毛細管電色譜-激發(fā)誘導熒光檢測動物性食品中多肽類抗生素

雷霄云,　宋云萍,　李茜諾,　張冰宇,　吳曉蘋(福州大學化學學院, 食品安全與生物分析教育部重點實驗室, 福建 福州 350108)

多肽類抗生素(peptide antibiotics, PTs)是衍生自氨基酸的一類抗生素的總稱,主要作為藥物飼料添加劑以促進動物生長及治療畜禽疾病。隨著動物養(yǎng)殖生產(chǎn)對獸藥飼料依賴程度的提高,多肽類抗生素的安全性引起了人們的廣泛關注。研究表明,PTs易殘留于動物體內(nèi),并通過動物源性食品在人體富集,對腎、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的毒性[1,2]。獸用PTs均為環(huán)狀肽類,歐盟、日本、美國、澳大利亞等均規(guī)定了牛奶中多種PTs的限量值[3],主要包括桿菌肽A(100～400 μg/kg)、粘桿菌素(10～50 μg/kg)及維吉尼霉素(10 μg/kg)等;我國也規(guī)定了牛奶中桿菌肽A和粘桿菌素的限量值(500和50 μg/kg)。

常用于PTs快速篩檢的分析方法有微生物法[4]、免疫分析法[5]等,但其選擇性和定量能力相對較低。高效液相色譜法(HPLC)[6-10]是獸用PTs主要的分離分析方法,由于多數(shù)PTs結(jié)構(gòu)中缺乏發(fā)色團,相關組分眾多,甚至在一個分子中含有同一氨基酸的兩種構(gòu)型[11],導致分離困難,且UV檢測器的靈敏度無法滿足PTs殘留限量的檢測需求,一般需要使用造價昂貴的質(zhì)譜檢測儀[12]。我國國家標準方法[13]采用梯度洗脫的LC-MS/MS法測定牛奶、奶粉或豬肉、豬肝和豬腎中的桿菌肽以及飼料中的硫酸粘桿菌素[14],但是方法的預處理操作繁瑣、使用成本高,限制了其實際生產(chǎn)應用。因此發(fā)展簡便、選擇性和靈敏度高、成本低的多肽類抗生素分析新技術十分必要。

毛細管電色譜兼具高效液相色譜和毛細管電泳的雙重分離機制[15],對中性物質(zhì)和帶電物質(zhì)均可分離,尤其是結(jié)合靈敏度與選擇性極強的激光誘導熒光(LIF)檢測技術,檢出限可達到10-15g甚至10-18g水平,對于樣品中痕量甚至超痕量殘留藥物的分析具有很好的應用前景[16]。LIF檢測中,針對目標物建立的高效衍生方法是決定方法選擇性和靈敏度的主要因素。然而,目前尚缺乏有關多肽類抗生素熒光衍生方法的研究。苯并呋咱類熒光衍生試劑克服了一般衍生反應耗時、衍生副產(chǎn)物多、衍生效率低等缺點,為痕量或超痕量物質(zhì)標記提供了新方向。4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱(NBD-F)是一種與伯胺、仲胺反應速度較快的高效苯并呋咱類衍生試劑[17],常用于氨基酸和小分子胺的衍生和檢測[18]。Aoyama等[19]以NBD-F為柱前衍生試劑,結(jié)合HPLC-熒光檢測(FD)分析了大鼠血漿中的氨基酸,檢出限可達2.8～20 fmol; Zhang等[20]采用NBD-F熒光衍生結(jié)合毛細管區(qū)帶電泳(CZE)-LIF聯(lián)用技術,快速靈敏地分離檢測了食品中的精胺和組胺;Carlucci等[21]以NBD-F熒光衍生結(jié)合HPLC-二極管陣列檢測(PDA)-FD聯(lián)用技術檢測人胰液樣品中奧曲肽和加貝酯等藥物的含量,檢出限為0.025～0.05 μg/mL; Wu等[22]在聚合物整體柱上采用LC-FD方法,在6 min左右分離了精氨酸等氨基酸對映體的NBD-F熒光衍生產(chǎn)物。但是目前尚未見有關NBD-F衍生化多肽類抗生素的報道。

