棕櫚酸通過上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的炎癥反應(yīng)*

張　暢，羅肖肖，晏　勇，鐘　珊，趙　蕾

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起冠心病和腦梗塞等心腦血管疾病的主要原因[1]。目前普遍公認(rèn)AS是一種多因素引起的血管炎癥性疾病，多種炎癥細(xì)胞和炎癥/趨化因子參與了AS的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[2-3]。巨噬細(xì)胞大量吞噬膽固醇后形成泡沫細(xì)胞是AS早期的特征性病理表現(xiàn)，因此巨噬細(xì)胞在AS病理進程中發(fā)揮著重要的作用，可能成為治療AS的重要靶點[4]。既往大量研究已經(jīng)證實，高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥與AS的形成密切相關(guān)[5]。然而，在我國高脂血癥以高甘油三酯為主，甘油三酯水解后可以產(chǎn)生大量游離脂肪酸[6]；游離脂肪酸可以刺激巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等產(chǎn)生和分泌大量白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等炎癥/趨化因子，激活機體炎癥反應(yīng)，參與代謝綜合征，如糖尿病和脂肪肝等的產(chǎn)生[7]。近期也有研究提示，游離脂肪酸在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8]，但尚不清楚其具體的分子機制。

CD36，又稱脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT)，是一種廣泛分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞上的膜糖蛋白，其作為B類清道夫受體，可以結(jié)合多種配體，如長鏈游離脂肪酸和氧化性低密度脂蛋白等[9]。既往研究證實，巨噬細(xì)胞上CD36能與氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)結(jié)合，促進了巨噬細(xì)胞中膽固醇的積聚，同時這種結(jié)合可以通過活化NF-κB信號通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加劇AS的進展[10]。那么，游離脂肪酸能否通過上調(diào)巨噬細(xì)胞上CD36的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生呢？棕櫚酸(palmitate)是人體血液中含量最多的一種游離脂肪酸，廣泛用于脂毒性和代謝綜合征等體外研究[11]。因此本研究擬用棕櫚酸處理人源單核巨噬細(xì)胞THP-1，檢測其對CD36表達(dá)及炎癥因子和趨化因子的影響，并構(gòu)建低表達(dá)CD36的細(xì)胞模型，從而從正反兩方面探討CD36在棕櫚酸誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

材　料　和　方　法

1　細(xì)胞株

人源單核巨噬細(xì)胞THP-1購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

2　主要試劑

胎牛血清購于UTR；RPMI-1640培養(yǎng)基購于HyClone；棕櫚酸和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購于Sigma；Trizol RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR real-time PCR試劑盒購于TaKaRa；BCA蛋白含量檢測試劑盒和抗β-actin兔抗人多克隆抗體購于北京鼎國公司；抗FAT/CD36兔抗人多克隆抗體購于Novus；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或鼠IgG II抗購于北京中杉金橋公司；PVDF膜購于Millipore；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購于Bio-Rad；ELISA(TNF-α和IL-6)檢測試劑盒購于欣博盛公司；引物由北京華大基因公司合成。

3　主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代方法從-80 ℃冰箱中取出THP-1細(xì)胞，37 ℃水浴鍋中快速復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)在含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1×105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。3～4 d傳代 1 次，每2 d換液 1 次，每天將細(xì)胞吹散。

3.2細(xì)胞的誘導(dǎo)及處理方法給予160 nmol/L佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為貼壁生長的巨噬細(xì)胞后，再用含0.2% BSA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基處理12 h后，根據(jù)既往研究[12]，在本實驗中給予不同濃度(0、0.1和0.2 mmol/L)的棕櫚酸處理細(xì)胞，處理時間為24 h。

3.3干擾CD36表達(dá)的實驗分組及處理CD36-siRNA (siCD36)由上海吉瑪公司設(shè)計并合成，正義鏈為5’-GGCUGUGUUUGGAGGUAUUCUTT-3’，反義鏈為3’-TTCCGACACAAACCUCCAUAAGA-5’；陰性對照(scrambled RNA，scrRNA)亦由該公司提供。將THP-1接種于6孔板或Transwell小室，用scrRNA及siCD36分別轉(zhuǎn)染THP1細(xì)胞：50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入0.5 μg siRNA，短暫輕柔渦旋，加入1.5 μL X-TremeGENETMHP DNA Transfection Reagent，短暫輕柔渦旋，室溫孵育15 min(15～25 ℃)，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到THP-1源性巨噬細(xì)胞中12 h，加入佛波酯誘導(dǎo)THP-1貼壁分化成巨噬細(xì)胞，再用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞，并給予棕櫚酸(0.2 mmol/L)負(fù)荷處理24 h，進行后續(xù)實驗。

