腹水草水提液對乙醇損傷人胃黏膜上皮細胞活性及凋亡的影響研究

浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 杭州 310053

胃潰瘍是一種常見的慢性疾病，自然人群中發(fā)病率高達10%。日常生活中人們對乙醇（酒精）的濫用，是胃潰瘍高發(fā)的重要誘因之一。濫用乙醇后，可誘導機體合成、分泌活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS通過氧化應激反應，攻擊細胞基本成分如蛋白質、核酸等[1-2]，一方面誘導磷脂膜中脂肪酸的過氧化反應，導致脂質過氧化物、氧自由基及脂質分解產物等有毒物質的產生[3-4]，另一方面還會誘導細胞凋亡[1,5-6]。目前對于胃潰瘍臨床上較多采取內科保守治療手段，質子泵抑制劑（如泮托拉唑）、胃黏膜保護劑、H2受體拮抗劑（如雷尼替?。┑仁侵委熚笣兊某Ｒ?guī)藥物[7-8]。這些西藥治療胃潰瘍的近期療效較為理想，但難以根治，停藥后胃潰瘍極易復發(fā)，服藥后部分患者還可能出現頭痛、腹瀉、惡心等不良反應，對血腦屏障的完整性也有一定影響[9-10]。因此，胃潰瘍的根治及復發(fā)的預防仍是當前研究領域的重要課題。

腹水草（Veronicastrum axillare,V.axillare）別名爬巖紅、多穗草等，為玄參科腹水草屬草本植物，微寒，味苦，歸腎、脾、肝經[11]。主要功效有緩解小便不利、逐水消腫等。其水煎劑在民間和臨床上用于治療胸腔積液[12]、腎炎[13]、肝硬化腹水[14]和胃潰瘍[15-16]等。本課題組的前期研究結果表明，腹水草水提液對無水乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷具有顯著的保護作用[15-19]；大鼠含藥血清對5%乙醇損傷的GES-1細胞亦具有顯著的保護作用[15]。本文直接用腹水草水提液預處理GES-1細胞，探討其對GES-1細胞的保護作用及其對細胞凋亡的影響，為腹水草的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 腹水草水提液的制備 腹水草全草采自浙江縉云，經浙江中醫(yī)藥大學姚振生教授鑒定為玄參科腹水草屬植物腹水草（V.axillare）。將腹水草全草陰干至恒重、粉碎，過80目篩，取100g腹水草粉末，以8倍體積的蒸餾水浸泡30min，采用回流的方法進行提取，每次1.5h，重復3次，合并濾液，將濾液置于旋轉蒸發(fā)儀中，減壓濃縮至100mL，即得到濃度為1 g·mL-1的腹水草水提液，經0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 人胃黏膜上皮細胞株GES-1細胞購于南京市科佰生物科技有限公司（批號：CBP60512）；雷尼替丁膠囊購于上?，F代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司（批號：17101204），使用時采用雙蒸水配制成1 g·mL-1的溶液，4℃保存?zhèn)溆?；DMEM培養(yǎng)基購于HyClone公司（批號：AC10253805）；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司（批號：20170315）；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸購于上海碧云天生物技術有限公司（批號：c0203）；磺酰羅丹明 B（sulforhodamine B，SRB）購于上海研拓生物科技有限公司（批號：20223EAV）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于 Sigma公司（批號：20170424）；Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司（批號：6301518）。

