效應(yīng)子及其與小麥條銹菌致病性的關(guān)系

劉秀峰 袁文婭 孫振宇 梁丹 時曉偉

（1. 天津市農(nóng)作物研究所，天津 300381；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，蘭州 730070）

植物與病原菌共同進化過程中發(fā)展出不同層次的免疫防衛(wèi)體系。首先，植物細(xì)胞的模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs）識別病原菌相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。PAMPs是病原微生物表面共有的一些高度保守的分子，這些分子不是病原菌特有的，而是廣泛存在于微生物中，對維持微生物的基本生物學(xué)特征十分重要。真菌PAMPs包括麥角甾醇、多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶、木聚糖酶以及細(xì)胞壁衍生物葡聚糖和幾丁質(zhì)等。PRRs可以識別一種或多種PAMPs并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PAMPs觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI），如產(chǎn)生活性氧、分泌蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶及葡聚糖酶等。病原菌為抑制寄主植物的PTI防衛(wèi)反應(yīng)，分泌多種效應(yīng)子（Effectors）調(diào)節(jié)和操縱寄主的各種細(xì)胞功能，逃避寄主的識別以實現(xiàn)對寄主植物的侵染。寄主植物進化出免疫受體可以特異性識別這些效應(yīng)子，并引發(fā)寄主植物產(chǎn)生效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effectortriggered immunity，ETI），使寄主植物表現(xiàn)出抗性。在這種情況下，寄主植物的免疫受體被稱為抗性（R）蛋白，被識別的效應(yīng)子充當(dāng)了誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的信號，這樣的效應(yīng)子蛋白曾被稱為無毒基因（Avr）蛋白。病原菌則通過拋棄被識別的效應(yīng)子或者突變出新的效應(yīng)子來避免寄主植物的ETI識別，相應(yīng)的，寄主植物將共進化出新的R蛋白再次觸發(fā)免疫反應(yīng)。如此反復(fù)，植物-病原菌間形成的競爭循環(huán)曾被形容為“Z字形模式”［1-2］，這種競爭性進化也驅(qū)使植物-病原菌互作的基因序列頻繁發(fā)生例如單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）、插入、缺失等變化，使這些基因呈現(xiàn)高度的多態(tài)性［3-4］。從植物病原菌角度觀察，有利于提高病原菌適合度、定殖能力及傳播能力的效應(yīng)子可能是基因組中進化最快的［5］。因此，效應(yīng)子可以作為植物病害防治的重要靶標(biāo)。

分析多種植物病原真菌不同侵染階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，病原真菌分泌效應(yīng)子類型與其寄生方式密切相關(guān)，腐生病原真菌以分泌細(xì)胞外溶解酶類為主，活體寄生病原真菌分泌的溶解酶類表達量較低，而調(diào)節(jié)寄主細(xì)胞各種代謝的預(yù)測效應(yīng)子表達量很高。條形柄銹菌小麥?；停≒uccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）真菌作為活體寄生菌，由其引起的小麥條銹病爆發(fā)性強、發(fā)生范圍廣，在中國曾發(fā)生多次大流行，危害嚴(yán)重［6］。目前中國90%以上的小麥生產(chǎn)品種因Pst小種變異失去抗銹性，2009年分離到的V26新菌系對貴農(nóng)22、含Yr10/24/26/抗銹基因的品種以及數(shù)十個小麥新品種均具有致病性，已引起相關(guān)部門重視［7］。小麥條銹病也是世界性的禾谷類作物重要病害之一，Pst致病性變異頻繁，新致病性小種的出現(xiàn)和發(fā)展是導(dǎo)致小麥品種抗銹性“喪失”，造成小麥條銹病在各洲和洲際間傳播的重要原因［8-9］。小麥品種在不斷更替，能克服其抗性的條銹菌新小種也在不斷的產(chǎn)生和發(fā)展，Derevnina等［10］稱小麥條銹菌為“never sleep”。根據(jù)研究結(jié)果推斷Pst毒性變異迅速與其含有豐富的效應(yīng)子有關(guān)［11］，分析Pst基因組序列也發(fā)現(xiàn)了大量的預(yù)測效應(yīng)子。例如，美國小麥條銹菌分離物PST130含有1 088個預(yù)測效應(yīng)子［12］，重測序4個Pst小種后將預(yù)測效應(yīng)子數(shù)量提高到2 999個［13］，中國小麥條銹菌小種CY32含有2 092個預(yù)測效應(yīng)子［14］。Pst含有預(yù)測效應(yīng)子的數(shù)量即使與小麥稈銹菌P. graminisf. sp.tritici（1 106 個）［15］和小麥葉銹菌P. triticina（1 358 個）［16］比較，數(shù)量也是極高的。顯然，深入研究Pst效應(yīng)子在寄主細(xì)胞中的作用靶標(biāo)及其功能具有重要意義。