3.4Western blot實驗取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞常規(guī)誘導(dǎo)接種于6 cm皿中，饑餓處理12 h后，給予不同濃度的棕櫚酸(0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L)處理24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，加RIPA(含蛋白酶抑制劑)400 μL，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液，用BCA法進行蛋白定量。取50 μg蛋白經(jīng)8% SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，5% BSA室溫封閉1 h后，加入抗CD36和β-actin抗體(1∶3 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，II抗37 ℃搖床孵育1 h，TBST清洗2次，每次15 min,最后用TBS洗滌1次，利用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色曝光,采用ImageJ軟件進行分析。

3.5Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)誘導(dǎo)接種于6孔板，待饑餓12 h后，給予棕櫚酸處理24 h，按照Trizol試劑盒說明，提取細(xì)胞中總RNA并檢測其含量和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min后終止。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃保存。運用OneStep RT-PCR進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，進行39個循環(huán)。記錄每個標(biāo)本和內(nèi)參的Ct值，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1　Real-time PCR的上、下游引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.6Transwell小室遷移實驗參照Ding等[13]用Transwell遷移實驗檢測THP-1細(xì)胞遷移的方法，調(diào)整THP-1細(xì)胞懸液濃度至4×108/L，取300 μL加入到Transwell遷移系統(tǒng)的上室小室中(Corning)，再將上層小室放入培養(yǎng)孔中誘導(dǎo)貼壁后，換成含0.2% BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，給予棕櫚酸(0.1 mmol/L)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，PBS清洗細(xì)胞小室上層腔室3次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色，用棉棒仔細(xì)去除上層小室側(cè)未遷移的細(xì)胞，用倒置顯微鏡隨機選取6個視野進行拍片(×200倍),并統(tǒng)計遷移至下室的平均細(xì)胞數(shù)量。

3.7ELISA法檢測THP-1細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的水平取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL，常規(guī)誘導(dǎo)貼壁24 h后，設(shè)空白組、棕櫚酸(0.1 mmol/L)組、棕櫚酸(0.2 mmol/L)組、scrRNA組和siCD36組，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的水平，同時用BCA法檢測蛋白濃度，對其含量進行標(biāo)化。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義情況下，兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD檢驗)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　棕櫚酸對THP-1細(xì)胞CD36表達(dá)的影響

給予不同濃度棕櫚酸處理THP-1細(xì)胞24 h后，分別用real-time PCR和Western blot法檢測THP-1細(xì)胞內(nèi)CD36的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予棕櫚酸處理THP-1細(xì)胞后，CD36 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The effect of palmitate on the expression of CD36 in the THP-1 cells.A:the mRNA level of CD36 determined by real-time PCR; B:the protein expression of CD36 detected by Western blot.Mean±SD.n=6 or 3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol/L group.
圖1棕櫚酸對THP-1細(xì)胞CD36表達(dá)的影響

2　棕櫚酸對THP-1細(xì)胞炎癥因子及趨化因子表達(dá)的影響

給于不同濃度棕櫚酸處理THP-1細(xì)胞24 h后，利用real-time PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-6及趨化因子MCP-1的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比，棕櫚酸處理THP-1細(xì)胞后，炎癥因子和趨化因子表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，見圖2A。

收集以上細(xì)胞的上清液，用ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，棕櫚酸處理THP-1細(xì)胞后，炎癥因子的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2.The effect of palmitate on the expression of inflammatory cytokines and chemokines in THP-1 cells.A:the mRNA levels of inflammatory cytokines and chemokine determined by real-time PCR; B:the protein levels of inflammatory cytokines in supernatant detected by ELISA.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol/L group.
圖2棕櫚酸對THP-1細(xì)胞炎癥因子及趨化因子表達(dá)的影響

3　棕櫚酸對THP-1細(xì)胞遷移水平的影響

常規(guī)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后，給予THP-1細(xì)胞棕櫚酸(0.1 mmol/L)處理24 h后，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給予棕櫚酸處理，THP-1細(xì)胞的遷移能力明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of palmitate on the migration ability of the THP-1 cells measured by Transwell assay (×200).Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 mmol/L group.
圖3棕櫚酸對THP-1細(xì)胞遷移cel能力的影響

4　低表達(dá)CD36的THP-1細(xì)胞模型的建立及對炎癥因子表達(dá)的影響

將siCD36及scrRNA瞬時轉(zhuǎn)入THP-1細(xì)胞，構(gòu)建CD36基因沉默的THP-1細(xì)胞和陰性對照THP-1細(xì)胞。利用Western blot法檢測CD36蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與scrRNA組比較，siCD36組蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見圖4A。這表明沉默CD36基因的THP-1細(xì)胞模型建立成功。