1.3 實驗儀器 Thermo3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、3K15型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）、Multiskan Flash型酶標儀（美國Thermo公司）、Q5000型微量紫外可見分光光度計（美國Quawell公司）、TE2000-S型倒置熒光相差顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 GES-1細胞的傳代培養(yǎng) GES-1細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用含 10%FBS、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞生長到80%～90%時用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化后傳代。對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4.2 腹水草水提液和雷尼替丁對GES-1細胞存活率的影響 取對數生長期細胞，以1×105個/mL接種于 96孔板，每孔 100μL，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細胞貼壁后，根據前期預實驗結果，將細胞分為正常組、腹水草水提液不同劑量組（5、10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120、10 240、20 480、40 960 μg·mL-1）、雷尼替丁不同劑量組（2.8、5.6、11.25、22.5、45、90、180、360、720、1 440、2 880、5 760、11 520、23 040 μg·mL-1），每組 6 個復孔。正常組加入100μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別加入100μL含相應劑量藥物的DMEM培養(yǎng)基。待培養(yǎng)48h后，棄去原培養(yǎng)基，采用SRB法檢測細胞存活率。每孔加入10%三氯乙酸100μL，4℃固定1h，蒸餾水沖洗5遍，自然晾干后，每孔加入0.57 mg·mL-1SRB溶液，室溫下染色30min，棄去SRB溶液，用1%醋酸沖洗5遍，自然晾干。每孔再加入10 μmol·L-1的Tris-base溶液100μL，待結晶體完全溶解，酶標儀515mm波長檢測各孔的OD。細胞存活率(%)=實驗組OD/正常組OD×100%；選擇細胞存活率＞90%的藥物濃度作為最大安全濃度（maximum non-toxic concentration，TC0）進行后續(xù)實驗；利用SPSS 19.0統計軟件計算腹水草水提液和雷尼替丁對GES-1細胞增殖的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.4.3 腹水草水提液對乙醇損傷GES-1細胞存活率的影響 細胞的接種和培養(yǎng)方法同1.4.2。將細胞分為正常組，模型組，雷尼替丁組，腹水草水提液低、中、高劑量組（具體劑量根據1.4.2的結果確定），每組6個復孔。正常組及模型組加入100μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基。雷尼替丁組加入100μL含45 μg·mL-1雷尼替丁的DMEM培養(yǎng)基，腹水草水提液低、中、高劑量組則分別加入含 20、40、80 μg·mL-1腹水草水提液的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，除正常組加入100μL DMEM培養(yǎng)基以外，其余各組每孔加入100μL含5%乙醇的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)4h后，SRB法檢測細胞存活率，計算公式同1.4.2。

1.4.4 腹水草水提液對乙醇損傷GES-1細胞凋亡的影響 采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。取對數生長期GES-1細胞，以1×106個/mL的數量接種于6孔板，每孔2mL，于37℃、5%CO2孵育，待細胞鋪滿單層后，棄去上清液，將細胞分為正常組，模型組，雷尼替丁組，腹水草水提液低、中、高劑量組。正常組和模型組分別加入2mL DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別加入2mL含雷尼替丁、各劑量腹水草水提液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，棄去原培養(yǎng)液，除正常組加入2mL DMEM培養(yǎng)基外，其余各組每孔加入2mL含5%乙醇的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，以不含EDTA的胰酶進行消化，吹打細胞，1 000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，加入1mL預冷的PBS（pH=10.5），清洗細胞 2次，輕輕震蕩懸浮細胞，2 000r/min，4℃離心5min。將細胞重懸于200μL Binding Buffer，加入 5μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，室溫下避光孵育 15min。加入 5μL PI和 300μL Binding Buffer，1h內以流式細胞儀檢測。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey HSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹水草水提液和雷尼替丁對GES-1細胞存活率的影響 腹水草水提液劑量在5～160 μg·mL-1時，與正常組比較，GES-1細胞的存活率差異無統計學意義（P＞0.05）；當劑量≥320 μg·mL-1時，細胞存活率均顯著低于正常組（P＜0.01），且呈劑量依賴性。見表1。其 TC0和 IC50分別為 160 μg·mL-1和 5 096 μg·mL-1。當雷尼替丁劑量在 2.8～180 μg·mL-1時，GES-1 細胞的存活率顯著高于90%（P＜0.05或P＜0.01）；當其劑量≥360 μg·mL-1時，細胞的存活率顯著低于正常組（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。見表1。其TC0和 IC50分別為 180 μg·mL-1和 5 396 μg·mL-1。根據藥物毒性實驗結果，后續(xù)實驗中將腹水草水提液低、中、高劑量分別確定為 20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 80 μg·mL-1；雷尼替丁劑量為 45 μg·mL-1。

表1 腹水草水提液和雷尼替丁對GES-1細胞存活率的影響Tab.1 Effects of V.axillare water extract and Ranitidine on survival rates of GES-1 cells

