食品中黃曲霉毒素檢測的樣品前處理技術(shù)研究進展

張 萍， 彭西甜， 馮鈺锜

(1.六盤水師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，貴州六盤水 553004;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；3.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 概述

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一類由黃曲霉菌(Aspergiuusflavus)和寄生曲霉菌(Aspergiuusparasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的總稱[1]。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20多種，其中已分離鑒定出的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1、M2等18種[2]。常見污染農(nóng)產(chǎn)品的主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，其中M1和M2是哺乳動物食用了黃曲霉毒素污染的飼料所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因此常見于動物源性食品和牛奶中[3 - 5]。

黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，其中B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，它的毒性和致癌性最強?993年，世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)(IARC)將黃曲霉度毒素B1、B2、G1和G2劃定為Ⅰ類致癌物質(zhì)，將M1劃定為Ⅱ類致癌物質(zhì)(人類疑似致癌物質(zhì))。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。因此，根據(jù)人們對食品的攝入情況，世界各國紛紛制定食品中黃曲霉毒素的衛(wèi)生限量標準加以控制。我國國家標準(GB 2761-2011)《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定：花生、玉米及其制品等食品中黃曲霉毒素B1的限量標準為20 μg/kg，在稻谷、大米、糙米及食用油類(花生油除外)中為10 μg/kg，在堅果、調(diào)味品及豆制品等其他食品至黃曲霉毒素B1含量不得超過5 μg/kg，在特殊膳食用食品中限量標準為0.5 μg/kg。黃曲霉毒素的毒性很高，各國政府及相關(guān)國際組織制定的黃曲霉毒素限量標準很低，同時食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，這對黃曲霉毒素的檢測方法提出了很高的要求。因此，為了預(yù)防和控制黃曲霉毒素對食品的污染，保障人們的身體健康，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐，加強黃曲霉毒素檢測方法的研究具有重要的意義。

2 黃曲霉毒素檢測方法研究現(xiàn)狀

目前，食品中黃曲霉毒素的檢測方法有很多，主要有薄層層析法(TLC)[6]、熒光光度法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[9]以及電化學(xué)免疫傳感器法[10 - 11]等。TLC法易受雜質(zhì)干擾，靈敏度、精密度和重現(xiàn)性不好，一般用于黃曲霉毒素的初步定性檢測[6]。ELISA法靈敏度高、特異性強、成本低、快捷，適合于大批量樣品的檢測，但重復(fù)性較差、假陽性概率較高[12 - 13]。HPLC法在黃曲霉毒素的檢測中應(yīng)用最為廣泛，具有分析效果好、靈敏度高、分析速度快、選擇性好等優(yōu)點。HPLC法通常使用熒光檢測器(FLD)，而B1和G1分子二呋喃結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，致使分子熒光強度減弱，影響方法靈敏度，但可通過衍生增強熒光強度。目前，常采用的衍生方法有三氟乙酸(TFA)柱前衍生法[14 - 15]、碘柱前衍生法[16]、碘柱后衍生法[17 - 19]、光化學(xué)柱后衍生法[20]、電化學(xué)柱后衍生法[21]、溴柱后衍生法[22]。HPLC法的柱前或柱后衍生分析時間長、步驟多，干擾較多，易出現(xiàn)假陽性。HPLC-MS/MS法是一種集高效分離及多組分定性、定量于一體的聯(lián)用技術(shù)，在HPLC法優(yōu)點的基礎(chǔ)上無需衍生化即可進行檢測，而隨著同位素內(nèi)標的商品化，使得檢測結(jié)果更加準確可靠，但是質(zhì)譜儀器價格昂貴，檢測成本較高[23 - 24]。

3 食品中黃曲霉毒素檢測的樣品前處理方法

3.1 液-液萃取

楊琳等[25]將糧谷類食品樣品經(jīng)甲醇-水溶液(80∶20，V/V)提取，然后用三氯甲烷液-液萃取(LLE)凈化富集，用三氟乙酸衍生后熒光檢測，4種黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的檢出限分別為0.06、0.03、0.18、0.05 μg/kg，在玉米、大米、小麥3類樣品中加標回收率在71.73%～115.37%之間，相對標準偏差為3.00%～9.88%。彭志兵等[26]比較了二氯甲烷和三氯甲烷兩種萃取劑，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷萃取樣品中黃曲霉毒素的加標回收率較高，采用LLE凈化的前處理方法，建立了用甲醇-乙腈-水(40∶5∶55，V/V)流動相體系分離黃曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)，HPLC法測定糧食樣品中黃曲霉毒素的新方法，在不同加標水平的回收試驗中，回收率為80.3%～97.0%，相對標準偏差為2.1%～4.0%。然而，LLE通常使用大量有機溶劑，在目前黃曲霉毒素的常規(guī)分析中應(yīng)用較少。

