(yīng)報道。在本研究中， 部分血清學(xué)陽性的患者超敏熒光定量PCR檢測卻顯示為陰性， 分析原因可能如下：①部分患者用藥治療后， HBV-DNA先于血清標志物消失；②HBV整合進宿主肝細胞， 導(dǎo)致血清中無法檢測到游離HBV-DNA[8]。

綜上所述， 基于磁珠法自動化核酸提取的超敏熒光定量PCR法較傳統(tǒng)核酸檢測方法， 靈敏度更高， 前期樣本處理還可全自動化。傳統(tǒng)免疫學(xué)方法又可直接反映機體對HBV的免疫狀態(tài)， 且成本和實驗室條件要求都低。超敏熒光定量PCR法和免疫學(xué)方法聯(lián)合使用可在HBV的及時診斷、用藥選擇、療效評估及病程預(yù)測等方面發(fā)揮巨大的臨床價值。

參考文獻

[1] 胡曉麗， 趙宏偉， 吳曉巖， 等. 乙型肝炎病毒感染的流行現(xiàn)狀. 臨床肝膽病雜志， 2012， 28（6）：413-416.

[2] 吳麗君. 對臨床檢測HBV-DNA篩查隱匿性HBV攜帶者的探討. 中外醫(yī)學(xué)研究， 2015（13）：62-63.

[3] 劉兵， 胡蓉， 楊聯(lián)云， 等. 乙型肝炎病毒DNA定量分析的臨床意義. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊， 2012， 14（4）：673-674.

[4] 鮑淑華， 樓正青， 高麗華. 乙肝病毒標記物陽性表型血清標本HBV-DNA水平分析. 中華全科醫(yī)學(xué)， 2014， 12（6）：977-978.

[5] 劉青鶴. HBV-M與定量PCR法檢測HBV-DNA相關(guān)性探析. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新， 2014（25）：123-124.

[6] 黃麗珍. 肝組織HBV DNA檢測對血清HBV DNA陰性乙型肝炎肝硬化患者抗病毒治療的指導(dǎo)意義. 吉林大學(xué)， 2013.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會. 慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）. 中國肝臟病雜志（電子版）， 2016， 19（3）：1-18.

[8] Organization WH. Guidelines for the Prevention， Care and Treatment of Persons with Chronic Hepatitis B Infection. World Health Organization， 2015.

[9] 倪俊明， 孫梅， 吳旭平. 國產(chǎn)熒光定量PCR與COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v 2. 0檢測HBV DNA結(jié)果比較. 臨床檢驗雜志， 2014， 32（5）：398-399.

[10] 戎國棟， 徐婷， 趙鴻， 等. 超敏HBV DNA定量檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用研究. 臨床與病理雜志， 2015， 35（8）：1537-1541.

[11] 姜紅飛， 曹俊敏. 基于磁珠法的熒光定量PCR檢測HBV-DNA臨床應(yīng)用評價. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2015， 27（5）：610-612.

[12] 王華. FQ-PCR技術(shù)定量檢測HBV-DNA與乙型肝炎病毒免疫學(xué)標記物的相關(guān)性. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2016， 10（3）：19-20.

[13] 譚斌， 楊文才， 李嘉， 等. HBV-DNA水平與乙型肝炎兩對半模式的相關(guān)性. 中國老年學(xué)， 2015（10）：2749-2750.

[14] 顏敏. 血清HBV-DNA熒光定量PCR檢測與乙肝病毒標志物模式的相關(guān)因素探討. 中外醫(yī)療， 2014（26）：193-194.

[15] 張慶安. 乙肝患者血清免疫學(xué)標志物檢測結(jié)果與HBV—DNA定性、定量關(guān)系的分析. 山東醫(yī)藥， 2012， 52（22）：74-76.

[收稿日期：2018-01-22]