2.2 各組GES-1細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察，正常組細胞呈致密單層貼壁生長，梭形，排列緊密，漂浮的細胞極少；模型組細胞大量皺縮，變圓，各細胞間隙增大，細胞間的連接減少，大量細胞彼此分離，漂浮的細胞顯著增多；雷尼替丁組大部分細胞呈致密性生長，各細胞間隙小，細胞間連接緊密；腹水草水提液低、中、高劑量組隨著藥物濃度的增加，細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)逐漸接近于正常組。見圖1。

圖1 各組GES-1細胞形態(tài)學觀察（10×）Fig.1 Morphological observation of GES-1 cells in each group(10×)

2.3 各組GES-1細胞存活率比較 與正常組相比，模型組、雷尼替丁組和腹水草水提液低劑量組的細胞存活率顯著降低（P＜0.01或 P＜0.05），腹水草水提液中、高劑量組的細胞存活率與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，雷尼替丁組及腹水草水提液低、中、高劑量組細胞存活率均顯著升高（P＜0.01）。腹水草水提液中、高劑量組細胞的存活率均顯著高于雷尼替丁組和低劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。見表 2。

2.4 各組GES-1細胞凋亡率比較 正常組GES-1細胞的早期凋亡率為（1.45±0.05）%，5%乙醇作用4h后，模型組細胞凋亡率顯著高于正常組（P＜0.01）；低、中、高劑量腹水草水提液預處理48h后，細胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.01），并呈劑量依賴性；其中腹水草水提液高劑量組GES-1細胞的凋亡率最低，與腹水草水提液低、中劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），但與正常組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。雷尼替丁組的細胞凋亡率顯著低于模型組和腹水草水提液低劑量組（P＜0.01或 P＜0.05），但與腹水草水提液中、高劑量組間無統計學差異（P＞0.05）。見表 2、圖 2。

表2 各組GES-1細胞存活率和凋亡率比較Tab.2 Comparison of the survival rate and apoptosis rate of GES-1 cells in each group

圖2 各組GES-1細胞凋亡率檢測Fig.2 Apoptosis rate of GES-1 cells in each group

3 討論

胃黏膜保護受到人們的日益關注，當胃受到一定程度的損傷刺激時，胃黏膜立即啟動自我防御與修復功能，這是胃黏膜自身抵抗疾病的一種特殊屏障。胃黏膜損傷后的修復是一個比較復雜、受多種因素影響的網絡調控過程。乙醇具有脂溶性的特點，大量、高濃度的乙醇可直接引起細胞結構的破壞和血流停滯，使組織細胞缺氧、缺血，從而導致胃黏膜組織損傷[18-19]。西藥治療胃黏膜損傷雖然在短期內可以達到良好的效果，但難以根治，停藥后易復發(fā)[8-9]，因此患者容易對西藥產生依賴性和耐藥性，而且西藥存在一些毒副作用，如引起精神錯亂、定向力障礙、幻覺、譫妄等[10]，還可能導致黃疸和肝臟損害[9]，限制了其在臨床上的應用。傳統中藥具有毒副作用小、不易產生耐藥性、多靶點治療等優(yōu)勢[20-24]，從而得到越來越多的使用。

本項目組的前期研究表明，腹水草水提液對大鼠乙醇型胃潰瘍具有拮抗作用，能顯著抑制胃液和胃酸分泌、降低胃蛋白酶活性，減少自由基生成，促進氧自由基的清除，抗脂質過氧化，減輕炎癥反應等，從而實現對胃黏膜的保護和修復[15-16,18-19]。對SD大鼠進行腹水草水提液灌胃給藥后，大鼠含藥血清對乙醇損傷的GSE-1細胞具有顯著的保護作用，其作用機制與減輕炎癥反應密切相關[15]。為了明確腹水草水提液在體外對GES-1細胞是否具有毒副作用，同時進一步明確其保護GES-1細胞的有效成分是其天然成分還是經動物消化吸收后的代謝產物，項目組設計了本研究。本研究結果表明，在 5～160 μg·mL-1的劑量范圍內，腹水草水提液對GES-1細胞無毒性，但當劑量達到320 μg·mL-1及以上時，卻顯著降低細胞的存活率。這可能是由于增大劑量后，腹水草水提液中的某些成分對細胞的生長增殖具有毒性作用，但具體有待進一步研究。

