小檗堿對(duì)H2O2損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

孫勝男，劉 欣，佟苗苗，伊舒巖，范樂(lè)萌，劉 雙，李昕茹，樊樂(lè)琪，張 囡(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 1101； .河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050000； .承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有分化神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化潛能[1]。研究發(fā)現(xiàn)NSCs具有修復(fù)損傷組織的能力，來(lái)防治由細(xì)胞缺失或損傷引起的多種疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)退行性或損傷性疾病。在中風(fēng)和缺氧缺血等實(shí)驗(yàn)性的腦損傷模型中，NSCs開(kāi)始增生和遷移到損傷部位分化為神經(jīng)元[2 - 3]。腦組織受損后，周圍環(huán)境缺血缺氧、氧化應(yīng)激等炎癥因子等多種不良因素，導(dǎo)致具有增殖、分化功能的NSCs數(shù)量有限，難以修復(fù)損傷的神經(jīng)區(qū)域[4]。尋找促進(jìn)體內(nèi)NSCs增殖的藥物對(duì)于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。小檗堿(berberine)是一種異喹啉類生物堿，是黃連和黃柏的主要活性成分，具有抗炎、改善糖脂代謝、治療的腹瀉作用[5 - 6]。此外，小檗堿對(duì)腦缺血、阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦損傷引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[7-9]。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察小檗堿對(duì)NSCs增殖的影響，為開(kāi)發(fā)對(duì)NSCs具有保護(hù)效能的治療藥物以及小檗堿的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)24 h內(nèi)新生SD大鼠，雌雄不限，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK (冀) 2017-1-003]。無(wú)菌手術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK (冀) 2017-0012]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017-0083)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用按照3R原則給予人道的關(guān)懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基，B27添加劑為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)為美國(guó)Peprotech公司產(chǎn)品；多聚賴氨酸，小鼠抗大鼠Nestin抗體，兔抗大鼠Ki67、兔抗大鼠Notch1、兔抗大鼠Hes1抗體，F(xiàn)ITC-標(biāo)記兔抗鼠二抗、Cy3-標(biāo)記羊抗兔二抗，DAPT均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品；CCK8試劑盒為北京莊盟有限公司產(chǎn)品。倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；DYY-12型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40B型轉(zhuǎn)印電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NSCs的分離

將出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠脫頸處死后置于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒5 min，無(wú)菌條件下取出全腦，置于盛有冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中去除小腦、腦干、血管和腦膜，取出大腦皮層并去除軟腦膜，PBS緩沖液漂洗兩次，轉(zhuǎn)移至離心管加入一定量冷PBS緩沖液吹打均勻，過(guò)200目篩網(wǎng)，1000 r/min離心5 min棄上清，全培養(yǎng)基(2% B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的DMEM/F12)重懸，以每毫升1.4 × 106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每2～3 d半量換液，5～9 d傳代一次。收集原代培養(yǎng)的神經(jīng)球，離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1 × 105個(gè)，放入37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)3～7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。本研究所用的NSCs均為傳1代的細(xì)胞。

1.3.2 NSCs鑒定

將生長(zhǎng)狀況良好的第1代NSCs接種到預(yù)先經(jīng)過(guò)多聚賴氨酸處理的96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后取出，去掉完全培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，每次2 min。4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS緩沖液清洗2次，每次2 min。0.5% Triton X-100細(xì)胞通透5 min，PBS緩沖液清洗2次，每次2 min。正常牛血清(10%)室溫封閉30 min。吸出血清，加入兔抗鼠Nestin(1∶200)，4℃過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次3 min。在黑暗中孵育熒光標(biāo)記的二次抗體，37℃避光孵育1 h，PBS緩沖液漂洗3次，DAPI染核1 min；再用PBS緩沖液漂洗2次，體積分?jǐn)?shù)0.5%甘油封片，倒置熒光顯微鏡照相。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及CCK8法檢測(cè)NSCs活力

將培養(yǎng)的NSCs用胰酶消化為單個(gè)NSC，以每孔2 × 105個(gè)細(xì)胞、200 μL的體積加入96孔板中，培養(yǎng)至第3天。正常組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；H2O2組，給予終濃度為30 μmol/L H2O2處理12 h；小檗堿組，H2O2和不同終濃度小檗堿(0.5、1、5、20 μmol/L)孵育12 h；DAPT(Notch信號(hào)通路阻斷劑)組，H2O2、小檗堿(5 μmol/L)、DAPT共同孵育12 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，向每孔加入10 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔) × 100%。

1.3.4 測(cè)量NSCs球平均直徑

NSC單細(xì)胞懸浮液鋪于96孔板，密度為每孔2 × 105個(gè)細(xì)胞，體積為每孔200 μL，培養(yǎng)至3 d。設(shè)置正常對(duì)照組、H2O2組和小檗堿組(5、10 μmol/L)，處理NSCs結(jié)束后，顯微鏡下任選5個(gè)視野觀察神經(jīng)球數(shù)量和直徑大小。

1.3.5 Ki67染色檢測(cè)NSCs增殖

正常對(duì)照組、H2O2組、小檗堿組(5 μmol/L)、DAPT組收集NSCs，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫下固定15 min行免疫熒光染色。每組在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI細(xì)胞數(shù)× 100%。

1.3.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

蛋白裂解液處理各組樣品，使用超聲破碎，離心(4℃，12 000 r/min，10 min)，每孔上樣量50 μg，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Ki67(1∶1000)、Notch1(1∶1000)、Hes1(1∶1000)、β-actin(1∶1000)抗體4℃冰箱過(guò)夜，棄掉一抗，TBST緩沖液洗膜5 min，3次，室溫孵育二抗(1∶10 000)2 h，棄掉二抗，TBST緩沖液洗膜5 min，3次；ECL發(fā)光顯色，采用β-actin作為內(nèi)參，Image J軟件分析相對(duì)灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCs的鑒定

24 h后，可在普通光顯微鏡下看到許多小懸浮神經(jīng)球。神經(jīng)球的直徑隨時(shí)間的增加而增加，形狀變圓，培養(yǎng)72 h后，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)。免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)NSCs的特征性蛋白Nestin的表達(dá)。結(jié)果顯示，在神經(jīng)球細(xì)胞團(tuán)中有大量Nestin表達(dá)陽(yáng)性，提示形成的神經(jīng)球?yàn)镹SCs。

2.2 小檗堿對(duì)NSCs活力影響

正常對(duì)照組和H2O2組細(xì)胞活力分別為(100.0±1.3)%和(58.6±4.5)%，差異有顯著性(P< 0.05)；與H2O2組相比，小檗堿0.5 μmol/L和1 μmol/L細(xì)胞活力升高，分別為(64.8±2.6)%和(65.9±4.2)%，但差異無(wú)顯著性；小檗堿5、10及20 μmol/L細(xì)胞活力分別為(72.4±6.1)%、(74.8±4.5)%、(75.6±3.9)%，與H2O2組相比，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 小檗堿對(duì)NSCs大小影響

對(duì)照組NSCs球平均直徑為(82.1±12.1) μm，H2O2組為(54.2±7.8) μm，與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P< 0.01)。小檗堿組(5 μmol/L)神經(jīng)球直徑為(67.1±9.6) μm，小檗堿組(10 μmol/L)神經(jīng)球直徑為(70.2±10.4) μm，與H2O2組相比，差異有顯著性(P< 0.01)。見(jiàn)圖1。

注：A：對(duì)照組；B：H2O2組；C：小檗堿5 μmol/L組；D：小檗堿10 μmol/L組。圖1 小檗堿對(duì)NSCs增殖的影響Note.A: Control group; B: H2O2 group; C: Berberine group (5 μmol/L); D: Berberine group (10 μmol/L).Fig.1 Effect of berberine on neural stem cell proliferation

2.4 小檗堿對(duì)NSCs增殖率影響

與正常對(duì)照組相比，H2O2組Ki67陽(yáng)性百分率明顯降低(50.3%比21.3%，P< 0.01)；小檗堿(5 μmol/L)處理12 h后相比H2O2組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯增加(38.3%比21.3%，P< 0.01)；DAPT組與小檗堿組相比，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例下降(21.9%比38.4%，P< 0.01)。

2.5 小檗堿對(duì)NSCs中Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H2O2處理后NSCs中Ki67、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平明顯減少(P< 0.01)；與H2O2組比較，小檗堿組(5 μmol/L)細(xì)胞Ki67、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平明顯增加(P< 0.01)。小檗堿組加入Notch通路抑制劑DAPT后，與小檗堿組相比，Ki67、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P< 0.01)，說(shuō)明DAPT拮抗小檗堿神經(jīng)保護(hù)作用。

