轉(zhuǎn)錄組-代謝組分析方法及其在藥物作用機(jī)理研究中的應(yīng)用

金玉 李赫健 馮成強(qiáng)

（1. 北京師范大學(xué)中藥資源保護(hù)與利用北京市重點實驗室，北京 1000875；2. 北京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)部，北京 100875）

藥物作用機(jī)理的研究在新藥開發(fā)、提高藥效和評價藥物毒性、指導(dǎo)藥物聯(lián)合治療等方面具有重要作用。目前，研究藥物作用機(jī)理大多靠傳統(tǒng)藥理學(xué)方法［1］，然而這些傳統(tǒng)的策略在研究中具有局限性，主要集中在表觀遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察或僅僅是分子靶點的鑒定等［2］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使用組學(xué)（Omics）這門新興技術(shù)采集生物學(xué)數(shù)據(jù)信息的方法越來越普遍。早期的研究傾向于僅使用一種組學(xué)來分析研究［3-4］，然而，越來越多的對于藥物作用機(jī)理的研究正在利用多組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)手段開展［5-6］。多組學(xué)聯(lián)合分析的主要優(yōu)勢是通過這些整合的數(shù)據(jù)可以更好地分析生物體內(nèi)發(fā)生的細(xì)微變化，為預(yù)測生物體作用功能靶點提供更可靠的數(shù)據(jù)支撐。雖然在不同的文獻(xiàn)中介紹過不同組學(xué)的研究方法，但由于價格低廉等優(yōu)勢，在藥物作用機(jī)理研究中最常用的研究方法是轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析，這種方法和策略在研究藥物作用機(jī)理方面發(fā)揮著重要作用。近年來，許多研究人員利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)對藥物作用機(jī)理進(jìn)行了大量的研究并且取得了一定的成果［6］?，F(xiàn)今，轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析已廣泛用于探索藥物作用機(jī)制的研究，本文主要從轉(zhuǎn)錄組學(xué)概念、代謝組學(xué)概念、轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析概念及聯(lián)合分析的方法出發(fā)，闡述它們在藥物作用機(jī)理研究中的應(yīng)用，目的是探討轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)及其二者聯(lián)合應(yīng)用在藥物作用機(jī)制研究中的策略，從而不僅為今后藥物作用的分子機(jī)理研究提供借鑒與參考，并且希望能夠基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)發(fā)掘新的研究思路與方法。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

在完成人類基因組測序以及許多其他生物基因組測序后［7］，生命科學(xué)進(jìn)入了后基因組時代，功能基因組學(xué)成為了目前研究的主流方法。轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）是功能基因組學(xué)的重要組成部分［8］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究對象是一種細(xì)胞或組織的基因組所轉(zhuǎn)錄出來的RNA的總和，其研究目的是確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)并解釋基因功能，從而揭示藥物在機(jī)體中作用的相關(guān)機(jī)制［9］。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法包括基因芯片技術(shù)（Microarray）和高通量RNA測序技術(shù)（RNA Sequencing，RNA-Seq）［10］等。最初，研究人員通過雜交測序方法將數(shù)千個短DNA片段構(gòu)建成基因芯片，并通過與芯片上的特定位點探針靶向雜交來檢測這些基因的表達(dá)。目前為止，大量的基因芯片研究在人們對生物變化過程的理解方面提供了實質(zhì)性的幫助［11］，然而，由于其雜交靈敏度有限，很難檢測出低豐度的mRNA。另一種轉(zhuǎn)錄譜分析方法是基于高通量測序儀的發(fā)展而出現(xiàn)的RNA-Seq，該方法引入了測序和轉(zhuǎn)錄本數(shù)字化的概念，通過隨機(jī)剪切的短cDNA序列測序，計算mRNA的表達(dá)量。相比于前者，RNASeq對功能基因組研究非常有效，能夠檢測出組織或細(xì)胞樣品內(nèi)全部基因表達(dá)譜。