本研究結果表明，加入5%乙醇培養(yǎng)4h后，GES-1細胞的存活率為52.26%，這一結果與以往的研究一致[25]，表明乙醇誘導細胞損傷模型造模成功。用含腹水草水提液的培養(yǎng)基預處理GES-1細胞48h，能夠顯著降低乙醇對GES-1細胞存活率的影響，尤其是腹水草水提液中、高劑量組細胞的存活率均顯著高于雷尼替丁組。這不僅在細胞水平上驗證了腹水草水提液對GES-1細胞的保護作用，同時說明中、高劑量腹水草水提液對胃黏膜的保護作用優(yōu)于雷尼替丁，而且還證明腹水草水提液中存在保護GES-1細胞的天然活性成分，具體成分還有待于深入研究加以明確。

細胞凋亡是一種ATP依賴性的并由細胞嚴格調控的細胞程序性死亡。在正常情況下，機體通過細胞凋亡來消除體內過量、冗余、老化和不健康的細胞以維持機體內環(huán)境的平衡和穩(wěn)定[26]。乙醇引起的胃黏膜損傷主要包括由于過度飲酒誘發(fā)的胃潰瘍、胃黏膜應激性損傷、胃出血等，在臨床上表現為腹部疼痛、脹滿、嘔吐、燒心等癥狀[1]。以往研究表明，乙醇能夠誘導GES-1細胞進入早期凋亡，且具有濃度依賴性，但該誘導作用具有時效性，持續(xù)60min后會逐漸減弱，這可能與乙醇的揮發(fā)性有關。乙醇的揮發(fā)導致局部濃度逐漸下降，不足以長時間抑制細胞的自我修復能力。因此在實驗過程中需要及時補充乙醇（刺激劑）或者加大給藥的初始劑量，以確保促凋亡作用的持續(xù)性[1]。既往研究證明，乙醇濃度達到3%時即可對細胞產生明顯的損傷和誘導凋亡作用，但由于乙醇易揮發(fā)的特性，3%乙醇作用持續(xù)時間較短，對細胞的損傷和誘導凋亡作用有限[1]。本實驗為確保乙醇造模條件的穩(wěn)定及具有重復性，參考李洪亮等的研究[25]，確定以5%乙醇作用4h作為GES-1細胞損傷的造模條件。結果顯示，5%乙醇誘導4h后，顯著抑制GES-1細胞的增殖，并誘導GES-1細胞的凋亡率上升至22.87%，這一結果與以往的研究結果一致[27]。本研究結果顯示，腹水草水提液具有降低乙醇誘導的細胞早期凋亡的作用，但其有效成分和具體的作用機制仍有待于進一步研究。

綜上所述，在 5～160 μg·mL-1的劑量范圍內，腹水草水提液對GES-1細胞無毒性。在2.8～180 μg·mL-1的劑量范圍內，雷尼替丁亦對GES-1細胞無毒性，其中在 5.6～22.5 μg·mL-1的劑量范圍內，雷尼替丁可促進細胞的增殖，但當劑量≥360 μg·mL-1時，對GES-1細胞具有損傷作用。腹水草水提液呈劑量依賴性地提高乙醇損傷GES-1細胞的存活率，并降低其凋亡率，且其作用優(yōu)于雷尼替丁，尤其是腹水草水提液中、高劑量組作用較明顯，但具體的作用機制有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]劉翠玲,黃可兒,陳柏書,等.乙醇誘導人胃上皮細胞株凋亡的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2014,25(1)：101-106.LIU Cuiling,HUANG Ke’er,CHEN Baishu,et al.Establishment of human gastric epithelial cells apoptosis model induced by ethanol[J].Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology,2014,25(1)：101-106.

[2]Tyessen S,Singer M V.Alcohol related diseases of the oesophags and stomach[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2003,17(4)：557-573.

