線粒體相關內質網膜在順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡中的作用*

徐　路，于　洋，劉師兵，李松巖，徐　冶

(吉林醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院實驗中心，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是臨床上最常見、死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一[1-2]。順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床上廣泛使用的化療藥物[3-4]，能誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡[5-6]。越來越多的研究表明線粒體途徑介導的細胞凋亡和內質網應激介導的細胞凋亡都參與了順鉑誘導腫瘤細胞凋亡的過程[7-8]。那么，線粒體相關內質網膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs)作為線粒體與內質網的偶聯(lián)平臺[9]，是否也參與了順鉑誘導腫瘤細胞凋亡的過程，還未有明確的報道。本文通過觀察順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡過程中MAMs的變化，探討MAMs是否在順鉑誘導癌細胞凋亡中發(fā)揮作用，為明確順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的分子機制提供新的線索。

材　料　和　方　法

1　材料

本研究所用的人卵巢癌SKOV3細胞株購自中國醫(yī)學科學院；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone；CDDP購自Sigma；兔抗active caspase-3、B細胞受體相關蛋白31(B-cell receptor-associated protein 31，BAP31)和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1，VDAC1)單克隆抗體購于Proteintech；免疫熒光 II 抗 (Alexa Fluor 546標記驢抗兔IgG和Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG)購于Invitrogen。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)人卵巢癌細胞SKOV3在含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)及鏈霉素(1×105U/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待有80% 以上細胞融合，用0.25%胰酶進行消化，按1∶4比例進行傳代。

2.2間接免疫熒光法檢測active caspase-3的水平以及BAP31和VDAC1的共定位水平高壓消毒后用無菌蓋玻片置于24孔板，取對數(shù)生長期細胞，調整細胞密度為1.0×107/L，每孔500 μL接種過夜，次日待細胞生長至80%融合，藥物作用細胞24 h后，棄培養(yǎng)基，加入200 μL固定液(4%多聚甲醛)作用10 min，蛋白酶K消化1 min，PBS洗3次，0.1% Triton-PBS作用5 min，PBS洗3次后，加入5%非免疫動物血清作用30 min，加入 I 抗(1∶200)4 ℃過夜，次日加入相應 II 抗，Hoechst33342染色5 min，PBS洗3次，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察取圖。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率的變化取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的 SKOV3細胞接種于6孔板中，接種濃度約為每孔2.0×105個細胞，接種24 h后，藥物再作用24 h，胰酶消化，收集細胞，800 r/min 離心5 min 后棄去上清液，緩慢加入適量無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(使細胞濃度約為1.0×109/L)，用手指輕彈將細胞懸液混勻，將細胞懸液與 MuseTMAnnexin V 細胞凋亡檢測試劑 1∶1 混勻，室溫避光孵育20 min，處理好的樣本用 MuseTM細胞分析儀進行檢測，分析不同處理組中細胞凋亡率的變化。

2.4透射電鏡觀察線粒體相關內質網膜的變化收集細胞，用預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，然后轉移到 1.5 mL 離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心15 min。 隨后，棄掉上清液，先加入500 μL戊二醛(2.5%)進行預固定，之后再用 1%餓酸后固定。固定完成，用梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂Epon812進行包埋，用 LKB2 III 型超薄切片機行半薄切片，定位之后再行超薄切片，醋酸雙氧化鈾及檸檬酸鉛對樣本行雙重染色。最后，使用 JEM1200EX 型透射電子顯微鏡，進行細胞超微結構的觀察并照相、記錄。

3　統(tǒng)計學處理

實驗中的各組數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間均值比較采用 Student’st檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　順鉑誘導SKOV3細胞內active capspase-3的表達

用6 mg/L順鉑處理SKOV3細胞，分別作用0 h、12 h和24 h。激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡標志性蛋白active caspase-3表達的變化。實驗結果表明，與對照組相比，順鉑能明顯誘導SKOV3細胞內active caspase-3蛋白的表達，其中12 h熒光表達最明顯，見圖1。