這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法為解釋生物學(xué)功能中基因表達(dá)差異及尋找藥物在機(jī)體中的作用靶點都提供了有力的技術(shù)支持。Ujihira等［12］通過基因芯片鑒定了11種與他莫昔芬反應(yīng)有關(guān)的小RNA，其中之一是腫瘤抑制miRNA，miR-574-3p。Kim等［13］通過RNASeq研究了嗜油不動桿菌DR1的諾氟沙星耐藥性，分析了用諾氟沙星處理的DR1和DR1之間RNA的差異。以上兩項研究分別用了上述兩種方法，隨著科技發(fā)展，RNA-Seq由于提高了檢測的特異性和準(zhǔn)確性越來越受到學(xué)者們的青睞。轉(zhuǎn)錄組測序雖然可以得到大量差異表達(dá)基因和調(diào)控代謝通路，但由于基因與表型之間很難直接關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致關(guān)鍵的藥物作用信號通路難以確定，因此往往很難達(dá)到預(yù)期的研究目的。

2 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)（Metabolomics）是指定性定量測定活體系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)病理生理刺激或遺傳修飾引起的動態(tài)變化的代謝物質(zhì)［1］，近來廣泛應(yīng)用于藥物毒理機(jī)制，疾病發(fā)生過程和藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域，特別是在新藥開發(fā)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)影響［14-20］。當(dāng)藥物作用時，隨著時間的改變，機(jī)體內(nèi)往往都伴隨著代謝物的微小變化，采用代謝組學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)，不僅可以測定這些微小變化的代謝物，并且通過對比代謝物可以發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)記物。傳統(tǒng)方法如利用生化指標(biāo)對藥物作用方式進(jìn)行評價時，往往只局限于對特定物質(zhì)進(jìn)行檢測而忽略了藥物對機(jī)體的整體影響，難以準(zhǔn)確反映生物系統(tǒng)對藥物作用引起的全面變化，如今利用代謝組學(xué)評價藥物對機(jī)體的作用能夠更加準(zhǔn)確全面的反映生物系統(tǒng)整體的動態(tài)變化，通過對變化的代謝物進(jìn)行測定，可為進(jìn)一步闡明藥物作用的分子機(jī)制提供強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支撐。

代謝組學(xué)分析方法包括核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）［21］、 液 相 色 譜 質(zhì) 譜 聯(lián)用（Liquid chromatograph mass spectrometer，LCMS）［22］、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography mass spectrometer，GC-MS）［23］等。不同技術(shù)其檢測偏向性不同，但不同平臺之間具有互補(bǔ)性。一般來說NMR的靈敏度最低，能檢測并定性的物質(zhì)少于100個，其優(yōu)勢是簡單、無損傷、可定量［24］等。質(zhì)譜的靈敏度大概是NMR的千倍，GC-MS可檢測的物質(zhì)數(shù)量一般為1 000個以上，但由于對樣品要求比較嚴(yán)格，其應(yīng)用受到了一定限制［25］。雖然LC-MS檢測物質(zhì)的數(shù)量要比GC-MS少一些，但由于其避免了對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理等步驟，并且由于能夠方便的對樣本進(jìn)行定性定量分析而深受大眾青睞［26］。近年來越來越多學(xué)者利用代謝組學(xué)手段研究外源物質(zhì)在生物體內(nèi)的作用機(jī)制。王喜軍等［27］通過代謝組學(xué)研究方法輔以生物化學(xué)鑒定方法闡明了茵陳蒿湯對酒精性肝病大鼠具有良好的保肝作用。查偉斌等［28］基于GC-MS檢測技術(shù)的代謝組學(xué)方法，研究銀杏提取物對高脂誘導(dǎo)動脈粥樣硬化引起的代謝紊亂的作用，闡明銀杏提取物抗動脈粥樣硬化效果與其對脂質(zhì)代謝、膽酸合成及氨基酸代謝的調(diào)控密切相關(guān)。