本文將CEC-LIF聯(lián)用技術應用于多肽類抗生素的分析,以NBD-F為柱前熒光衍生試劑,發(fā)展了多肽類抗生素高效的衍生方法。通過優(yōu)化影響電色譜分離與LIF檢測的實驗條件,建立了環(huán)狀多肽類抗生素的CEC-LIF分析方法,并將其應用于牛奶和飼料樣品的檢測,方法簡單,樣品和溶劑耗量小,成本低,靈敏度滿足我國對多肽類獸藥的殘留檢測要求。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

自組裝毛細管電色譜分析系統(tǒng)[23],包括TriSep-2010型微流控系統(tǒng)、±30 kV高壓電源(上海通微分析技術有限公司)、LC-10 ADvp高壓液相色譜泵(日本島津公司)和半導體泵浦式激光誘導熒光檢測器(中國科學院大連化學物理研究所); Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安公司); HB-031金屬恒溫加熱器(上海申能博彩生物科技有限公司); WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司); Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL,美國Waters公司); 0.22 μm微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)。

桿菌肽(BAT, 60 U/mg,比利時Acros Organics公司)、硫酸多粘菌素B(PLM-B, 6 000 U/mg,美國Sigma公司)、硫酸粘桿菌素(CLS, 15 000 U/mg,美國Sigma公司)。NBD-F(純度99%,日本東京化成工業(yè)株式會社);磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO453H2O)(分析純,中國(上海)化學試劑研究所);乙腈和甲醇(色譜純,上海國藥集團化學試劑有限公司)。其他試劑均為分析純;分析用水為Milli-Q(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ5cm)。牛奶和飼料樣品分別購自福州市大學新區(qū)某大型超市和飼料商店。

分別用超純水配制質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的桿菌肽、多粘菌素B和粘桿菌素標準儲備液,于-20 ℃避光保存,使用時用流動相稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。用乙腈溶解并配制10 mmol/L的NBD-F儲備液,于-20 ℃避光保存,使用時用乙腈稀釋至所需濃度。

1.2　樣品前處理

稱取5 g牛奶或飼料樣品于50 mL離心管中,分別加入20 mL含4% (v/v)乙酸鉛和4% (v/v)三氯乙酸的水溶液,超聲提取30 min后,以4 000 r/min離心15 min,移取上清液,待凈化。

將上述所得樣品提取液轉(zhuǎn)移至Oasis HLB固相萃取柱,固相萃取柱分別用6 mL甲醇和水依次活化后上樣,首先棄去流出液,然后用6 mL水洗滌,棄去流出液,用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液并于40 ℃氮氣吹干。殘余樣品用1.0 mL流動相溶解混勻,用0.22 μm有機濾膜過濾,然后用于熒光衍生與CEC-LIF分析。

1.3　多肽類抗生素的熒光衍生反應

取3種5 μg/mL的多肽抗生素混合溶液200 μL,加入乙醇200 μL和硼酸緩沖液(pH 7.5, 50 mmol/L)200 μL,再加入200 μL含NBD-F(1 mmol/L)的乙腈溶液,振蕩混勻,于60 ℃金屬浴中避光衍生反應45 min,冷卻至室溫,即可得到熒光衍生化樣品;另取200 μL乙醇和400 μL硼酸緩沖液(pH 7.5, 50 mmol/L),加入200 μL含NBD-F(1 mmol/L)的乙腈溶液,在同樣條件下進行衍生,作為試劑空白。衍生化樣品用流動相稀釋至所需濃度,用于CEC-LIF分析。

1.4　色譜條件

色譜柱:苯基毛細管電色譜填充柱(100 μm i. d.,總長45 cm,有效長度25 cm, 粒徑3 μm,蘇州環(huán)球色譜有限公司);流動相:乙腈-K2HPO4-KH2PO4緩沖液(10 mmol/L, pH 5.0)(55∶45, v/v);等度洗脫;流速:0.02 mL/min;分離電壓:-10 kV;輔助壓力:3.8 MPa; LIF檢測器波長:λex/λem=473 nm/530 nm。流動相在使用前超聲脫氣30 min;每天進樣前,先用流動相平衡電色譜柱系統(tǒng),直至獲得穩(wěn)定的電流和基線信號;每次更換流動相也需用流動相平衡至基線穩(wěn)定。