3.2 固相萃取

固相萃取(SPE)可同時完成樣品的富集與凈化，比LLE快，節(jié)省溶劑，重現(xiàn)性好。畢瑞峰等[27]把腰果樣品用甲醇-水(8∶2，V/V)溶液提取后用弗羅里硅土柱凈化，HPLC-MS/MS法檢測其中的4種黃曲霉毒素。王恒玲等[28]以二氧化硅-氧化石墨烯復(fù)合物為SPE材料，建立了植物油中黃曲霉毒素B1、B2的HPLC檢測方法。蔡增軒等[29]將花生及其制品經(jīng)一種自制的混合SPE柱純化，超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測，可對其中的6種黃曲霉毒素同時進行定性定量分析。付朝暉等[30]用二氯甲烷提取發(fā)酵茶中黃曲霉毒素，提取液經(jīng)濃縮后，用氰基鍵合硅膠SPE小柱凈化，UPLC-UV法檢測。

多功能凈化柱(Multifunctional Cleanup Column，MFC)是一種特殊的SPE柱，可選擇性吸附樣品溶液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，而黃曲霉毒素不被吸附。MFC的操作簡便，不需要進行活化、淋洗和洗脫操作只需直接上樣，凈化效果理想，但是沒有富集的作用。根據(jù)多功能柱填料的不同，又分為僅用于凈化黃曲霉毒素和可凈化多種霉菌毒素兩大類。宋月等[31]采用PriboFast M228型多功能柱凈化，建立了玉米和花生中黃曲霉毒素的光化學(xué)衍生，HPLC-FLD檢測方法和UPLC-MS/MS檢測方法。萬青云等[32]采用可凈化黃曲霉毒素的Mycosep 226多功能凈化柱，建立了三氟乙酸(TFA)柱前衍生，加壓毛細管電色譜-激光誘導(dǎo)熒光(Pressurized Capillary Electrochromatography-Laser-Induced Fluorescence，pCEC-LIF)快速測定花生醬中黃曲霉毒素的方法。王瑞國等[33]運用可凈化多種霉菌毒素的Mycospin 400型多功能凈化柱，建立了同時檢測玉米、豆粕中黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等26種霉菌毒素的LC-MS/MS方法。劉柱等[34]對Mycosep 113、Mycosep 226、Mycosep 228和Waters HLB柱4種多功能柱的凈化效果進行了考察，發(fā)現(xiàn)Mycosep 228型多功能凈化柱對玉米和花生中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和展青霉素9種真菌毒素有非常好的凈化效果，建立了MFC-HPLC柱后光化學(xué)衍生的黃曲霉毒素檢測方法。

3.3 免疫親和柱

免疫親和柱是一種特殊的固相萃取柱，其吸附劑的功能團不同于常規(guī)的化學(xué)官能團，而是特異性抗體，利用抗原與抗體免疫反應(yīng)的原理，高選擇性地吸附上樣溶液中的目標物，具有高親和力、高專一性和可結(jié)合的特點。目前，免疫親和柱凈化被廣泛應(yīng)用于植物油及糧谷類[35 - 39]、中藥材及中成藥類[40 - 45]、牛奶類[46 - 48]及其他食品[49 - 50]等中黃曲霉毒素的檢測。

隨著人們對多種真菌霉素檢測的需求，可同時高效準確處理多種毒素的復(fù)合免疫親和柱的應(yīng)用日益廣泛。Wilcox等[51]建立了食品(黑麥粉、玉米、早餐麥片、全麥面包)中不同免疫親和柱的組合，對特定的多種真菌毒素進行凈化，所得結(jié)果可以滿足歐盟成年人和嬰兒食品中多種毒素檢測的限量標準要求。孫雪等[52]建立了動物源性食品(豬肉、魚肉、豬肝)中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類真菌毒素的復(fù)合免疫親和柱凈化，HPLC-MS/MS檢測方法。

盡管免疫親和柱對黃曲霉毒素具有很好的選擇性，然而其同時也存在溫度穩(wěn)定性差、價格昂貴、檢測成本高的問題，在實際應(yīng)用中也受到了一定的限制。

3.4 其他樣品前處理方法

3.4.1基質(zhì)固相分散基質(zhì)固相分散(Matrix Solid-Phase Dispersion，MSPD )是一種快速樣品處理技術(shù)，該技術(shù)通過將固體、半固體以及粘稠性樣品與固相分散劑一起放入玻璃研缽中輕輕研磨，樣品組織結(jié)構(gòu)被研磨的剪切力破壞后，樣品基質(zhì)分散在固體分散劑的表面，然后將得到的混合物轉(zhuǎn)移到固相萃取空柱中用適當?shù)娜軇⒛繕嘶衔锵疵撓聛?。MSPD濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，避免了樣品的損失，但該技術(shù)需由操作者在研缽中混合，不能完全自動化，適用于多藥物的殘留分析[53]。