在scrRNA組和siCD36組的THP-1細(xì)胞給予棕櫚酸(0.2 mmol/L)負(fù)荷處理24 h后，采用real-time PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，CD36被干擾后，THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)明顯降低，炎癥反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。

收集細(xì)胞上清液，運用ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，與對照組相比，CD36被干擾后，THP-1細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)水平明顯降低，炎癥反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4C。

5　抑制CD36表達(dá)對THP-1細(xì)胞遷移的影響

給予scrRNA組和siCD36組細(xì)胞棕櫚酸處理24 h，Transwell法檢測2組細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示，相比于scrRNA組，siCD36組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.05)，表明該組細(xì)胞的遷移能力降低，見圖5。

Figure 4.Knockdown ofCD36 expression by RNA interference (siCD36) in the THP-1 cells.A:the effect of siCD36 on CD36 protein expression in the THP-1 cells detected by Westem blot; B:the mRNA of inflammatory cytokines detected by real-time PCR; C:the protein levels of inflammatory cytokines in the cultured supernatant detected by ELISA.Mean±SD.n=3 or 6.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled RNA (scrRNA) group.
圖4干擾THP-1細(xì)胞CD36基因表達(dá)效果檢測

Figure 5.The effect ofCD36 expression knockdown (siCD36) on the THP-1 cell migration ability (×200).Mean±SD.n=5.**P<0.01vsscrambled RNA (scrRNA) group.
圖5CD36基因沉默對THP-1細(xì)胞遷移能力的影響

討　　論

隨著生活水平的提高，動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為威脅人類健康的一大殺手。目前已經(jīng)公認(rèn),動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)動脈粥樣硬化病變炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞來源。高脂肪酸血癥與動脈粥樣硬化的發(fā)生呈正相關(guān)[14]，棕櫚酸(C16:0)不僅是血清中含量最高的游離脂肪酸，也是人體游離脂肪酸致炎的主要成分[15]。因此探討棕櫚酸對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響并探討其發(fā)生機制，對防治AS及其相關(guān)心腦血管疾病具有非常重要的意義。

CD36作為B類清道夫受體，是多種細(xì)胞上表達(dá)的膜糖蛋白，可識別較多致炎的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，如oxLDL、飽和脂肪酸及淀粉樣蛋白等[16]，可促進單核細(xì)胞聚集及促進炎癥反應(yīng)，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[17]。CD36在動脈粥樣硬化患者動脈斑塊的表達(dá)明顯高于正常人。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示：高表達(dá)的血漿可溶性CD36(soluble CD36，sCD36)會增加患動脈粥樣硬化、胰島素抵抗及脂肪肝的風(fēng)險[18]。

既往研究多關(guān)注CD36在介導(dǎo)oxLDL的攝取，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成中的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可以顯著上調(diào)THP-1細(xì)胞CD36的表達(dá)。推測其可能機制為棕櫚酸及其代謝產(chǎn)物可直接激活轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma，PPAR-γ)，促進CD36的轉(zhuǎn)錄[20]；而且棕櫚酸可以明顯促進CD36條帶由寡核糖體部分向多聚核糖體發(fā)生偏移，增強CD36蛋白的翻譯[21]。同時，我們還發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可以顯著上調(diào)THP-1細(xì)胞中炎癥因子及趨化因子，并且促進了THP-1細(xì)胞的遷移。進一步，我們構(gòu)建了低表達(dá)CD36的THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制CD36表達(dá)可以明顯改善棕櫚酸誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞遷移、炎癥因子及趨化因子表達(dá)的增加。既往研究提示，CD36的配體oxLDL和β-淀粉樣蛋白可以促進巨噬細(xì)胞CD36募集Toll樣受體4和6(Toll-like receptor 4/6，TLR4/6)，形成CD36/TLRs共聚體，激活NF-κB通路，觸發(fā)無菌性炎癥的發(fā)生[22]。我們推測棕櫚酸可能也通過類似的信號通路激活了巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但具體機制尚有待后續(xù)實驗驗證。

綜上所述，棕櫚酸能夠上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)，促進THP-1細(xì)胞遷移并促進其產(chǎn)生大量炎癥因子及趨化因子。抑制CD36可以明顯抑制巨噬細(xì)胞遷移、降低THP-1細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)，從而改善炎癥反應(yīng)。因此CD36在棕櫚酸介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起到重要作用，這可能為臨床治療及預(yù)防動脈粥樣硬化提供了新的思路。

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