丹酚酸B對糖尿病大鼠血管舒張功能、NF-κB活化及炎癥因子表達的影響*

趙夢秋，任尤楠，陶善珺，吳元潔，鄭書國△,　洪　勇

(1安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院藥學教研室，安徽 池州 247099； 2皖南醫(yī)學院藥理學教研室，安徽 蕪湖 241002； 3安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎理論教研室，安徽 合肥 230038； 4安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院解剖教研室，安徽 池州 247099)

糖尿病是一種慢性高血糖伴有蛋白質及脂質代謝紊亂綜合癥，可引起心、腎和血管等多器官并發(fā)癥，其中大血管病變引起的急性心血管事件是患者死亡的主要原因[1]。因此積極防治糖尿病及其血管并發(fā)癥具有重要的現(xiàn)實意義和緊迫性。

糖尿病血管病變的基礎是內皮損傷，病變表現(xiàn)為中等以上動脈發(fā)生動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)[2]。高血糖可通過多種機制誘導內皮損傷，其中氧化應激誘導的炎癥反應是主要機制之一[3]。由此推測抑制氧化應激誘導的血管壁慢性炎癥過程是保護血管功能、防治糖尿病血管并發(fā)癥的可靠途徑。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是我國傳統(tǒng)中藥丹參中提取的水溶性成分，具有抗氧化、抗炎和調血脂等多種作用[4]。目前對丹酚酸B抗糖尿病并發(fā)AS的研究主要集中在調血脂和抑制內皮細胞凋亡方面，對血管慢性炎癥狀態(tài)的研究較少。本實驗將以炎癥為靶點，在糖尿病大鼠模型上進一步研究丹酚酸B對糖尿病血管損傷的干預作用，探討其可能機制，為丹酚酸 B防治糖尿病AS提供依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，體重(220±20) g，購自浙江省實驗動物中心，合格證號為SCXK(浙)2014-0001。高糖高脂飼料(10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、1%膽固醇和74%普通飼料)，普通顆粒飼料均購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。大鼠飼養(yǎng)于自然光照、室溫(22±2) ℃環(huán)境中，自由進食和飲水。

2　藥物和試劑

Sal B(批號HK201410)購于西安文竹生物科技有限公司；重酒石酸去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)注射液(批號08140604)購自上海禾豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ; 編號1126C028)、苯腎上腺素(phenylephrine，Phe; 編號MKBK1565V)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh; 編號BCBC9786V)和硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP; 編號S-0501)均購自Sigma。

大鼠白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)檢測試劑盒(編號H007)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(編號H052)和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)檢測試劑盒(編號H126)均購自南京建成生物工程研究所；抗細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)抗體(編號ab171123)和抗單核細胞趨化因子1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)抗體(ab25124)購自Abcam；抗核因子κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)抗體(編號AN365)、抗β-actin抗體(編號AA128)、抗組蛋白H3抗體(編號AF0009)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠II抗(編號A0216)、辣根過氧化物酶標記、山羊抗兔 II 抗(編號A0208)、RIPA 裂解液(編號P0013C)、PMSF(編號ST506)、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(編號 P0027)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAOC)檢測試劑盒(編號S0121)、丙二醛(malondialdehyde)檢測試劑盒(MDA，編號S0131)、一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒(編號S0021)和BCA蛋白檢測試劑盒(編號P0012)均購自碧云天生物技術研究所。

3　主要儀器

酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；低溫高速離心機(Eppendorf)；電泳槽(北京六一儀器廠)；半干轉膜系統(tǒng)(Bio-Rad)；離體組織器官實驗系統(tǒng)、數(shù)控恒溫循環(huán)水槽和多通道生物信號處理系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；張力換能器(北京新航興業(yè)科貿有限公司)。

4　方法

4.1糖尿病大鼠模型的建立健康雄性SD大鼠50只，體重(220±20) g，自由進食和飲水，經(jīng)1周適應性喂養(yǎng)后隨機分為正常對照組(n=10)與糖尿病組(n=40)。正常對照組大鼠給予普通顆粒飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組給予高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4周后禁食12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射1% STZ誘發(fā)糖尿病，正常對照組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。1周后以隨機血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病模型復制成功。將成模大鼠隨機分為模型(mo-del)組、Sal B高劑量(high dose of Sal B,HS)組和Sal B低劑量(low dose of Sal B,LS)組。治療組每日灌胃給予相應劑量的丹酚酸B (160 mg·kg-1·d-1及80 mg·kg-1·d-1)，正常對照組和模型組均給予等體積蒸餾水，共6周。期間每周稱量體重一次并根據(jù)體重調整給藥劑量。