Hu等[54]利用中性氧化鋁與石墨化炭黑基作為MSPD的吸附劑，電化學(xué)衍生，熒光檢測測定了深色食品(辣椒粉、綠豆、黑芝麻)中黃曲霉毒素的含量，并與免疫親和柱凈化法做了比較，不存在顯著性差異。朱閏月等[55]采用C18作為吸附劑，結(jié)合MSPD技術(shù)，建立了雞蛋中包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2在內(nèi)的15種真菌毒素生物標志物的同時定量分析方法。

3.4.2凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatography，GPC)根據(jù)溶質(zhì)(被分離物質(zhì))分子量大小不同而達到分離目的。GPC具有凈化容量大、可重復(fù)使用、適用范圍廣、自動化程度高等特點，但其存在分離不完全，常常還需要結(jié)合其他的樣品前處理技術(shù)，同時存在有機溶劑消耗大的缺點。劉柱等[56]提出了填料為Bio-Beads SX3(中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球體)的凝膠滲透色譜凈化和柱后光化學(xué)衍生-HPLC法測定食用油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等9種真菌毒素。段兵等[57]建立了用Bio-Beads SX3為填料的GPC凈化，結(jié)合UPLC-MS/MS法測定牛奶中黃曲霉毒素M1的方法。王浩等[58]以乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1，V/V)提取植物油樣品，GPC凈化，HPLC-MS/MS法檢測，建立了植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和苯并芘的分析方法。

3.4.3免疫磁珠免疫磁珠凈化(Immunomagnetic Microbeads，IMBs)是20世紀80年代出現(xiàn)的新方法。這一方法的核心是在磁珠表面包被具有免疫反應(yīng)性的抗體進行抗原抗體反應(yīng)，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而達到分離的目的[59]。雷方等[60]用NaIO4將抗體Fc段的糖殘基氧化生成醛基，與磁珠上的氨基共價偶聯(lián)，實現(xiàn)抗體在磁珠上的定向固定化。以該方法同時偶聯(lián)多種抗體，獲得定向固定多種真菌毒素抗體的免疫磁珠，進而對其親和性能及使用條件進行詳細表征和優(yōu)化，建立了免疫磁珠親和純化-UPLC-MS/MS法檢測小麥中多種真菌毒素。邢言言等[61]將N-羥基丁二酰亞胺鍵合磁珠與抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體偶聯(lián)，得到了黃曲霉毒素總量免疫磁珠，其具有較好的分散性，良好的磁性能和特異的選擇性。劉偉偉等[62]利用化學(xué)共沉淀方法，制得了主要成分為Fe3O4的超順磁性納米磁珠，與氨丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)而帶上氨基基團，然后通過戊二醛活化后發(fā)生醛基化，與黃曲霉毒素B1多克隆抗體偶聯(lián)得到黃曲霉毒素B1免疫磁珠，利用該免疫磁珠為凈化工具，建立了譜檢測植物油中黃曲霉毒素B1 HPLC法。

3.4.4QuEChERS法QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法是近年發(fā)展的一種用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù)，由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授等[63]于2003年首次提出。該方法采用單一溶劑乙腈提取，無水MgSO4和NaCl鹽析分層、分散固相萃取劑N-丙基乙二胺(PSA)凈化的快速樣品前處理方法，具有快速、簡單、廉價、有效、可靠及安全的特點。由于該方法的顯著優(yōu)勢，近年來在植物源性及動物源性食品中的獸藥、真菌毒素、食品添加劑等殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛[64]。

Tamura等[65]將啤酒類樣品經(jīng)乙腈提取后加入NaCl、無水Na2SO4和檸檬酸鈉凈化，利用改良的QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定了啤酒中包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2在內(nèi)的15種真菌毒素的含量。陳慧菲等[66]優(yōu)化了QuEChERS方法的鹽析包，建立了改進的QuEChERS方法結(jié)合UPLC-MS/MS測定谷物樣品中的8種真菌毒素的方法。蘇碧玲等[67]將嬰幼兒輔助食品樣品經(jīng)乙腈-水-乙酸提取后，采用含有C18、弗羅里硅土及無水MgSO4的QuEChERS凈化管中凈化，UPLC-MS/MS法檢測，建立了嬰幼兒谷類輔助食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等12種真菌毒素的分析方法。郭禮強等[68]使用QuEChERS方法，考察了中性氧化鋁(Alumina-N)、石墨炭黑粉(GCB)、C18、PSA和氨丙基硅膠5種凈化材料對干腌火腿中15種真菌毒素(含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2)的回收率的影響，發(fā)現(xiàn)C18對15種真菌毒素的吸附影響較小，結(jié)合譜庫檢索建立了干腌火腿中15種真菌毒素的快速LC-MS/MS檢測方法。