然而，單一代謝組學(xué)方法并不足以闡述生物系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的各種變化，其方法在很大程度上取決于1H-NMR、MS［29］和色譜的發(fā)展，另外，許多學(xué)者傾向?qū)Ｗ⒂谀骋谎h(huán)系統(tǒng)代謝物的分析，但循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的物質(zhì)變化是許多生物系統(tǒng)共同反應(yīng)的綜合結(jié)果，因此通過單一代謝組學(xué)研究并不能獲得對組織內(nèi)產(chǎn)生的具體反應(yīng)機(jī)制的全面闡述。另外，由于目前對代謝物種類分析的局限性，只依靠代謝組學(xué)研究結(jié)果難以對藥物作用機(jī)理進(jìn)行全面的生物學(xué)解釋［30］。

3 轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析方法

隨著高通量測序技術(shù)的完善和各種組學(xué)方法的成熟，不同組學(xué)的組合使用越來越受歡迎，然而研究過程中對于產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是目前面臨的最大挑戰(zhàn)。通過整合不同組學(xué)數(shù)據(jù)來分析比較不同數(shù)據(jù)間的關(guān)系以及闡述綜合數(shù)據(jù)所說明的生物學(xué)問題才是最終研究目的，因此分析這些復(fù)雜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)工具必不可少。轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析（Transcriptome-metabolism conjoint analysis） 中， 有多種數(shù)據(jù)整合分析的方法，包括基于相關(guān)性分析將數(shù)據(jù)結(jié)合的方法、基于級聯(lián)的集成方法、基于多變量整合的分析方法和基于代謝通路數(shù)據(jù)庫來整合分析數(shù)據(jù)的方法，學(xué)者們可以根據(jù)不同的生物學(xué)研究目的確定不同的聯(lián)合分析手段［31］。

3.1 基于相關(guān)性分析將數(shù)據(jù)結(jié)合的方法

通過聯(lián)合分析手段探索多元數(shù)據(jù)的簡單方法之一是尋找數(shù)據(jù)集之間的相關(guān)性。這里有兩種常用的方法，其中最常見的是Pearson’s和Spearman’s相關(guān)分析方法［32］。雖然科學(xué)家們期望通過此種方法找到代謝物與基因之間的關(guān)聯(lián)，然而僅使用這種單一方法往往不足以達(dá)到預(yù)期目的。雖然人們普遍認(rèn)為遵循中心法則的信息流動應(yīng)該符合層層遞進(jìn)的規(guī)律，然而Kuile和Westerhoff［33］發(fā)現(xiàn)mRNA與其相應(yīng)的代謝物之間并不符合預(yù)期的數(shù)量關(guān)系，并且Moxley等［34］也報道了酵母中轉(zhuǎn)錄物和代謝物之間的相關(guān)性非常低。

除了使用Pearson′s或Spearman′s等標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)外，還有Goodman和Kruskal伽馬檢驗［35］，這種分析方法僅考慮每種代謝物或基因的上調(diào)或下調(diào)，如用線性模型僅通過轉(zhuǎn)錄組的變化預(yù)測相應(yīng)代謝物變化趨勢［36］。事實上，直接利用相關(guān)系數(shù)來聯(lián)合分析兩組學(xué)數(shù)據(jù)存在一些潛在問題，分析過程中如果那些已知在路徑上密切相關(guān)的元素不表現(xiàn)出相關(guān)性，則我們需要通過其他的分析方法來給予輔助。

3.2 基于級聯(lián)的集成方法

基于數(shù)據(jù)級聯(lián)的集成方法是最早出現(xiàn)，且最簡單的方法之一，它可將多個組學(xué)數(shù)據(jù)集集合成單一模型。通過將每種組學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表匯總成單個數(shù)據(jù)表，應(yīng)用自組織映射［37-38］、K均值聚類分析［39］或隨機(jī)森林［40］等算法進(jìn)行分析。Daub等［41］介紹了一種在線軟件MetaGeneAlyse，它可以通過運行上述標(biāo)準(zhǔn)方法來針對轉(zhuǎn)錄組-代謝組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分別是從不同的分析技術(shù)中獲得的，其兩組數(shù)據(jù)集大小不一，這意味著數(shù)據(jù)集具有不同的標(biāo)注模式與結(jié)構(gòu)、不同的期望值、不同的底層噪聲分布和不同的方差，因此，從簡單連接的數(shù)據(jù)集中獲得代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系并非易事。當(dāng)對連接的數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類時，來自不同數(shù)據(jù)集的元素將傾向于與其自身數(shù)據(jù)集中的其他元素聚類，從而可能會掩蓋組間關(guān)聯(lián)。