4.2血液采集和血管標本制備于末次給藥后禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉 (30 mg/kg) 麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清用于生化指標測定。鈍性分離主動脈后取約1 cm血管置于4 ℃預冷并通有 95% O2及 5% CO2的 K-H 液中，用于離體動脈環(huán)實驗，剩余主動脈于-80 ℃冰箱保存，用于生化指標檢測及Western blot檢測。主動脈弓置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于病理學觀察。

4.3離體動脈環(huán)實驗(血管舒張功能檢測)將動脈環(huán)固定于盛有K-H液的37 ℃恒溫浴槽中，持續(xù)通入95% O2和5% CO2。2 g前負荷下平衡1 h，以3×10-7mol/L 去甲腎上腺素預收縮血管，待動脈環(huán)穩(wěn)定后，以苯腎上腺素(1×10-6mol/L)收縮血管，待收縮穩(wěn)定后觀察累積濃度的乙酰膽堿(1×10-8～1×10-4mol/L)及硝普鈉(1×10-9～1×10-5mol/L)誘導的主動脈舒張反應。主動脈舒張反應以累積濃度引起的血管舒張張力占Phe引起的收縮張力的百分比表示(%)。

4.4病理學檢查取主動脈弓，4%多聚甲醛溶液固定72 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟至水，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察主動脈病理學變化。

4.5血清IL-6、TNF-α及CRP水平測定取血清樣本，ELISA法測定血清IL-6、TNF-α及CRP水平，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

4.6主動脈TAOC、MDA及NO水平測定取血管組織制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，收集上清液。按試劑盒說明書測定組織勻漿TAOC、MDA及NO水平。

4.7Western blot實驗取血管組織，按0.1 g組織加入600 μL RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)提取總蛋白。檢測NF-κB p65核轉位時按0.1 g組織加入200 μL蛋白抽提試劑(含1 mmol/L PMSF)提取核蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，行SDS-PAGE、轉膜，分別加入 I 抗和II 抗孵育，ECL顯色，X光膠片顯影，圖像掃描后使用Quantity One軟件進行分析。蛋白表達結果以β-actin作為內參照，NF-κB p65以組蛋白 H3作為內參照。

5　統(tǒng)計學處理

采用DAS 1.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　丹酚酸B對內皮依賴性血管舒張功能的影響

離體動脈環(huán)實驗結果可見，糖尿病大鼠主動脈對ACh引起的內皮依賴性舒張反應較正常組顯著降低(P<0.01)，提示血管內皮受損，內皮依賴性舒張功能減弱；與模型組比較，丹酚酸B治療組大鼠主動脈對ACh 誘導的內皮依賴性舒張反應明顯增強(P<0.05或P<0.01)，提示丹酚酸B能改善糖尿病大鼠血管內皮依賴性舒張功能，見圖1。

2　丹酚酸B對非內皮依賴性血管舒張功能的影響

離體動脈環(huán)實驗結果示，不同濃度SNP均能引起血管舒張，且各組間無明顯差異，提示糖尿病大鼠非內皮依賴性血管舒張功能無明顯受損，見圖2。

3　丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈病理改變的影響

HE染色顯示對照組大鼠主動脈內膜光滑，內皮細胞完整，無缺損或增厚，中膜層平滑肌細胞排列整齊，見圖3A；糖尿病大鼠主動脈呈現(xiàn)粥樣硬化趨勢，血管內膜失去完整性，平滑肌排列紊亂，見圖3B；給予丹酚酸B治療后主動脈壁病變減輕，見圖3C、D。這提示丹酚酸B可在一定程度上改善糖尿病大鼠主動脈病理損傷。

4　丹酚酸B對糖尿病大鼠血清IL-6、TNF-α及CRP水平的影響

糖尿病大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α及CRP水平較正常大鼠顯著增高(P<0.05或P<0.01)，提示糖尿病大鼠體內存在炎癥；丹酚酸B治療組上述指標較模型組均有明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組較低劑量組改善作用更加顯著，見表1。