[3]Asmari A A,Shahrani H A,Masri N A,et al.Vanillin abrogates ethanol induced gastric injury in rats via modulation of gastric secretion,oxidative stress and inflammation[J].Toxicol Rep,2015,12(3)：105-113.

[4]Slomiany A,Piotrowski E,Piotrowski J,et al.Impact of ethanol on innate protection of gastric mucosal epithelial surfaces and the risk of injury[J].J Physiol Pharmacol,2000,51(3)：433-447.

[5]楊成林,王尉,周五二,等.MicroRNA-497對人膀胱癌EJ細胞增殖和凋亡的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2017,33(20)：3348-3353.YANG Chenglin,WANG Wei,ZHOU Wu’er,et al.Effect of microRNA-497 on the proliferation and apoptosis of bladder cancer cell line EJ[J].The Journal of Practical Medicine,2017,33(20)：3348-3353.

[6]Arab H H,Salama S A,Omar H A,et al.Diosmin protects against ethanol-induced gastric injury in rats：novel anti-ulcer actions[J].PLoS One,2015,10(3)：417.

[7]張素瓊.泮托拉唑、雷尼替丁治療Hp陽性消化性潰瘍對比觀察[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(25)：48-49.ZHANG Suqiong.Contrast observation of helicobacter pylori positive peptic ulcer treated with Pantoprazole and Ranitidine[J].China Practical Medicine,2009,4(25)：48-49.

[8]藥俊芳.探討治療胃潰瘍的方法與選擇方式[J].醫(yī)學信息(中旬刊),2011,24(4)：1362.YAO Junfang.To discuss the method of treating gastric ulcer and the way of choosing[J].Medical Information,2011,24(4)：1362.

[9]陳斌,金曉玲.雷尼替丁的不良反應[J].海峽藥學,2007,19(1)：97-99.CHEN Bin,JIN Xiaoling.Adverse reaction of ranitidine[J].Strait Pharmaceutical Journal,2007,19(1)：97-99.

[10]蔡國軍,陳國鋒.老年患者術后雷尼替丁和甲硝唑聯用致精神癥狀37例[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2007,14(11)：43.CAI Guojun,CHEN Guofeng.In elderly patients postoperative with Ranitidine and Metronidazole induced psychiatric symptom in 37 cases[J].Chinese Journal of Rural Medicine and Pharmacy,2007,14(11)：43.

[11]鄧雪紅.腹水草（爬巖紅）的化學成分及抗炎活性研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學,2013：1-2.DENG Xuehong.Chemical constituents and anti-inflammatory activity of Veronicastrum axillare[D].Fuzhou：Fujian University of Traditional Chinese Medicine,2013：1-2.

[12]Zhang J F,Zhang Y M,Yan C D,et al.Neuroregulative mechanism ofhypothalamicparaventricularnucleuson gastric ischemia-reperfusion injury in rats[J].Life Sci,2002,71(31)：1501-1510.

[13]黨旋,趙兵,高昂,等.腹水草屬藥學研究概況[J].安徽農業(yè)科學,2011,39(32)：19801-19802.DANG Xuan,ZHAO Bing,GAO Ang,et al.Overview of pharmacological research on Veronicastrum Heist.ex Farbic[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(32)：19801-19802.

[14]Li Y,Zhang J F,Zhang Y M,et al.The protective effect of genistein postconditioning on hypoxia/reoxygenation-induced injury in human gastric epithelial cells[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(5)：576-581.

[15]徐艷山,趙偉春,王丹依,等.腹水草對人胃上皮細胞GES-1的保護作用及其對PKA、CREB、AQP1的調控研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2016,40(3)：173-178.XU Yanshan,ZHAO Weichun,WANG Danyi,et al.Protective effect of Veronicastrum axillare on human gastric epithelial cells(GES-1)and its modulation on the PKA,CREB and AQP1[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2016,40(3)：173-178.