3 討論

抗氧化系統(tǒng)與氧化系統(tǒng)的失衡，參與神經(jīng)退化、缺血性腦損傷的進(jìn)程。H2O2是氧化過(guò)程中具有很高活性的分子，可以引起細(xì)胞膜破壞及細(xì)胞的凋亡和壞死。成年哺乳動(dòng)物腦損傷后，激活中樞神經(jīng)系室管膜下層和海馬的顆粒下層NSCs再生能力，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)再生替代死亡的神經(jīng)元，從而促進(jìn)組織重建和神經(jīng)功能修復(fù)已成為臨床治療的重要方向[9]。但是內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞遷移到病變區(qū)域進(jìn)行增殖和分化的能力有限，不能使喪失的腦功能完全恢復(fù)，需要進(jìn)行藥物干預(yù)[10]。同時(shí)，外源性NSCs移植途徑通過(guò)分泌高濃度的生長(zhǎng)因子，有助于內(nèi)源性神經(jīng)再生，但是病灶區(qū)域長(zhǎng)期炎癥、缺乏營(yíng)養(yǎng)、氧化攻擊等損傷關(guān)系導(dǎo)致內(nèi)源性NSCs增殖能力下降和外源性NSCs存活率低，極大的阻礙了大腦自身修復(fù)能力[10]。促進(jìn)神經(jīng)再生及分化和減少損傷區(qū)腦細(xì)胞的凋亡是促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵[10 - 11]。

注：A：對(duì)照組；B：H2O2組；C：小檗堿5 μmol/L組；D：DAPT組。圖2 小檗堿對(duì)NSCs增殖蛋白的影響Note.A: Control group; B: H2O2 group; C: Berberine group (5 μmol/L); D: DAPT group.Fig.2 Effect of berberine on the neural stem cell proliferation protein

表1 各組蛋白表達(dá)情況Tab.1 Comparison of Ki67, Notch1, and Hes1 protein expression in each group

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與H2O2組相比，#P< 0.05，##P< 0.01；與小檗堿組相比，&P< 0.05，&&P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the H2O2group,#P< 0.05,##P< 0.01. Compared with the berberine group,&P< 0.05,&&P< 0.01.

注：A：對(duì)照組；B：H2O2組；C：小檗堿5 μmol/L組；D：DAPT組。圖3 小檗堿對(duì)NSCs中Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)影響Note.A: Control group; B: H2O2 group; C: Berberine group (5 μmol/L); D: DAPT group.Fig.3 Effect of berberine on expression of Notch pathway-related proteins in neural stem cells

小檗堿對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療價(jià)值，有抗氧化、抗炎、降低神經(jīng)元凋亡的作用[12]。在本研究中，采用不同濃度小檗堿(0.5、1、5、10、20 μmol/L)處理，當(dāng)濃度增加到5 μmol/L時(shí)，小檗堿可以增強(qiáng)H2O2損傷的NSCs活力，而且隨著小檗堿濃度的增加，細(xì)胞活力無(wú)顯著變化。神經(jīng)球被視為自由浮動(dòng)的一束束NSCs，神經(jīng)球的形成是NSCs不斷增殖的直接體現(xiàn)，因此，可用神經(jīng)球平均直徑反映NSCs的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示5 μmol/L小檗堿處理可以改善損傷細(xì)胞的形態(tài)，改善H2O2產(chǎn)生的增殖抑制作用。

Ki67是與細(xì)胞增殖有關(guān)的核抗原，通過(guò)Western blot方法，與正常對(duì)照組比較，H2O2組Ki67蛋白表達(dá)顯著降低，小檗堿處理可以顯著提高Ki67蛋白表達(dá)，說(shuō)明小檗堿能顯著拮抗H2O2導(dǎo)致的Ki67蛋白表達(dá)的下降。NSCs的自我維持和增殖功能是受Notch信號(hào)途徑的調(diào)控。將Notch通路的抑制劑DAPT運(yùn)用于NSCs的體外培養(yǎng)中，鏡下可見(jiàn)NSCs數(shù)量明顯減少，NSCs生長(zhǎng)過(guò)程中所形成的神經(jīng)球的直徑也明顯減??；過(guò)表達(dá)Notch1、Hes1和Hes5能夠促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和自我更新[13 - 14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2可以抑制Notch1和Hes1蛋白表達(dá)，小檗堿處理后可增強(qiáng)Notch1和Hes1蛋白表達(dá)；而在小檗堿組加入10 μmol/L Notch通路阻斷劑DAPT后，Ki67表達(dá)以及Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均下降，說(shuō)明DAPT可抵消小檗堿的促增殖作用，初步確認(rèn)了小檗堿發(fā)揮促增殖的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路。

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