盡管需要進(jìn)行更多的研究來彌補(bǔ)這些局限性，但使用諸如iCluster［42］這樣的工具可將這些問題最小化，這些潛在的分布差異影響可以通過去除信號低甚至沒有信號的元素將噪音的影響最小化。雖然通過預(yù)處理完全消除這些影響是不可能的，但是可以結(jié)合本文中的其他方法對代謝組-轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，其結(jié)果的可信度會更高。

3.3 基于多變量的整合方法

除了前面描述的相對簡單的分析方法外，還可以利用多變量建模的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析。這種方法在用于生物學(xué)分析之前常用于化學(xué)計量學(xué)領(lǐng)域。兩種最常見的多變量分析方法是主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）［43-44］。通過這種分析，研究人員可以利用一個數(shù)據(jù)集來預(yù)測另一個數(shù)據(jù)集并且找到兩個數(shù)據(jù)集之間的“協(xié)方差”關(guān)聯(lián)。與上述分析方法不同的是，這種方法可以將代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集保持在模型內(nèi)的獨立模塊中。

最早利用PLS模型整合代謝組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的是Griffin團(tuán)隊［45］。他們將兩組乳清酸處理大鼠的轉(zhuǎn)錄組與代謝組結(jié)合，用代謝組NMR光譜作為模型的x值，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為待預(yù)測的y值，隨后他們通過模型找出了各種與基因相關(guān)的代謝物。這種建模方法解釋了乳清酸對于大鼠脂肪肝作用的相關(guān)代謝物，同時結(jié)果也表明1H-NMR與基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法有利于挖掘復(fù)雜生物系統(tǒng)中發(fā)生的微小反應(yīng)。這種模型同樣也被Jauhiainen等［46］以類似的方式預(yù)測轉(zhuǎn)錄譜中的相關(guān)代謝譜。在Griffin的方法中必須定義一種數(shù)據(jù)集作為x，事實上這兩個數(shù)據(jù)集在模型中并非等價。因此，這種情況下，我們可以選擇更為泛化的評價方法，稱為O2PLS［47］。正交偏最小二乘法方法（Orthogonal partial least squares，OPLS）是一種新發(fā)展起來的將正交信號校正方法與PLSR進(jìn)行結(jié)合對PLSR進(jìn)行修正的分析方法，而O2PLS是一種泛化的OPLS，可在兩個數(shù)據(jù)矩陣中進(jìn)行雙向建模和預(yù)測。在這個算法中，x和y是等價的，所以無論分配哪個數(shù)據(jù)集作為x或y無關(guān)緊要。Eveillard等［48］用這種方法檢測了內(nèi)二（2-乙基己基）鄰苯二甲酸酯暴露后的人體肝臟轉(zhuǎn)錄物和血漿代謝物。

近年來，Boccard等［49］引入了正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）方法并且對比其他方法檢測了NCI60細(xì)胞系的代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，結(jié)果在所有3個組學(xué)案例中發(fā)現(xiàn)不同組學(xué)數(shù)據(jù)集對于得到一致的生物學(xué)解釋都是有用的。OPLS-DA的主要優(yōu)勢在于它可以處理兩個以上的數(shù)據(jù)集，并可以同時對這些模塊進(jìn)行統(tǒng)一處理，然而，該模型并未提供關(guān)于數(shù)據(jù)集之間相關(guān)性特征的信息，而是將所有數(shù)據(jù)與變量進(jìn)行了對比。