目前對細(xì)菌性植物病原菌和卵菌的效應(yīng)子功能研究較為深入［17-19］，活體寄生菌中玉米瘤黑粉菌Ustilago maydis部分預(yù)測效應(yīng)子功能通過基因缺失和功能互補等方法得到確認(rèn)［20］。小麥條銹菌由于缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，效應(yīng)子研究尚處于起始階段［21］，預(yù)測的兩千多個效應(yīng)子僅有少量經(jīng)過試驗證實其生理功能，這些效應(yīng)子可以靶定在寄主各種亞細(xì)胞成分，有的被證實與Pst致病性直接相關(guān)。本文綜述了效應(yīng)子的特征、分類、靶標(biāo)及Pst效應(yīng)子研究的現(xiàn)狀，并對Pst效應(yīng)子研究中值得關(guān)注的問題及未來的研究方向進行了探討。

1 效應(yīng)子及其定義

效應(yīng)子最初是借鑒醫(yī)學(xué)文獻術(shù)語用于研究細(xì)菌性植物病原菌，隨后被用于植物病原真菌的研究［22］。大約在2000年前后，寄主植物-病原微生物互作研究中開始廣泛使用“效應(yīng)子”一詞［23］。相對于帶有傾向性的“無毒基因”、“激發(fā)子”等術(shù)語，效應(yīng)子這一中性術(shù)語不容易產(chǎn)生歧義。某病原菌分泌的分子抑制了寄主的防衛(wèi)反應(yīng)并使寄主植物感病，則該分子被稱為“毒性基因”。當(dāng)寄主植物進化出受體可以特異性識別該病原菌的同一分子從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)，則該分子被視為“無毒基因”。這種病原菌致病性的變化是非常普遍的現(xiàn)象，病原菌的某個分子可能既是某一寄主的“毒性基因”又是另一寄主的“無毒基因”，甚至在同一寄主的不同品種間表現(xiàn)出不同致病型?？梢?，病原菌的某一分子是“無毒基因”或“毒性基因”主要與寄主植物對病原菌表現(xiàn)為抗病或感病有關(guān)，受寄主基因型影響，因此“無毒基因”等術(shù)語有其局限性［5］。

效應(yīng)子的范疇隨著對致病性的分子機制逐漸深入理解而持續(xù)拓展。起初植物細(xì)菌學(xué)家把效應(yīng)子等同于原核細(xì)菌性病原通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）直接注入到植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。隨后發(fā)現(xiàn)病原菌可通過不同機制將多種特定分子轉(zhuǎn)運到寄主細(xì)胞，效應(yīng)子涵蓋范圍再一次被拓寬。目前，效應(yīng)子廣義上包括諸如蛋白質(zhì)、糖類、次級代謝產(chǎn)物等可能參與侵染過程的所有分子［24］。植物病理學(xué)家傾向于把效應(yīng)子定義為“與植物相關(guān)的微生物分泌的可以改變寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分子”［23］。這一定義在效應(yīng)子功能僅有少量信息可知時尤其符合實際。例如，已知病原菌某分子可以激發(fā)寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，則該分子可以被稱作“效應(yīng)子”，一旦了解更多該分子的功能，往往用描述其專化活性的術(shù)語（例如，蛋白酶抑制劑）替代“效應(yīng)子”［5］。

