自噬在熊果酸抑制人肺癌PC9細(xì)胞增殖中的作用

羅　敏，吳愛祥，鄭林龍，邵中一

(寧波市鄞州人民醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315040)

自噬(autophagy)現(xiàn)象在近十年來(lái)越來(lái)越受到重視，它在疾病演變過(guò)程中具有促進(jìn)同時(shí)也具有抑制的雙相作用。研究表明，抗腫瘤藥物可以不同程度引起腫瘤細(xì)胞自噬，抑制自噬可以提高抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性增加[1]。近年來(lái)環(huán)境污染嚴(yán)重，我國(guó)肺癌的死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，并且低齡化趨勢(shì)也越來(lái)越明顯，肺癌已經(jīng)成為我國(guó)惡性腫瘤的第一位死亡原因[2]。熊果酸(ursolic acid，UA)是廣泛存在于自然界中的五環(huán)三萜類單體化合物，具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和保肝等作用[3]。近年來(lái)有研究表明，熊果酸可抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤侵襲和抗氧化等多種作用，其抗腫瘤生物活性日益受到人們重視，但其具體抗腫瘤機(jī)制仍有待研究。熊果酸在肺癌中的抗腫瘤作用是否與誘導(dǎo)自噬相關(guān)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究觀察熊果酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)PC9細(xì)胞自噬的作用，檢測(cè)反映細(xì)胞自噬現(xiàn)象和細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量變化的自噬標(biāo)志分子LC3Ⅱ的含量[4]，并在此基礎(chǔ)上探討自噬的功能，進(jìn)一步明確熊果酸抗腫瘤作用機(jī)制，為熊果酸用于肺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　細(xì)胞、主要試劑與儀器

PC9細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。UA、DMSO、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)和吖啶橙(acridine orange，AO)購(gòu)自Sigma；胎牛血清購(gòu)自Gibco；胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MTT購(gòu)于碧云天生物公司；抗GAPDH、LC3和ATG5抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。倒置熒光顯微鏡(Leica)；凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；iMARK型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC9細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，每3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5.0×107/L的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的UA作用，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)。每個(gè)濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

2.3臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)于24孔板中接種肺癌PC9細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的藥物作用，0.25%胰酶消化，用0.04%臺(tái)盼藍(lán)分別對(duì)各作用組細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(其中著色細(xì)胞為死細(xì)胞)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次。

2.4吖啶橙染色收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，將細(xì)胞接種于24孔板，37 ℃、5% CO2孵育培養(yǎng)，分別加入不同濃度的UA及雷帕霉素，各組藥物作用于肺癌PC9細(xì)胞24 h后，吸盡舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗3遍，加入終濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液，避光染色15 min，棄去吖啶橙溶液，用PBS緩沖液清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，吖啶橙可將胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡染成紅色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌PC9細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，加入各種藥物處理。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度定量。經(jīng) SDS-PAGE 分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5% BSA的PBST封閉1 h，分別加入對(duì)應(yīng) I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入對(duì)應(yīng) Ⅱ 抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光采圖，從而進(jìn)行半定量分析。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　熊果酸抑制肺癌PC9細(xì)胞的活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同濃度的UA作用后，肺癌PC9細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著藥物濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.05或P<0.01)，見圖1。在給藥24 h后，UA的IC50為29.07 μmol/L；在給藥48 h后，UA的IC50為20.77 μmol/L；在給藥72 h后，UA的IC50為14.84 μmol/L。上述結(jié)果表明，UA對(duì)肺癌PC9細(xì)胞具有抑制作用，見圖1。

Figure 1.The effects of ursolic acid on the viability of PC9 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖1不同濃度的熊果酸對(duì)肺癌PC9細(xì)胞活力的影響

2　熊果酸誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞自噬

2.1吖啶橙染色觀察熊果酸作用肺癌PC9細(xì)胞后自噬囊泡的變化與空白對(duì)照(control)組相比，雷帕霉素(100 nmol/L)陽(yáng)性對(duì)照組的胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡明顯染成紅色，提示自噬水平增加；與control組相比，UA作用于肺癌PC9細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)酸性濾泡染成亮紅色熒光比例增多，其中以UA 10和20 μmol/L濃度較為明顯(P<0.01)，見圖2。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10和20 μmol/L作為UA的實(shí)驗(yàn)濃度。

Figure 2.The change of autophagy vesicles in the PC9 cells after treated with ursolic acid (×400).Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖2不同濃度的熊果酸對(duì)肺癌PC9細(xì)胞自噬的影響

2.2熊果酸對(duì)肺癌PC9細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，UA作用于肺癌PC9細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，UA 10和20 μmol/L組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，說(shuō)明UA誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞發(fā)生自噬，見圖3。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱin the lung cancer PC9 cells treated with ursolic acid.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖3熊果酸誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞LC3的表達(dá)

2.3熊果酸對(duì)肺癌PC9細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，UA作用肺癌PC9細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，UA 10和20 μmol/L組的ATG5蛋白水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，提示UA誘導(dǎo)自噬可能與上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG5的表達(dá)有關(guān),見圖4。

Figure 4.The protein level of ATG5 in the lung cancer PC9 cells treated with ursolic acid.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖4熊果酸誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞ATG5的表達(dá)