2　結(jié)果和討論

2.1　熒光衍生反應條件的優(yōu)化

多數(shù)環(huán)狀多肽類抗生素分子本身沒有發(fā)色團,紫外吸收較弱,存在D-氨基酸及其對映體,整體結(jié)構(gòu)具有空間立體位阻,結(jié)構(gòu)復雜,且在實際動物性樣品中的殘留在痕量級,一般的紫外檢測器難以實現(xiàn)限量測定。但是PTs結(jié)構(gòu)中含有氨基、羧基和羥基,可以采用熒光衍生。作為新一代的苯并呋咱類熒光試劑,NBD-F相較于NBD-Cl而言,熒光衍生效率高,衍生速度快,可與伯胺、仲胺反應生成具有較強熒光的產(chǎn)物。因此實驗選擇NBD-F作為PTs的熒光衍生試劑,具體的衍生原理見圖1。

圖 1　NBD-F衍生含氨基化合物的原理圖Fig. 1　Schematic diagram of derivatization for amino-containing compounds with NBD-FNBD-F: 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole.

2.1.1衍生試劑NBD-F濃度的選擇

在進行熒光衍生反應時,需加入適量的衍生試劑來保證目標物反應完全,使衍生效率達到最大。但過量的衍生試劑將增大背景干擾,導致分離效率降低,無法準確定量。研究表明,當NBD-F濃度為0.1～3.0 mmol/L時,隨著NBD-F濃度的增加,PTs的衍生效率逐漸提高,并在1.0 mmol/L時達到最大值,表明衍生反應基本完全;繼續(xù)增大NBD-F濃度,將導致衍生試劑和水解產(chǎn)物殘留,熒光效率不再增加。因此選擇1 mmol/L的NBD-F進行下一步實驗。

2.1.2衍生反應pH值的選擇

NBD-F衍生化氨基的反應通常在堿性條件下進行,而多肽類抗生素在弱酸性條件下才能穩(wěn)定。在50 mmol/L的硼酸緩沖液中,考察了反應介質(zhì)的pH值在6.5～8.9范圍內(nèi)對多肽類抗生素NBD-F衍生反應的影響。在pH 6.5～7.5范圍內(nèi),隨著pH值的增大,反應體系的堿性增強,增加了NBD-F與PTs親核反應的概率,熒光響應有顯著提高,當pH值為7.5時達到最大;繼續(xù)增大pH值,此時目標物不穩(wěn)定易分解,造成衍生效率下降,副產(chǎn)物增多。因此將反應介質(zhì)的pH值設為7.5。

2.1.3衍生反應時間的選擇

適當增加NBD-F衍生的反應時間有助于熒光衍生效率的提高。考察了反應時間對PTs衍生反應的影響。隨著衍生反應時間的延長,衍生產(chǎn)物的色譜峰面積不斷增加,當反應進行到45 min時,抗生素衍生產(chǎn)物的熒光響應達到最大值,繼續(xù)延長衍生反應時間容易使衍生試劑水解產(chǎn)物增多,干擾分析。因此將衍生反應時間設為45 min。

2.1.4衍生反應溫度的選擇

多肽類抗生素在高溫下會迅速降解。為了保證分析物的穩(wěn)定性,試驗在45～75 ℃之間考察衍生反應溫度對NBD-F衍生效率的影響。當溫度較低時,NBD-F與PTs的反應概率較小,熒光衍生效率較低,隨著反應溫度逐漸加大,衍生效率逐漸增加,60 ℃時,產(chǎn)物的熒光效率達到最大;再增大反應溫度會增加熒光分子與溶劑分子相互碰撞淬滅的概率,使熒光量子產(chǎn)率變小,而且溫度過高會產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物,干擾對目標物的分離分析。因此最終將衍生反應溫度設為60 ℃。

2.2　色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

多肽類抗生素衍生自氨基酸,結(jié)構(gòu)中的伯胺基團易與傳統(tǒng)C18填料中的殘余硅醇基發(fā)生強烈的相互作用,導致峰拖尾或峰形異常,因此實驗采用不含硅醇基的苯基填充色譜柱為固定相，以獲得較好的峰形。

實驗還發(fā)現(xiàn),CEC分離多肽類抗生素(BAT、PLM-B和CLS)時每種目標物都出現(xiàn)兩個色譜峰,分離難度較大。這是由于PTs結(jié)構(gòu)特性使標準品均含有兩種主成分,BAT主要含有BAT-A和BAT-B; CLS主要含有CLS-A和CLS-B; PLM-B含有PLM-B1和PLM-B2。Kang等[24]采用CE-UV技術分離BAT、PLM-B和CLS時也報道了這個問題;Kauann等[25]利用LC-MS/MS檢測BAT、PLM-B和CLS時也證實了這一點。