2　順鉑誘導SKOV3細胞的凋亡

基于上述結果，我們應用流式細胞術檢測順鉑對SKOV3細胞凋亡率的影響。6 mg/L順鉑處理SKOV3細胞0 h、12 h和24 h，實驗結果表明順鉑可明顯誘導SKOV3細胞凋亡，與control組相比，順鉑作用12 h和24 h組細胞凋亡率均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而12 h組和24 h組比較，細胞凋亡率無顯著變化，見圖2。

3　順鉑誘導SKOV3細胞內BAP31和VDAC1的共定位

我們用BAP31和VDAC1作為內質網和線粒體的標志性蛋白,觀察順鉑是否能夠影響線粒體和內質網之間的關聯(lián)。6 mg/L順鉑處理SKOV3細胞0 h、12 h和24 h，實驗結果表明，與對照組相比，Bap31和VDAC1的共定位在24 h熒光表達最強,見圖3。

4　順鉑誘導SKOV3細胞內線粒體與內質網的關聯(lián)

我們通過透射電鏡檢測線粒體和內質網之間的關聯(lián)，6 mg/L順鉑處理SKOV3細胞0 h和8 h，實驗結果顯示，在對照組相比，順鉑處理8 h后，線粒體和內質網之間的關聯(lián)顯著增加，與 control組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.The effect of cisplatin on the expression of active caspase-3 in SKOV3 cells.The scale bar=20 μm.
圖1順鉑對SKOV3細胞內activecaspase-3表達的影響

Figure 2.The effect of cisplatin on the apoptosis in SKOV3 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖2順鉑對SKOV3細胞凋亡的影響

討　　論

已有研究發(fā)現(xiàn)內質網應激相關性凋亡與線粒體損傷途徑可能存在一定的交聯(lián)[10]，而MAMs將內質網和線粒體的功能結構和信號通路緊密聯(lián)系在一起[11]，在磷脂合成轉運、線粒體形態(tài)功能調節(jié)、Ca2+

Figure 3.The effect of cisplatin on the colocalization of BAP31 and VDAC1 in SKOV3 cells.The scale bar=10 μm.
圖3順鉑對SKOV3細胞內BAP31和VDAC1共定位的影響

Figure 4.The effect of cisplatin on the mitochondria-ER contacts in SKOV3 cells.The scale bar=200 nm.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖4順鉑對SKOV3細胞內線粒體與內質網關聯(lián)的影響

信號轉運和細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[12-13]，已經成為腫瘤研究中的熱點，但具體的作用機制還不清楚，仍需進一步探討。

BAP31是一類定位在內質網上進化保守的跨膜蛋白，其在蛋白質轉運、細胞遷移和細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[14]。電壓依賴性陰離子通道蛋白1是線粒體上主要的Ca2+攝入通道[15]。在順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的過程中，我們發(fā)現(xiàn)兩者共定位顯著增加，即線粒體和內質網之間的關聯(lián)顯著增加，推測MAMs參與了順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的過程。

已有研究發(fā)現(xiàn)順鉑誘導細胞凋亡過程中，Ca2+濃度增高，同時伴有VDAC1低聚反應的發(fā)生。當增加VDAC1表達時，Ca2+可通過激活一個未知的信號通道，促進VDAC1發(fā)生低聚反應，從而誘導凋亡的發(fā)生[16]。也有研究者認為，細胞凋亡過程與MAMs上高密度分布的1,4,5三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)鈣離子釋放通道有關，大量Ca2+從內質網迅速轉移到線粒體中從而誘導凋亡發(fā)生[11]。另外，內質網和線粒體表面連接抗凋亡蛋白(PML、Akt和PTNE等)通過調控Ca2+濃度也可以誘導凋亡[17]。因此，我們推測MAMs在順鉑誘導腫瘤細胞凋亡中的作用機制可能與Ca2+有關。線粒體和內質網之間的關聯(lián)顯著增加，引起Ca2+釋放，進而誘導凋亡的發(fā)生，這可能是順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的分子機制，還需要進一步探討，該凋亡機制的研究將為卵巢癌治療提供新的治療靶點。

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