多變量建模用于數(shù)據(jù)集成的選擇有很多種，然而，解釋模型非常復(fù)雜，目前缺乏對不同方法的全面比較，科學(xué)家需要進(jìn)一步評估不同方法對結(jié)果的偏向性，所以未來可以繼續(xù)優(yōu)化不同分析工具，使得其不僅可以運行上述所有方法，并且分析后的結(jié)果更容易解釋。如果這些目標(biāo)得到滿足，那么諸如O2PLS等工具將會成為集成式組學(xué)數(shù)據(jù)分析中的強(qiáng)大組成部分。

3.4 基于通路的聯(lián)合分析方法

由于生物系統(tǒng)反應(yīng)的復(fù)雜性，多組學(xué)的聯(lián)合分析應(yīng)該以生物體內(nèi)的反應(yīng)通路作為研究基礎(chǔ)，而基于通路的聯(lián)合分析方法正是將生物學(xué)知識與轉(zhuǎn)錄組-代謝組結(jié)果相結(jié)合來解釋生物體內(nèi)發(fā)生的變化的方法，其中不同組學(xué)數(shù)據(jù)的整合可以通過以下幾種工具和方法來處理，如線上免費工具KEGG［50］、Wikipathways［51］、Integrated molecular pathway level analysis（IMPALA）［52］、iPEAP［53］和MetaboAnalyst 3.0［54］等都是利用生物學(xué)信號通路為基礎(chǔ)支持不同組學(xué)的聯(lián)合分析。很多研究利用了商業(yè)化的MetaCore（GeneGo Inc.）工具來整合兩組數(shù)據(jù)［55-56］，在MetaCore中，分別從兩個組學(xué)數(shù)據(jù)中取最小P值數(shù)據(jù)來分析代謝物與基因之間的關(guān)系。另一種商業(yè)工具獨創(chuàng)性路徑分析（Ingenuity pathways analysis，IPA）［57］也可用于多組學(xué)集成分析，根據(jù)所有數(shù)據(jù)集中的-log（P值）之和對路徑進(jìn)行分類，相當(dāng)于原始IMPaLA中的P值的獨立組合。其他可用于生物學(xué)關(guān)鍵通路分析的工具有PathVisio［58］、Paintomics［59］、InCroMAP［60］和表達(dá)數(shù)據(jù)分析的整合薈萃分析（Integrative meta-analysis of expression data，INMEX）［61］，這些工具都可以分析出差異表達(dá)基因和代謝物的數(shù)量。除此之外還有其他基于信號通路的分析方法，但每種方法都有各自不同的分析側(cè)重點。

利用基于生物學(xué)反應(yīng)途徑的集成方法中，另一個比較重要的影響結(jié)果的分析因素是背景信息［62］，雖然背景信息中包含檢測到的沒有統(tǒng)計學(xué)意義的物質(zhì)，但是它們對分析也至關(guān)重要，是否分析這些背景信息會帶來不同的差異通路分析結(jié)果。在轉(zhuǎn)錄組中，處理數(shù)據(jù)過程很容易獲得背景列表，然而在代謝組中，很多物質(zhì)檢測不到，并且不同的檢測方法對不同類型的物質(zhì)具有偏好性，一些關(guān)鍵性的分析偏差會影響整個通路分析結(jié)果。例如，NMR容易檢測氨基酸類，所以結(jié)果中氨基酸類物質(zhì)會占較大比例，如果沒有背景信息陳述這種偏好性，涉及氨基酸的途徑將始終位于差異表達(dá)的前列。所以，作為一個中間步驟，建議研究者將其代謝組學(xué)途徑分析中使用的背景信息作為補(bǔ)充信息來參考，這會使最終分析結(jié)果更加具有可信度。然而，基于信號通路途徑的分析方法也有其弊端，由于這種方法理論上全部依賴于預(yù)先研究確定的途徑，隨著數(shù)據(jù)庫的持續(xù)更新，對于還未確定的生物途徑，有時并不能得出相應(yīng)可靠的結(jié)論。