2.2.2流動相緩沖鹽的選擇

分別考察了磷酸鹽緩沖液(磷酸鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液)、三氟乙酸(TFA)緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液對多肽類抗生素熒光衍生產(chǎn)物分離效果的影響。相較于其他緩沖液,磷酸鹽尤其是磷酸鉀緩沖液對多肽類抗生素的分離具有更好的效果,分析物與殘留的衍生試劑NBD-F及水解產(chǎn)物NBD-OH間的分離程度更好。因此選擇作為流動相緩沖液。

圖 2　緩沖液濃度對多肽抗生素電色譜分離的影響Fig. 2　Effect of buffer concentration on the CEC separation of peptide antibiotics Conditions: mobile phase, acetonitrile (ACN)-phosphate buffer (PB) (pH 5.0) (55∶45, v/v); supplementary pressure, 3.8 MPa; separation voltage, -10 kV; pump flow rate, 0.020 mL/min; detection wavelength, λex/λem=473 nm/530 nm. Peaks: 1 and 2. polymyxin B (PLM-B); 3 and 4. bacitracin (BAT); 5 and 6. colistin (CLS). NBD-OH: 4-fluoro-7-hydroxy-2,1,3-benzoxadiazole.

在毛細管電色譜分離過程中,流動相的主要驅(qū)動力來自電滲流、電泳力或壓力流,而流動相的黏度影響著電泳遷移率和電滲流的大小。實驗采用乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)(55∶45, v/v)為流動相,考察緩沖液濃度(5～20 mmol/L)對3種PTs分離效果的影響(見圖2)。結(jié)果表明,隨著緩沖鹽濃度的增大,流動相黏度逐漸變大,擴散系數(shù)逐漸變小,使得雙電層厚度減小,管壁的Zeta電勢也逐漸減小,導致電滲流變小,目標物分析時間延長。其中,BAT(pKa≈5.5)和CLS熒光衍生產(chǎn)物色譜峰的保留時間增加趨勢較明顯,這可能是由于在pH 5.0時這兩種物質(zhì)帶負電荷,電泳方向與電滲流方向相反;多粘菌素B的熒光衍生產(chǎn)物此時更趨向于中性分子,所以色譜峰保留時間主要受電滲流影響,變化略小。綜合考慮分析物的保留時間、分離度和峰形,實驗選擇10 mmol/L磷酸鉀鹽溶液作為流動相緩沖液。

2.2.3緩沖液pH值的選擇

多肽類抗生素的結(jié)構(gòu)中含有兩性的氨基酸基團,因此流動相的pH值不僅影響電滲流的大小,也決定了其衍生產(chǎn)物的存在形式,從而影響CEC的分離效率。由于多肽抗生素與NBD-F試劑發(fā)生衍生反應后,原先結(jié)構(gòu)中的伯胺、仲胺基團被中性的酰胺鍵取代,衍生產(chǎn)物的帶電情況將主要決定于多肽結(jié)構(gòu)中的羧基基團。考察了流動相緩沖液pH值對目標物分離效果的影響,結(jié)果表明,在pH 3.5～6.0范圍內(nèi),增大pH值有利于抗生素衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中羧基的解離,所帶負電荷增多,電泳淌度也增加,而苯基毛細管填充柱主要帶正電荷,提供陽極電滲流,這使得帶負電荷的衍生物在電色譜柱上的流出時間逐漸延長,有利于分離;隨著pH值的持續(xù)增高(pH >5),衍生產(chǎn)物變得不穩(wěn)定,雖然分離度略有提高,但是對色譜峰響應與柱效的影響較大。綜合考慮分離度、柱效與分析時間,將緩沖液的pH值設為5.0。