5　丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈NO、TAOC及MDA水平的影響

與對照組相比，糖尿病大鼠主動脈內皮舒張因子NO水平顯著降低(P<0.01)，與內皮依賴性舒張功能減弱的趨勢一致，提示糖尿病大鼠血管明顯受損；同時，主動脈TAOC明顯降低(P<0.01)，脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高(P<0.01)。丹酚酸B能有效提高NO水平，增強血管抗氧化能力，減少MDA堆積(P<0.01)，提示丹酚酸B可明顯改善糖尿病大鼠血管損傷，見表2。

Figure 1.The effect of Sal B on ACh-induced relaxation response of aorta.A:control group; B:model group; C:LS group; D:HS group; E:ACh-induced relaxation response.Mean±SD.n=7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.
圖1丹酚酸B對Ach誘導糖尿病大鼠主動脈舒張反應的影響

6　丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈NF-κB p65亞基核轉位的影響

如圖4所示，與對照組相比，糖尿病大鼠主動脈NF-κB p65亞基在細胞核內表達明顯增加(P<0.01)；丹酚酸B治療組大鼠主動脈NF-κB p65亞基核轉位明顯減少(P<0.01)。

7　丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈ICAM-1及MCP-1蛋白表達的影響

由圖5可見，糖尿病大鼠主動脈ICAM-1及MCP-1蛋白表達水平明顯高于正常大鼠(P<0.01)，提示主動脈出現(xiàn)明顯的炎性病變；丹酚酸B治療可有效抑制ICAM-1及MCP-1蛋白表達，減輕炎性細胞黏附(P<0.01)。

討　　論

糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病，可引起心、腦、腎和血管等多種靶器官損傷。糖尿病血管損傷的病理特征主要是內皮細胞損傷、血管壁脂質沉積及平滑肌細胞異常遷移和增殖，最終導致管腔狹窄或粥樣斑塊破裂[5]。本實驗采用國內外常用的糖尿病大鼠模型制備方法，即在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的基礎上，注射低劑量STZ損傷胰島功能，獲得實驗性糖尿病大鼠。主動脈離體灌流結果顯示，模型組大鼠主動脈對ACh 引起的內皮依賴性舒張反應顯著降低，而對NO直接供體SNP誘導的非內皮依賴性舒張反應并無明顯差異。病理檢查結果顯示糖尿病大鼠主動脈呈現(xiàn)粥樣硬化趨勢，血管內膜失去完整性，平滑肌排列紊亂，微血管基底膜增厚，糖原沉積、脂肪樣及透明樣變性。同時我們觀察到主動脈NO水平明顯降低，而內皮依賴性舒張反應主要由ACh作用于內皮細胞后產(chǎn)生的NO進行調節(jié)，當血管內皮受損時NO合成減少則出現(xiàn)舒張功能障礙。上述結果顯示糖尿病大鼠主動脈內皮出現(xiàn)明顯的結構及功能損傷，而給予丹酚酸B治療能夠明顯改善大鼠血管內皮損傷。

Figure 2.The effect of Sal B on SNP-induced relaxation response of aorta.A:control group; B:model group; C:LS group; D:HS group; E:SNP-induced relaxation response.Mean±SD.n=7.
圖2丹酚酸B對SNP誘導糖尿病大鼠主動脈舒張反應的影響

Figure 3.The effect of Sal B on primary histopathological changes of aorta (HE staining,×400).A:control group; B:model group; C:LS group; D:HS group.
圖3丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈病理改變的影響

表1丹酚酸B對大鼠血清IL-6、TNF-α及CRP水平的影響
Table 1.The effect of Sal B on serum levels of IL-6,TNF-α and CRP (Mean±SD.n=8)

GroupIL?6(ng/L)TNF?α(ng/L)CRP(mg/L)Control38±8　156±15　1．9±0．4Model156±17??371±31??7．7±1．0??LS124±12##　302±30##6．2±1．2##HS91±13##267±28##5．4±1．0##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

表2丹酚酸B對大鼠主動脈NO、TAOC及MDA水平影響
Table 2.The effect of Sal B on levels of NO,TAOC and MDA in aorta (Mean±SD.n=8)