[16]婁勤進,徐艷山,趙偉春,等.水液代謝在胃黏膜損傷中的調控及腹水草的干預作用研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2016,40(1)：13-18.LOU Qinjin,XU Yanshan,ZHAO Weichun,et al.Study on the regulation roles of water metabolism in gastric mucosa injury induced by ethanoland the effectof Veronicastrum axillare[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2016,40(1)：13-18.

[17]Zhao W C,Xu Y S,Chen G,et al.Veronicastrum axillare alleviates ethanol-induced injury on gastric epithelial cells via downregulation of the NF-κB signaling pathway[J].Gastroenterol Res Pract,2017,2017：7395032.

[18]沈貴芳,郭偉,趙偉春,等.腹水草抗大鼠乙醇型胃潰瘍的作用及機制研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2012,32(10)：1370-1373.SHEN Guifang,GUO Wei,ZHAO Weichun,et al.Antiulcer effects and mechanism study of Veronicastrum axillare on ethanol induced gastric ulcer rats[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2012,32(10)：1370-1373.

[19]杜勇,趙偉春,沈文文,等.腹水草抗大鼠乙醇型胃潰瘍的作用及其對NO、iNOS和VEGF表達的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2013,37(10)：1151-1155.DU Yong,ZHAO Weichun,SHEN Wenwen,et al.Antiulcer effects of Veronicastrum axillare on gastric ulcer in rats induced by ethanol and the effect on the expressions of NO,iNOS and VEGF[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2013,37(10)：1151-1155.

[20]劉蔚.加味小柴胡湯抗胃潰瘍的藥效物質基礎研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學,2017：37-40,51-56.LIU Wei.Research on material base of modified Xiao Chaihu decoction against gastric ulcer[D].Wuhan：Hubei University of Chinese Medicine,2017：37-40,51-56.

[21]單海麗.抗胃潰瘍復方中藥姜百片的研究[D].杭州：浙江大學,2010：65-66.SHAN Haili.Studies on the Jiangbai tablet a traditional Chinese compound medicine in anti-peptic[D].Hangzhou：Zhejiang University,2010：65-66.

[22]楊帆,劉浩,時昭紅.微米大黃炭白芨膠對模型大鼠急性胃粘膜病變修復研究[J].湖北中醫(yī)雜志,2014,36(2)：21-22.YANG Fan,LIU Hao,SHI Zhaohong.Remediation of model acute gastric mucosal lesion by micron rhubarb charcoal plus Bletilla striata gelatin[J].Hubei Journal of Traditional Chinese Medicine,2014,36(2)：21-22.

[23]覃春榮.中西醫(yī)結合治療消化性潰瘍新進展[J].內蒙古中醫(yī)藥,2009,28(18)：85-86.QIN Chunrong.New progress of combined Chinese and western medicine treatmentofthe peptic ulcer[J].Nei Mongol Journal of Traditional Chinese Medicine,2009,28(18)：85-86.

[24]姜正華,李勁平.中藥治療胃潰瘍研究進展[J].亞太傳統醫(yī)藥,2017,13(12)：50-53.JIANG Zhenghua,LI Jingping.Research progress on the traditional Chinese medicine in the treatment of gastric ulcer[J].Asia-Pacific Traditional Medicine,2017,13(12)：50-53.

[25]李洪亮,許仙赟,范小娜.六月雪水提取物對乙醇損傷的人胃黏膜上皮細胞的保護作用[J].湖北農業(yè)科學,2016,55(8)：2035-2038.LI Hongliang,XU Xianyun,FAN Xiaona.Study on the protection of serissa japonica water extract on ethanol injured human gastric epithelialGES-1 cellline[J].Hubei Agricultural Sciences,2016,55(8)：2035-2038.

[26]Eto S,Yoshikawa K,Nishi M,et al.Programmed cell death protein 1 expression is an independent prognostic factor in gastric cancer after curative resection[J].Gastric Cancer,2016,19(2)：466-471.

[27]劉翠玲.黃芪苷類對乙醇誘導GES-1細胞株損傷的保護及機制研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學,2014：37-44.LIU Cuiling.The mechanism research of Astragalus glycosides's protecting effect on ethanol-induced GES-1 cells injury[D].Guangzhou：Guangzhou University of Chinese Medicine,2014：37-44.