4 轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析在藥物作用機(jī)理研究中的應(yīng)用

隨著高通量測序技術(shù)向各個學(xué)科領(lǐng)域的滲透，利用現(xiàn)代測序技術(shù)手段有效地研究藥物作用機(jī)理成為目前研究的主流發(fā)展方向之一。根據(jù)以往經(jīng)驗普遍認(rèn)為單一的組學(xué)分析對于藥物作用方式的研究不能提供足夠的支撐，因此需要聯(lián)合分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與代謝組數(shù)據(jù)才能對后期進(jìn)一步實驗對象進(jìn)行更加全面的定位［63］。

針對特定的藥物研究其作用機(jī)理，通過轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析的研究方法，對時序表達(dá)的眾多基因與差異積累的代謝物信息進(jìn)行整合分析，能夠使我們所期望得到的機(jī)體內(nèi)微小變化不被生物體內(nèi)在的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所淹沒，后期可結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，從分子層面解釋關(guān)注的生物表型，從而為研究藥物作用機(jī)理提供可靠預(yù)測途徑。Jennen等［64］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)方法研究了環(huán)境致癌物2，3，7，8-四氯二苯并二惡英（2，3，7，8-Tetrachlorodibenzop-dioxin，TCDD）對人類肝癌細(xì)胞系HepG2的相關(guān)RNA和代謝物，發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體信號通路中的SOS1基因及氨基酸、脂質(zhì)代謝和谷胱甘肽代謝過程在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)作用。相比于前期僅使用單一轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)錄組-代謝組整合分析為探討其受體介導(dǎo)機(jī)制提供了更為深入的分析。Zheng等［65］利用轉(zhuǎn)錄組-代謝組方法評估了ADMA對血清不足LoVo細(xì)胞中基因表達(dá)和代謝變化的影響，結(jié)果表明96 h血清不足導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄水平改變大部分通過ADMA恢復(fù)，血清不足誘導(dǎo)的主要信號通路包括癌癥相關(guān)通路、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等；代謝組結(jié)果顯示血清不足顯著抑制TCA循環(huán)，改變葡萄糖和脂肪酸代謝以及核酸代謝。此研究通過兩組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用不僅有效縮小了眾多基因的研究范圍，表明了藥物在細(xì)胞內(nèi)作用的關(guān)鍵途徑及關(guān)鍵基因，并且為今后進(jìn)一步明確藥物作用機(jī)理及相關(guān)基因功能奠定了重要基礎(chǔ)。He等［66］對二甲雙胍處理不同時間的人源性結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析研究，表明在細(xì)胞活力降低前細(xì)胞有明顯的時間依賴性代謝改變，主要涉及的有碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、維生素和核苷酸代謝途徑。除了癌癥信號傳導(dǎo)途徑之外，參與細(xì)胞能量代謝途徑的基因表達(dá)也顯著改變，表明二甲雙胍可能是以時間依賴性的方式在代謝和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝。通過高通量篩選方式，研究者初步建立了藥物作用的可能途徑，今后可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步的深入探究。Yan等［67］通過微觀基因表達(dá)差異-宏觀生物代謝組聯(lián)合分析方法，系統(tǒng)評價了芪鄧明目膠囊對糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制，其不僅采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從整體水平全面反映糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥病理狀態(tài)和藥物干預(yù)下機(jī)體產(chǎn)生的微觀調(diào)控機(jī)制，還采用代謝組學(xué)方法全面系統(tǒng)的研究病理刺激及藥物干預(yù)對機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的影響，將差異表達(dá)基因與篩選鑒定出的11個潛在生物標(biāo)志物有效的進(jìn)行了前后印證，為未來藥物作用機(jī)制研究提供了可行的策略。

由于宏觀上藥物作用靶點和作用機(jī)制的多樣性及基因和代謝作用的多樣性，轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析會在分子水平上豐富整個藥理作用研究體系。無論是新藥開發(fā)還是已有藥物作用機(jī)理的研究，一個關(guān)鍵問題需要解決，即逐步從分子水平到代謝物水平上研究解決藥物發(fā)生作用的機(jī)制，而其中通過轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析具有很強(qiáng)的說服力。在新藥研究領(lǐng)域，可在開始研究階段同時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合研究，這將會為今后的進(jìn)一步研究增添更多的方法和內(nèi)容，在藥物作用機(jī)理研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)質(zhì)的飛躍。

