青藤堿與順鉑協(xié)同誘導(dǎo)人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞凋亡*

陳偉達(dá)，曾　嘉，梅世文，苗成利

(北京大學(xué)國際醫(yī)院腹膜后腫瘤外科，北京 102206)

纖維肉瘤是一種常見的軟組織肉瘤。在治療上以手術(shù)切除為首選，放化療為輔，但有50%的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]，其平均生存期不足一年[2]。順鉑(cisplatin，DDP)是目前治療纖維肉瘤的常用化療藥物，但較強的毒副作用以及耐藥性的出現(xiàn)是限制其療效的主要原因[3]。因此從天然植物化學(xué)成分中尋找安全有效的新型抗腫瘤藥物成為目前研究的熱點之一。青藤堿(sinomenine，SIN)是從中藥青風(fēng)藤中提取出的一種生物堿單體，具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳等藥理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿對肝癌、肺癌、乳腺癌和骨肉瘤等惡性腫瘤具有顯著的抑制作用[4-7]。但關(guān)于青藤堿能否提高纖維肉瘤對順鉑的敏感性目前尚不明確。本實驗旨在體外觀察青藤堿與順鉑聯(lián)用對人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞的毒性作用，并在分子水平探討其可能的分子機制，為青藤堿用于纖維肉瘤的治療提供理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　材料

人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞購自國家實驗細(xì)胞資源共享平臺。青藤堿購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；順鉑購自Sigma；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1(copper transporter 1，CTR1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π(gluta-thioneS-transferase-π，GST-π)、Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Abcam。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5 % CO2條件下進行培養(yǎng)，每3～4 d 傳代1次。

2.2藥物配制將青藤堿和順鉑溶于無血清DMEM培養(yǎng)液配制成儲存液，避光，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗前用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度的工作液。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期HT-1080細(xì)胞，以每孔5×103個接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗分成3組：(1)順鉑組：DMEM培養(yǎng)液更換為含有不同濃度順鉑(0.5、1、2、4和8 μmol/L)的工作液100 μL；(2)青藤堿組：DMEM培養(yǎng)液更換為含有不同濃度青藤堿(0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mmol/L)的工作液100 μL；(3)順鉑與青藤堿聯(lián)用(DDP+SIN)組：DMEM培養(yǎng)液更換為含有順鉑和青藤堿的工作液100 μL，梯度濃度與上述兩組相同，二者濃度比為1∶200。每個濃度設(shè)5復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零孔(無細(xì)胞)和對照孔(無藥物作用)，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)值。調(diào)零孔A值校正各孔A值后，細(xì)胞抑制率(%)=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

2.4藥物聯(lián)合應(yīng)用評價采用Chou-Talalay中效分析法對CCK-8法檢測結(jié)果進行分析。中效方程式為：fa/fu=(D/Dm)m，其中fa為抑制率，fu=1-fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率，分別將公式兩邊取對數(shù)得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm，設(shè)Y=lg(fa/fu)，X=lgD,b=m，a=mlgDm，得線性方程式:Y=a+bX。兩藥合用在不同效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)的計算公式為：CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)，其中DX1和DX2為兩藥單用產(chǎn)生X效應(yīng)時各自所需濃度，D1和D2為兩藥聯(lián)用產(chǎn)生X效應(yīng)時各自所需濃度，均可由中效方程式求得。應(yīng)用CompuSyn 1.0軟件繪制Fa-CI曲線，若CI<1，認(rèn)為兩藥為協(xié)同作用，CI=1為相加作用，CI>1為拮抗作用。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期HT-1080細(xì)胞，制成密度為1×109/L的細(xì)胞懸液，以每孔2 mL接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分成無藥對照(control)組、順鉑組(終濃度為2 μmol/L)、青藤堿組(終濃度為0.4 mmol/L)以及順鉑與青藤堿聯(lián)合用藥(DDP+SIN)組(終濃度分別為2 μmol/L和0.4 mmol/L)，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，PBS洗滌1次，先加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀分析檢測。

2.6Western blot法檢測蛋白水平細(xì)胞分組及處理方法同2.5，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉1 h，加入抗Bcl-2、Bax、CTR1、GST-π和β-actin的 I 抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL試劑進行發(fā)光反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行拍照，使用Image J 1.45S軟件進行灰度分析。實驗重復(fù)3次。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　青藤堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對HT-1080細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，HT-1080細(xì)胞經(jīng)順鉑或青藤堿處理48 h，細(xì)胞活力均顯著受到抑制(P<0.05)，IC50分別為6.50 μmol/L和1.06 mmol/L；當(dāng)兩種藥物聯(lián)合作用時，與順鉑單藥相比，對細(xì)胞活力的抑制作用有不同程度的增強(P<0.05)，藥物聯(lián)合作用48 h的IC50為0.46 mmol/L，見圖1。

Figure 1.The inhibition rate of HT-1080 cells induced by cisplatin and sinomenine.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsthe DDP group.
圖1青藤堿與順鉑聯(lián)合抑制HT-1080細(xì)胞活力

2　青藤堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用評價

由CompuSyn 1.0軟件計算得出的Fa-CI曲線可知，當(dāng)Fa<0.25時，CI>1，青藤堿與順鉑聯(lián)用為拮抗效應(yīng)；當(dāng)Fa>0.25時，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，見圖2。

Figure 2.The graph of combination index (CI) and fraction affected (Fa).
圖2藥物聯(lián)合指數(shù)與抑制率曲線圖