2 植物病原真菌效應(yīng)子的特征及分類

植物病原真菌效應(yīng)子與病原細(xì)菌和卵菌的效應(yīng)子不同，其效應(yīng)子沒有類似RXLR的保守基序，難以在全基因組序列中直接分辨效應(yīng)子基因。因此人們利用已知效應(yīng)子特征制定出一些指標(biāo)對可能含效應(yīng)子的基因進行分類。研究發(fā)現(xiàn)植物病原真菌分泌效應(yīng)子后，需要將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運到準(zhǔn)確的寄主亞細(xì)胞組分才能發(fā)揮其功能，一個主要特征是效應(yīng)子N末端含有約15-30個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽，可以將效應(yīng)子引導(dǎo)轉(zhuǎn)運到目的靶標(biāo)。因此人們將是否具有信號肽作為預(yù)測效應(yīng)子的一個指標(biāo)［25］。Saunders等［26］綜合已知效應(yīng)子特征后提煉出一些指標(biāo)并據(jù)此預(yù)測效應(yīng)子，這些指標(biāo)包括：具有信號肽、由可以原位誘導(dǎo)表達的基因編碼、與吸器蛋白具有相似性、不高于300個氨基酸、富含半胱氨酸、無跨膜區(qū)域、具有已知的效應(yīng)子基序或細(xì)胞核定位信號、由較長的基因間區(qū)域編碼、具有內(nèi)部重復(fù)序列、與已知蛋白功能無同源性等。Saunders等和Nemri等［27］利用該方法均取得良好效果。另外，在一些如吸器等?；那秩窘Y(jié)構(gòu)中高表達的基因也被作為候選效應(yīng)子之列［15］。利用這些特征可以在基因組中尋找預(yù)測效應(yīng)子，減少需要進行功能驗證的預(yù)測效應(yīng)子數(shù)量，但以上指標(biāo)應(yīng)用于效應(yīng)子分析時仍需要注意其相對有效性。例如，亞麻銹菌（Melampsora lini）的AvrM效應(yīng)子分子量遠(yuǎn)超過300個氨基酸殘基［28］，油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）的AvrLm1僅含有一個半胱氨酸［29］，說明并非所有的效應(yīng)子蛋白都是小分子量和富含半胱氨酸的蛋白，僅僅按照這兩個指標(biāo)可能會漏掉真正的效應(yīng)子。同理，小分子量的富含半胱氨酸的蛋白也不一定全部具有效應(yīng)子的功能［4］。

根據(jù)效應(yīng)子靶定的寄主亞細(xì)胞組分和發(fā)揮作用的位置可以將其分為非原質(zhì)體效應(yīng)子（Apoplastic effectors）和原質(zhì)體效應(yīng)子（Cytoplasmic effectors）［30］。非原質(zhì)體效應(yīng)子作用于寄主植物細(xì)胞外空間，主要干擾寄主植物的蛋白酶、過氧化物酶及細(xì)胞溶解酶類［31］，它們在保護病原菌細(xì)胞壁、鰲合或者中和寄主植物分泌的抗菌化合物等方面具有重要作用。原質(zhì)體效應(yīng)子可以經(jīng)病原菌分泌后穿過寄主原生質(zhì)到達亞細(xì)胞組分靶標(biāo)，可以從上游關(guān)閉寄主的免疫反應(yīng)或者重新編輯寄主的轉(zhuǎn)錄過程從而有利于病原菌侵染［32］。

目前人們對小麥條銹菌效應(yīng)子的特征知之甚少，僅知道和病原真菌其它效應(yīng)子一樣沒有RXLR保守基序。最近Godfrey等［33］在包括小麥稈銹菌在內(nèi)的禾谷類專性寄生菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了［YFW］xC基序，其生理功能還有待于進一步研究。將來研究Pst效應(yīng)子應(yīng)該統(tǒng)一規(guī)范效應(yīng)子的發(fā)掘程序和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)，注重Pst基因組的準(zhǔn)確注釋，在軟件分析基礎(chǔ)上注重專家的手工篩選，為研究分析Pst效應(yīng)子奠定堅實的基礎(chǔ)。