2.2.4流動相中有機改性劑的選擇

在CEC中,有機改性劑比例的大小影響著流動相的極性,同時也影響分析物的色譜保留行為。通過改變流動相中乙腈的比例,考察其對抗生素衍生產(chǎn)物分離效果的影響(見圖3)。結(jié)果顯示,隨著乙腈體積分數(shù)的增加,分析物在色譜柱上的保留時間減少,這是由于有機相比例的增加使得流動相的黏度減小,Zeta電位和電滲流變大,降低了目標物在苯基反相柱上的保留。當有機相的體積分數(shù)超過55%時,雖然分析物的響應值有明顯的增大,但是分離度卻有所降低。綜合考慮,將流動相中乙腈的體積分數(shù)設為55%。

圖 3　乙腈的體積分數(shù)對3種多肽抗生素分離的影響Fig. 3　Effect of volume fraction of ACN on the separation of the three peptide antibiotics Conditions: mobile phase, ACN-PB (10 mmol/L, pH 5.0); supplementary pressure, 3.8 MPa; applied voltage, -10 kV; pump flow rate, 0.020 mL/min; detection wavelength, λex/λem=473 nm/530 nm. Peaks 1-6 were the same as that in Fig. 2.

2.2.5輔助壓力的選擇

在CEC分離中引入輔助壓力一方面可以有效地抑制氣泡產(chǎn)生,防止分離柱在高壓電場下斷流,提高穩(wěn)定性;另一方面也能夠縮短分析時間。實驗通過調(diào)節(jié)微流控單元中的反壓閥,改變施加在毛細管柱端的輔助壓力(1.7、3.8、5.2和7.0 MPa),考察其對分析物保留時間和分離度的影響。實驗表明,輔助壓力增大將縮短樣品的分析時間,但分析物的分離度卻有所降低,尤其是多粘菌素B1和多粘菌素B2之間的分離度明顯降低,且容易受到衍生試劑及其水解峰影響,但是較低的輔助壓力會使流動相遷移速度變慢,分析時間延長。因此最終將輔助壓力設為3.8 MPa。

圖 4　分離電壓對多肽類抗生素電色譜分離的影響Fig. 4　Effect of separation voltage on the CEC separation of the peptide antibiotics Conditions: mobile phase, ACN-PB (10 mmol/L, pH 5.0) (55∶45, v/v); supplementary pressure, 3.8 MPa; pump flow rate, 0.020 mL/min; detection wavelength, λex/λem=473 nm/530 nm. Peaks 1-6 were the same as that in Fig. 2.

2.2.6分離電壓的影響

實驗考察了不同分離電壓對PTs衍生產(chǎn)物分離效果的影響。如圖4所示,未施加分離電壓(0 kV)時,PTs中同一成分不同構(gòu)型之間(BAT-A和BAT-B、PLM-B1和PLM-B2、CLS-A和CLS-B)由于結(jié)構(gòu)的相似性,無法分離,此時的色譜出峰順序是BAT-A (BAT-B)、CLS-B (PLM-B1)和CLS-A (PLM-B2)。由于分離驅(qū)動力是壓力流,分析物按照極性大小的次序流出。隨著負向分離電壓的施加,在毛細管色譜柱中將產(chǎn)生陽極電滲流,使每一種不同構(gòu)型的PTs類似物所帶電荷產(chǎn)生差異,因此在電場中受到電滲流和電泳力的作用不同,遷移時間發(fā)生改變,從而實現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似的多肽類抗生素的分離。隨著分離電壓值的增大,電滲流逐漸變大,分析物的遷移時間明顯縮短,每種抗生素類似物的分離度與響應值有所提高,當分離電壓為-10 kV時,分析物之間基本能達到基線分離,分離度>1.1。進一步加大分離電壓使得基線不穩(wěn)、噪聲變大,分析物之間以及與衍生試劑基質(zhì)峰的分離度也大大降低。因此實驗將分離電壓設定為-10 kV。

在上述優(yōu)化的CEC分離條件下,3種多肽類抗生素的典型電色譜圖見圖5。

圖 5　3種多肽類抗生素的毛細管電色譜圖Fig. 5　CEC chromatogram of the three peptide antibioticsPeaks 1-6 were the same as that in Fig. 2.