3　抑制自噬可提高熊果酸對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用

在加入U(xiǎn)A前1 h加入特異性的自噬抑制劑3-MA抑制自噬的發(fā)生，觀察UA抑制肺癌PC9細(xì)胞增殖能力的變化。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與UA 10 μmol/L組相比，UA 10 μmol/L聯(lián)合3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01);與UA 20 μmol/L組相比，UA 20 μmol/L聯(lián)合3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平也下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，說(shuō)明3-MA減弱了UA誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞的自噬水平，見圖5A。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3-MA促進(jìn)了UA對(duì)肺癌PC9細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(P<0.01)，見圖5B。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算存活細(xì)胞的數(shù)目，結(jié)果顯示3-MA聯(lián)合UA作用組存活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，較UA作用組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖5C。上述說(shuō)明3-MA聯(lián)合UA作用能提高UA對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

Figure 5.Inhibition of autophagy facilitated the inhibitory effect of ursolic acid (UA) on the proliferation of PC9 cells.A:LC3 protein levels detected by Western blot; B:cell viability detected by MTT assay; C:viable cell number determined by Trypan blue exclusion test.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsUA (10 μmol/L) group;&&P<0.01vsUA (20 μmol/L) group.
圖5抑制自噬促進(jìn)熊果酸對(duì)PC9細(xì)胞增殖的抑制作用

討　　論

肺癌居全球范圍內(nèi)腫瘤死因之首，其中非小細(xì)胞肺癌占80%～85%[2]。在我國(guó)隨著環(huán)境的惡化，肺癌的死亡率已居惡性腫瘤的第一位?；熌壳笆欠伟┳钣行У闹委煼椒ㄖ唬欢鴤鹘y(tǒng)的肺癌化療藥物常因其各種嚴(yán)重的副作用使得其臨床應(yīng)用受到很大限制。即使目前分子靶向治療的出現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者的5年存活率仍低于40%[5]。 因此尋找治療肺癌的新方法及新策略成為醫(yī)藥界的一個(gè)重要課題。熊果酸是廣泛存在于自然界中的五環(huán)三萜類化合物,具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝和調(diào)節(jié)免疫功能等作用，且毒副作用較小。熊果酸的抗腫瘤主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、 抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤組織血管生成、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移并干擾腫瘤微壞境等[6]。王文靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可抑制卵巢癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠的瘤體生長(zhǎng)，并通過(guò)下調(diào)耐藥指標(biāo)ABCG2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

自噬是真核生物中普遍存在的現(xiàn)象，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，腫瘤研究者發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬可參與腫瘤的治療，自噬與腫瘤的關(guān)系較為復(fù)雜，既存在抑制作用，又存在著一定的保護(hù)作用。在自噬發(fā)生的早期，自噬可作為一種保護(hù)機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞避免受到低營(yíng)養(yǎng)電離輻射和化療等所致的損傷而持續(xù)生存；而當(dāng)外部環(huán)境較差，腫瘤細(xì)胞過(guò)度自我吞噬時(shí)，就會(huì)引起自噬性死亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。自噬激活過(guò)度時(shí)則會(huì)引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，自噬對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用。在本研究中，我們觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UA處理后，PC9細(xì)胞內(nèi)酸性濾泡染成亮紅色熒光比例增多，與文獻(xiàn)中描述的自噬過(guò)程一致。細(xì)胞中LC3-Ⅱ的含量與細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)，可以反映細(xì)胞的自噬現(xiàn)象和細(xì)胞內(nèi)自噬泡的多少，是研究自噬現(xiàn)象的標(biāo)志分子[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)UA處理的肺癌PC9細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增多，自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)也增加，說(shuō)明自噬在UA抑制肺癌PC9細(xì)胞增殖的過(guò)程中被激活。但是我們并不清楚自噬激活在這一過(guò)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞是起促進(jìn)作用還是抑制作用。為說(shuō)明這一問(wèn)題，我們使用自噬抑制劑3-MA。研究發(fā)現(xiàn)，3-MA與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞敏感性。例如，3-MA抑制自噬提高了結(jié)腸癌5-FU的化療效果[11]；Liang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬會(huì)增加卵巢癌細(xì)胞化療的敏感性。Fukuda等[13]觀察到自噬抑制增強(qiáng)白藜蘆醇誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡；Fei等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)自噬的抑制作用可增強(qiáng)PF-04691502對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡和DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與UA單獨(dú)作用組相比，UA聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著下降，說(shuō)明3-MA能減弱由UA誘導(dǎo)的肺癌PC9細(xì)胞的自噬水平。同時(shí)MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA提高了UA對(duì)肺癌PC9細(xì)胞的增殖抑制作用。這表明自噬活化導(dǎo)致肺癌PC9細(xì)胞對(duì)UA的敏感性降低，抑制自噬使得UA對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用增加。這與現(xiàn)有的研究相一致，大多數(shù)研究認(rèn)為抑制自噬可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤治療的敏感性，增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

總之，UA可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬發(fā)生，其可能依賴于ATG5細(xì)胞自噬途徑。自噬活化使得肺癌細(xì)胞對(duì)UA的敏感性降低，抑制自噬可以提高UA對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。UA誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制及抑制自噬提高UA的抗腫瘤作用是否與促進(jìn)凋亡相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

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