3 植物病原真菌效應(yīng)子的靶標(biāo)及功能

植物病原真菌分泌合適的效應(yīng)子只是成功侵染的第一步，將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運到準(zhǔn)確的靶標(biāo)才能發(fā)揮其功能。植物病原真菌效應(yīng)子靶定的寄主亞細(xì)胞組分和方式非常多樣，可以多個效應(yīng)子靶定同一個細(xì)胞器，也可能一個效應(yīng)子靶定多個亞細(xì)胞組分。植物病原真菌效應(yīng)子的功能極其復(fù)雜，至今人們對其功能了解仍不全面。它們對病原真菌產(chǎn)生有利或負(fù)面的影響取決于寄主植物的基因型。通常效應(yīng)子有利于病原菌發(fā)育，另一方面，許多已知效應(yīng)子可以被寄主R基因識別導(dǎo)致過敏性反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）從而抑制病原菌發(fā)育?？偨Y(jié)植物病原真菌效應(yīng)子與寄主互作中的功能可以歸納為以下幾個方面［34］：（1）抑制寄主的細(xì)胞溶解酶類活性。寄主植物分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等細(xì)胞溶解酶類進入非原質(zhì)體以抵御病原菌侵染。目前雖然未發(fā)現(xiàn)直接作用于幾丁質(zhì)酶的效應(yīng)子，但已在多種病原真菌中鑒定出抑制非原質(zhì)體蛋白酶的效應(yīng)子。如玉蜀黍黑粉菌（Uromyces maydis）的Pit2抑制半胱氨酸蛋白酶活性并與致病性相關(guān)［35］。蠶豆銹菌U. fabae分泌的RTP1與13種銹菌的半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有同源性［36］；（2）作用于寄主免疫反應(yīng)路徑。如玉蜀黍黑粉菌分泌的See1干擾玉米的SGT1活性，調(diào)節(jié)寄主的免疫反應(yīng)［37］；（3）抑制寄主的過氧化物酶類活性。如玉蜀黍黑粉菌的Pep1抑制寄主的過氧化物酶活性，清除活性氧積累，從而保護菌絲。Pep1突變體強烈誘導(dǎo)H2O2在侵染點的細(xì)胞壁處積累，引起寄主細(xì)胞死亡，從而限制菌絲擴展［38-39］；（4）干擾寄主代謝。玉蜀黍黑粉菌分泌的Cmu1催化寄主的莽草酸途徑中分支酸變換為預(yù)苯酸，從而干擾水楊酸的合成［40］。此外，還有結(jié)合幾丁質(zhì)的效應(yīng)子，這在稻瘟菌等半活體寄生菌中研究較為深入。在小麥稈銹菌、蠶豆銹菌等專性寄生菌的細(xì)胞壁表面是幾丁質(zhì)聚糖，而不是幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)在脫乙酰酶作用下轉(zhuǎn)化成幾丁質(zhì)聚糖，幾丁質(zhì)聚糖顯然不是幾丁質(zhì)酶的最佳底物。植物病原菌通過這種轉(zhuǎn)換阻止菌體細(xì)胞壁釋放幾丁質(zhì)低聚物以逃避寄主受體的識別，從而干擾寄主的防衛(wèi)反應(yīng)［41］。

4 小麥條銹菌效應(yīng)子功能研究進展

基因組和比較基因組方法使效應(yīng)子篩選更加方便，目前研究重點已由效應(yīng)子篩選向效應(yīng)子功能驗證轉(zhuǎn)變。由于銹菌目中的病原菌缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其效應(yīng)子功能的研究進展緩慢。例如，已經(jīng)篩選出亞麻銹菌的AvrM、AvrL567、AvrP4和AvrP123［42］、蠶豆銹菌的 RTP1［43］、小麥稈銹菌的PGTAUSPE10-1［44］等預(yù)測效應(yīng)子，限于方法這些效應(yīng)子在寄主細(xì)胞中的功能均未被驗證。

采用本氏煙（Nicotiana benthamiana）異種表達候選效應(yīng)子雖然不能揭示效應(yīng)子轉(zhuǎn)運的全過程，但可為研究銹菌-寄主互作提供有價值的信息。Ramachandran等［45］應(yīng)用此法對20個取自小麥銹菌（9個來自小麥條銹菌，11個來自小麥稈銹菌）的預(yù)測效應(yīng)子功能進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中9個預(yù)測效應(yīng)子（shr1-shr9）可以抑制本氏煙的HR反應(yīng)，并且對不同挑戰(zhàn)接種菌引發(fā)HR的抑制作用不同，即一部分效應(yīng)子可以抑制部分挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，但不能抑制另外挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，推測這些效應(yīng)子用不同的機制干擾本氏煙的細(xì)胞死亡。另外還發(fā)現(xiàn)，一些效應(yīng)子可以抑制相同的挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，這種相似性可能與銹菌效應(yīng)子功能冗余有關(guān)［45］。在本氏煙中異種表達研究候選效應(yīng)子與葉細(xì)胞中靶蛋白之間的互作，其優(yōu)點是得到的靶蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與餌蛋白天然結(jié)合的，相互作用的蛋白質(zhì)都是處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用也是在自然狀態(tài)下進行的，避免了人為的影響，試驗得到的效應(yīng)子可能是真實的定位于細(xì)胞質(zhì)的效應(yīng)子，可信度高。使用本氏煙異種表達研究Pst效應(yīng)子的缺點一方面是可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，另一方面是Pst在自然條件下不侵染茄屬植物，這樣可能會漏篩對小麥組分具有?；缘男?yīng)子，造成假陰性。