GroupNO(μmol/gprotein)TAOC(mmol/gprotein)MDA(μmol/gprotein)Control7．7±1．30．36±0．053．7±0．6Model3．8±0．4??0．16±0．03??9．9±1．7??LS4．6±0．80．23±0．03##7．7±1．1##HS5．4±0．9##0．29±0．04##6．2±0．9##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

Figure 4.The effect of Sal B on NF-κB p65 nuclear translocation in aorta tissues.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.
圖4丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈NF-κBp65亞基核轉位的影響

近年來大量研究表明，2型糖尿病與多種細胞因子介導的炎癥反應關系密切，而在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中，單核細胞的募集與黏附、巨噬細胞的增殖、血管平滑肌細胞增殖和遷移、基質的降解等均與炎癥有關，因此認為炎癥參與了糖尿病動脈粥樣硬化的進程[6]。高血糖通過一系列復雜的機制誘導內皮細胞大量產(chǎn)生和釋放炎癥因子、趨化因子和黏附分子，促使循環(huán)的白細胞、血小板黏附到內皮細胞表面，然后侵襲至內皮下，造成血管病變。文獻報道在糖尿病患者血清中檢測到炎癥因子水平顯著升高[7-8]，我們在糖尿病大鼠模型中也觀察到血清CRP、TNF-α和IL-6水平明顯高于正常大鼠，同時我們還觀察到血管組織中ICAM-1和MCP-1的蛋白表達水平明顯增加。ICAM-1是一種重要的細胞表面黏附因子，參與炎性細胞向組織移動或定位過程。MCP-1是很強的單核細胞趨化因子，介導單核細胞和淋巴細胞向血管壁遷徙、進入內皮下并分化成巨噬細胞的過程[9]。在糖尿病血管病變進程中ICAM-1和MCP-1均發(fā)揮顯著的促進作用。本研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清中炎癥因子TNF-α、CRP和IL-6水平及血管組織中MCP-1、ICAM-1 表達明顯高于對照組大鼠，丹酚酸B治療后大鼠體內炎癥指標均明顯降低，提示丹酚酸B能夠改善糖尿病大鼠炎性損傷。

Figure 5.The effect of Sal B on protein expression of ICAM-1 and MCP-1 in the aorta.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.
圖5丹酚酸B對糖尿病大鼠主動脈ICAM-1及MCP-1蛋白表達的影響

NF-κB是一種細胞內普遍存在的轉錄因子，參與免疫反應、炎癥和凋亡等多種病理生理過程。正常情況下，NF-κB以非活性形式存在于胞質。當收到外來因素刺激時，NF-κB被激活并發(fā)生核移位，與靶基因啟動子上的位點結合，啟動和調節(jié)包括TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1以及ICAM-1等多種炎癥因子基因的轉錄[10-11]。臨床資料顯示[12]，糖尿病血管病變過程中 NF-κB 活化伴黏附分子釋放增加與血管慢性病變呈正相關，推測NF-κB的過度活化可能是血管炎性病變的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗中觀察到糖尿病大鼠血管組織NF-κB核內水平明顯高于對照組，而給予丹酚酸B可明顯抑制NF-κB核移位，這一結果與丹酚酸B降低TNF-α、CRP及ICAM-1等炎癥因子水平有關，提示丹酚酸B抑制糖尿病大鼠炎癥反應與抑制NF-κB活化有關。NF-κB是氧化應激敏感的轉錄因子，高血糖可能通過誘導血管內皮細胞內活性氧產(chǎn)生激活NF-κB。劉江月等[13]的實驗發(fā)現(xiàn)降糖調脂靈通過抗氧化作用抑制NF-κB核轉位，從而改善糖尿病血管損傷過程。在本實驗中，我們檢測了大鼠的氧化應激狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠氧化應激水平明顯高于對照組大鼠，而給予丹酚酸B可顯著改善糖尿病大鼠的氧化應激狀態(tài)，提示丹酚酸B抑制NF-κB活化及炎癥因子表達與其抗氧化作用有關。

綜上所述，丹酚酸B可明顯改善糖尿病大鼠血管舒張功能，其機制可能與其抗氧化作用，抑制NF-κB活化，減少炎癥因子、趨化因子和黏附分子表達，從而減輕血管炎性病變有關。

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