2.3　線性范圍和檢出限

配制一系列不同質(zhì)量濃度的多肽類抗生素混合標準溶液，在最優(yōu)的色譜條件下進行熒光衍生和CEC-LIF分析。Moralesmunoz和de Castro[26]以鄰苯二醛為柱前衍生試劑,采用HPLC-FD方法對飼料中粘桿菌素進行定量分析時指出,對于結(jié)構(gòu)成分復雜的多肽類抗生素,每個抗生素的峰面積可以以標準樣品中主要成分的峰面積總和來測定,并用于線性關系的研究。本文以測得的分析物的峰面積和質(zhì)量濃度繪制工作曲線,得到方法的線性關系和檢出限(S/N=3),結(jié)果見表1?？梢钥闯?PTs衍生產(chǎn)物的峰面積與各分析物的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關系,最低檢出限為5.0 ng/mL,可滿足多肽類抗生素獸藥殘留限量的檢測要求。該方法的LOD值與文獻報道的采用HPLC-MS/MS[27]、HPLC-UV[28]、HPLC-FLD[29]和CE-UV[30]時低1～2個數(shù)量級,與結(jié)合在線富集技術的CE-MS[31]、HPLC-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(HPLC-Q/Extractive HRMS)[32]及固相萃取-CZE-ESI-MS的檢測水平相當[33]。

表 1　3種多肽類抗生素的回歸方程、相關系數(shù)(R)、線性范圍和檢出限Table 1　Regression equations, correlation coefficients (R), linear ranges and limits of detection (LODs) of the three peptide antibiotics

Y: peak area, μV5s;X: mass concentration, ng/mL.

現(xiàn)有動物性食品中多肽類抗生素如桿菌肽或粘桿菌素的國家標準分析方法[13]均采用LC-MS/MS法,其使用成本與操作要求均較高,檢出限為50 ng/mL。本方法無需梯度洗脫,衍生快速高效,檢出限更低,而且可以避免大量非熒光雜質(zhì)的干擾,對于動物性食品中獸用PTs殘留的監(jiān)測具有適用性。

2.4　穩(wěn)定性和重復性

在最優(yōu)條件下,對1.0 μg/mL的3種多肽類抗生素混合標準溶液進行熒光衍生和CEC-LIF檢測分析,連續(xù)測定6 d,每天進樣3次,測得3種分析物保留時間的日間和日內(nèi)相對標準偏差(RSD)分別為8.7%～9.3%和1.2%～1.8%;峰面積的日間和日內(nèi)RSD分別為4.1%～6.5%和1.7%～3.5%。說明該方法的穩(wěn)定性和重復性均良好,可用于殘留分析研究。

2.5　實際樣品分析

將所建立的CEC-LIF分析方法分別用于加標牛奶和飼料樣品中多肽類抗生素(0.1 μg/mL)的含量測定(見圖6),同時采用國家標準方法[14]檢測粘桿菌素,并與本方法進行對比。兩種方法均只在空白飼料樣品中檢測到粘桿菌素,其中采用CEC-LIF時的平均含量為34.68 μg/kg;采用HPLC-MS時的含量為34.96 μg/kg,均未檢測出桿菌肽和多粘菌素B。

分別采用CEC-LIF與HPLC-MS/MS在3個添加水平(60、100和200 ng/mL)下對空白牛奶和飼料樣品進行加標回收試驗,結(jié)果見表2。CEC法測得的平均回收率為72.9%～112.4%; HPLC-MS法測得的平均回收率為76.6%～120.9%,相對標準偏差≤9.7%。本方法的精密度和準確度均符合獸藥殘留限量的分析要求。

表 2　牛奶和飼料樣品中3種多肽類抗生素的加標回收率(n=3)Table 2　Spiked recoveries of the three peptide antibiotics in milk and feed samples (n=3)

圖 6　加標(a)飼料和(b)牛奶樣品中3種多肽類抗生素(0.1 μg/mL)的色譜圖Fig. 6　Chromatograms of the three peptide antibiotics (0.1 μg/mL) spiked in (a) feed and (b) milk samplesPeaks 1-6 were the same as that in Fig. 2.

3　結(jié)論

本文利用毛細管電色譜與激光誘導熒光檢測聯(lián)用技術,發(fā)展了環(huán)狀多肽類抗生素獸藥殘留的分析方法。建立了基于NBD-F高效衍生化的多肽類抗生素熒光衍生方法,解決了環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)復雜多樣、組分相近、分離選擇性差的分析難點。通過調(diào)節(jié)流動相組成、分離電壓與輔助壓力,有效地調(diào)控了抗生素的分離行為。該法選擇性好,分析快速,低耗且預處理簡單,為動物源食品中獸用PTs殘留分析與評估提供了新的手段。

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