5 展望

系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，在某種程度上改變了人們研究藥物作用機(jī)理的方式，因為組學(xué)方法揭示了藥物可能作用的所有潛在機(jī)制。在改進(jìn)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的可獲得性和可應(yīng)用性方面，研究者們已經(jīng)取得了重大進(jìn)步［68］，但是，轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析手段在應(yīng)用中仍然有其局限性。由于高通量篩選，兩個組學(xué)聯(lián)合分析方法會產(chǎn)生大量的復(fù)雜數(shù)據(jù)，目前的分析手段仍然難以滿足科學(xué)家們的分析需求，如何保證靈敏度和準(zhǔn)確性是個難題。首先，由于轉(zhuǎn)錄物和代謝物存在于生物體的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，代謝物和基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)和強(qiáng)度在不同實驗條件下變化很大［33-34］；其次，單一的組學(xué)分析會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，其中不排除固有的噪音和方差結(jié)構(gòu)［62］，在分析時不容易找出真正起作用的關(guān)鍵點。但是轉(zhuǎn)錄組-代謝組即不同的數(shù)據(jù)集聯(lián)合分析會有很多互補(bǔ)的信息內(nèi)容，因此綜合分析多組學(xué)數(shù)據(jù)比單獨分析更容易揭示潛在的生物學(xué)問題。

對比以上4種聯(lián)合分析方法，在生物學(xué)研究中基于生物學(xué)途徑的分析方法是最為直觀也是最可取的，并且它可以為解釋數(shù)據(jù)提供充足的相關(guān)信息。然而，因為這種方法是基于現(xiàn)有的知識水平加以分析數(shù)據(jù)，所以我們不能將此用于發(fā)現(xiàn)新的基因-代謝物之間的關(guān)聯(lián)，因此為探索這些潛在的未知關(guān)聯(lián)，還需要后續(xù)其他生物學(xué)實驗加以支撐和補(bǔ)充。未來，需要進(jìn)一步開發(fā)能夠處理大型、復(fù)雜、高維數(shù)據(jù)和稀有生物領(lǐng)域知識的方法，以有效整合當(dāng)前和下一代組學(xué)平臺生成的大量生化信息，并且需要先進(jìn)的易于應(yīng)用和記錄的統(tǒng)計方法予以配合，以便獲得科學(xué)界的廣泛采用。

隨著多種技術(shù)逐步實現(xiàn)更高的吞吐量并擴(kuò)大覆蓋范圍和復(fù)雜性，復(fù)雜數(shù)據(jù)分析的瓶頸將越來越多地轉(zhuǎn)向有效的集成和解釋。為滿足這種需求，進(jìn)一步發(fā)展目前使用的數(shù)據(jù)集成系統(tǒng)越來越有必要。另外，由于組學(xué)研究的結(jié)果往往缺乏足夠的特異性，因此，這些不同的組學(xué)方法可以進(jìn)行組合使用，使之相輔相成［69-70］。目前，在研究藥物作用機(jī)制領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析吸引了一大批研究人員的注意力，其潛在社會價值和經(jīng)濟(jì)效益也日益得到重視，隨著組學(xué)技術(shù)使用的普遍性與分析技術(shù)上的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析方法在研究藥物作用機(jī)制領(lǐng)域中的應(yīng)用將會繼續(xù)擴(kuò)大，正確利用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)合理地解釋藥物作用機(jī)制相關(guān)問題，必將推動藥物研究進(jìn)程，并且這種方法會逐步適應(yīng)發(fā)展的需求。在不久的將來，多組學(xué)聯(lián)合分析將推動藥物開發(fā)及其作用機(jī)理的闡釋進(jìn)入新時代。