4 直接分析

隨著質(zhì)譜等高性能分析儀器的發(fā)展，可以將提取液不經(jīng)凈化直接進樣分析，大大提高了整個分析過程的效率?；|(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，ME)是影響HPLC-MS/MS定量的準確性和精密度最重要的因素，它是指提取中共留組分在檢測過程中對目標分析物的離子化效率產(chǎn)生影響。從基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的機制可以看出，通過優(yōu)化質(zhì)譜的各種參數(shù)，在最大程度上提高各種真菌毒素的離子化效率，增強其與樣品的共留組分在離子源離子化時的競爭力，是一種克服基質(zhì)效應(yīng)可行的方案。王芹等[69]將面粉樣品粉碎后，經(jīng)乙腈-水(84∶16，V/V)提取，提取液直接濃縮定容后，濾液經(jīng)Agilent Poroshell120ec-C-(18)反相色譜柱分離，以0.1%甲醇-甲酸水溶液作為流動相,梯度洗脫分離4種黃曲霉毒素，對質(zhì)譜檢測條件進行了優(yōu)化，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2呈現(xiàn)較好的響應(yīng)，減少了黃曲霉毒素質(zhì)譜檢測的基質(zhì)效應(yīng)。

稀釋法是一種克服基質(zhì)效應(yīng)的有效手段，雖然它在一定程度上會降低LC-MS/MS法的靈敏度，但它能夠有效減少干擾組分的濃度，提高目標分析物離子化的競爭力，具有檢測成本低、分析速度快和操作簡便等優(yōu)點，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品中真菌毒素的檢測。鄭潤生等[70]采用稀釋法，并通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，成功克服苦杏仁的基質(zhì)效應(yīng)對整個分析過程的干擾，建立了一種可對苦杏仁污染黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2進行大量篩查及檢測的HPLC-MS/MS方法，并與Mycosep 226型凈化柱純化的方法做了對比，回收率與準確度均高于凈化柱純化方法。然而，稀釋法沒有直接去除共存組分，長期使用該方法可能會對質(zhì)譜等檢測系統(tǒng)造成污染；同時，樣品化學(xué)成分復(fù)雜多樣，目標物檢測靈敏度高低不一，可能會限制稀釋法的應(yīng)用范圍。

同位素內(nèi)標法不僅可以減小、甚至抵消真菌毒素在離子化效率上的改變，還能消除樣品在前處理過程中的操作誤差，從而提高整個HPLC-MS/MS檢測方法的穩(wěn)定性，因此近年來也是一種應(yīng)用相當廣泛的方法。曹婭等[71]采用同位素內(nèi)標稀釋法，建立了大米、小麥和大豆中8種真菌毒素的HPLC-MS/MS分析方法。但是，該方法存在以下缺點：同位素內(nèi)標的的價格比較昂貴，依靠一個同位素內(nèi)標的校正很難消除全部真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)的差異，檢測成本過高，不利于大批量樣品的檢測。因此，在實際大批量樣品檢測中，其可行性比較低。

5 結(jié)語

黃曲霉毒素作為真菌毒素中的一種高毒性物質(zhì)，可以通過污染多種作物進而進入到食品當中，嚴重威脅到人類的健康。盡管色譜、質(zhì)譜分離檢測系統(tǒng)的性能得到了很大的改善，但高效的樣品前處理技術(shù)對于獲得可靠的檢測數(shù)據(jù)來支持食品安全的監(jiān)管非常重要。目前，對于復(fù)雜食品中黃曲霉毒素的樣品前處理技術(shù)，吸附劑凈化富集的相關(guān)技術(shù)(例如SPE、免疫親和柱、QuEChERS方法等)溶劑消耗少、僅僅使用一次性的化學(xué)品或吸附劑，已經(jīng)逐步取代傳統(tǒng)的樣品前處理方法(例如溶劑消耗大的GPC法和LLE法)，多種凈化技術(shù)的聯(lián)合運用與多種黃曲霉毒素的同時檢測是目前研究的熱點。黃曲霉毒素分析的樣品前處理技術(shù)逐漸向自動化、更高的樣品分析通量、更少的溶劑使用量的方向發(fā)展。隨著各國對食品安全愈加重視，食品安全標準也越來越嚴格，開發(fā)高效快速的樣品前處理技術(shù)，提高分析的準確度，降低檢測成本，最終實現(xiàn)在日常檢測中的應(yīng)用，具有深遠的意義。

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