3　青藤堿與順鉑聯(lián)合作用進一步促進HT-1080細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，HT-1080細(xì)胞經(jīng)2 μmol/L順鉑或0.4 mmol/L青藤堿處理48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為17.49%±4.78%和21.73%±3.95%，均明顯高于對照組(P<0.05)；兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率為42.58%±5.60%，與順鉑組相比顯著升高(P<0.05)。表明青藤堿可協(xié)同增強順鉑誘導(dǎo)HT-1080細(xì)胞凋亡，見圖3。

Figure 3.The effect of DDP and SIN on the apoptosis of HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
圖3青藤堿和順鉑對HT-1080細(xì)胞凋亡的影響

4　青藤堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對CTR1和GST-π蛋白水平的影響

CTR1是細(xì)胞攝取順鉑的重要途徑，上調(diào)CTR1表達(dá)可增加順鉑在細(xì)胞內(nèi)的積累量[8]。GST-π可催化谷胱甘肽與順鉑共價結(jié)合而使之失活[9]。Western blot實驗的結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組CTR1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，GST-π蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與之相反，青藤堿組CTR1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，GST-π蛋白水平則明顯下降(P<0.05)；與順鉑組相比，兩藥聯(lián)合組CTR1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，GST-π蛋白水平顯著下降(P<0.05)，見圖4。

5　青藤堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

Bcl-2家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。Western blot實驗的結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組和青藤堿組Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與順鉑組相比，兩藥聯(lián)合組Bcl-2蛋白水平顯著進一步下降(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect of DDP and SIN on the protein levels of CTR1 and GST-π in the HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
圖4青藤堿和順鉑對CTR1和GST-π蛋白水平的影響

Figure 5.The effect of DDP and SIN on the protein levels of Bcl-2 and Bax in the HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
圖5青藤堿和順鉑對Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

討　　論

在本研中，我們采用CCK-8法檢測了青藤堿與順鉑對人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明青藤堿與順鉑均可顯著抑制HT-1080細(xì)胞活力且具有劑量依賴性，兩藥聯(lián)用則對細(xì)胞活力的抑制作用更加顯著。進一步采用Chou-Talalay中效分析法對兩藥的聯(lián)合效應(yīng)進行評價后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制率超過25%時，兩藥聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。與之相一致，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也表明，青藤堿既可導(dǎo)致HT-1080細(xì)胞凋亡，也能協(xié)同增強順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果說明，青藤堿可增強人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞對順鉑的敏感性。

順鉑在臨床上被廣泛用于不同惡性腫瘤的治療,如肺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌和肉瘤等。在順鉑化療初期雖然可以獲得較好的治療效果，但其較強的毒副作用以及逐漸產(chǎn)生的耐藥性已成為限制其療效的主要因素。順鉑耐藥性的產(chǎn)生涉及多種機制，其在細(xì)胞內(nèi)積累量的減少是其中重要原因之一。目前多項實驗數(shù)據(jù)表明，胞膜上的CTR1是細(xì)胞攝取順鉑的重要途徑之一[10-13]。?hrvik等[11]研究證實，CTR1胞外段可直接與順鉑結(jié)合，組織蛋白酶L/B是裂解CTR1胞外段的限速酶，其抑制劑可增加細(xì)胞對順鉑的攝取進而增強順鉑的毒性作用。Wang等[12]采用RNA干擾技術(shù)沉默CTR1基因表達(dá)可降低人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞對順鉑的敏感性。

由于細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度較低，當(dāng)順鉑進入細(xì)胞后，其氯配體先被水分子取代形成水合物，然后與細(xì)胞內(nèi)大分子的親核基團結(jié)合，DNA是其主要的作用靶點。順鉑與DNA形成的不同類型的復(fù)合物成能夠抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。在GST-π的催化下，胞質(zhì)中的順鉑可與谷胱甘肽結(jié)合形成復(fù)合物，這不僅使順鉑無法進入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，還有利于腫瘤細(xì)胞將其轉(zhuǎn)移至胞外，從而降低順鉑的細(xì)胞毒性作用[9]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)順鉑可下調(diào)HT-1080細(xì)胞中CTR1的蛋白水平和上調(diào)GST-π的蛋白水平，而青藤堿對CTR1和GST-π蛋白水平的調(diào)控則與之相反，兩藥聯(lián)用可消除順鉑對CTR1和GST-π蛋白水平的影響。這提示，青藤堿可能通過上調(diào)CTR1蛋白水平和下調(diào)GST-π蛋白水平增加順鉑在細(xì)胞內(nèi)的積累量，以提高順鉑的細(xì)胞毒性作用。

由于順鉑通過誘導(dǎo)凋亡的方式殺死腫瘤細(xì)胞，Bcl-2家族蛋白水平的變化會影響順鉑的細(xì)胞毒性作用。Bcl-2家族根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可以分為2大類：一類是抗凋亡蛋白，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W和Mcl-1等，另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bad和Bid等。當(dāng)Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)時，順鉑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可被顯著抑制[15-16]。本研究結(jié)果顯示，青藤堿和順鉑均可顯著上調(diào)Bax蛋白水平以及下調(diào)Bcl-2蛋白水平，二者聯(lián)用可協(xié)同增強對Bax和Bcl-2蛋白水平的調(diào)控。這初步揭示了青藤堿增強順鉑誘導(dǎo)HT-1080細(xì)胞凋亡的分子機制。

綜上所述，青藤堿可協(xié)同增強人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞對順鉑的敏感性，這可能與青藤堿上調(diào)CTR1和Bax蛋白水平以及下調(diào)GST-π和Bcl-2蛋白水平有關(guān)。

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