將Pst候選效應(yīng)子與GFP等熒光蛋白融合在本氏煙中短暫熒光表達可以提高被測效應(yīng)子在葉肉細(xì)胞中定位的靈敏性，這種方法受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。Petre等［46］在Pst吸器的轉(zhuǎn)錄本中選擇了16個與其他蛋白沒有相似性的預(yù)測蛋白，將它們與GFP的融合蛋白在本氏煙葉肉細(xì)胞內(nèi)短暫熒光表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16個中的7個候選效應(yīng)子定位在?；闹参飦喖?xì)胞組分：小胞內(nèi)體（Cytosolic bodies）、內(nèi)膜間隔（Endomembrane compartment）、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核等，有的候選效應(yīng)子（PST18220）可以同時靶定在葉綠體和細(xì)胞核2個細(xì)胞器。同時，還發(fā)現(xiàn)其中一個效應(yīng)子PST02549可以與P小體（Processing Body）發(fā)生互作。P小體是存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的蛋白質(zhì)/RNA復(fù)合體，可以調(diào)節(jié)mRNA分子的脫帽、降解和貯藏，在基因表達過程中起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用。他們進一步利用抗GFP免疫共沉淀/氣質(zhì)聯(lián)用（coIP/MS）技術(shù)確認(rèn)PST02549可以專化的靶定在P小體的EDC4（Enhancer of mRNA Decapping Protein 4）［46］。

大麥條斑花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV）介導(dǎo)的基因沉默（Virus mediated hostinduced gene silencing，VIGS）技術(shù)可以成功用于誘導(dǎo)小麥基因沉默，國內(nèi)外學(xué)者采用VIGS技術(shù)已經(jīng)在Pst候選效應(yīng)子功能研究中取得進展。Liu等［47］將Pst候 選 效 應(yīng) 子 PEC6（Pucciniaeffector candidate 6）與GFP融合表達，熒光分析顯示PEC6可以定位在寄主的細(xì)胞核和胞液。酵母雙雜試驗和雙分子熒光互補試驗（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）顯示PEC6可以與擬南芥和小麥中的腺苷激酶（Adenosine kinases，ADKs）互作。PEC6的N端含有22個氨基酸長度的信號肽，成熟蛋白含66個氨基酸，在24個不同地理來源的Pst分離物中具有保守性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEC6可以抑制熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens誘導(dǎo)的本氏煙活性氧積累和胼胝質(zhì)沉積，表達PEC6的擬南芥更容易被缺失AvrPto和AvrPtoB的丁香假單胞菌突變株P(guān)seudomonas syringaepv. tomato（Pto）DC3000 ΔAvrPto/ΔAvrPtoB侵染。PEC6還可以抑制熒光假單胞菌激發(fā)的小麥PTI反應(yīng)。應(yīng)用VIGS技術(shù)沉默PEC6，接種小麥后12 d，沉默PEC6基因的Pst產(chǎn)生的孢子量比對照株系減少約50%，這些結(jié)果顯示PEC6與小麥條銹菌的致病性相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)沉默小麥ADKs后小麥第4片葉片變短變窄，小麥條銹菌接種后10 d觀察到小麥抗銹性明顯下降，作者推測小麥ADKs與葉片生長和抗條銹性相關(guān)，PEC6可能通過靶定ADKs后影響ADKs的調(diào)節(jié)代謝和甲基化轉(zhuǎn)運等作用促進小麥條銹菌生長。Yin等［48］在小麥條銹菌吸器cDNA文庫中篩選出6個候選效應(yīng)子，Cheng等［49］進一步對其中命名為PSTha5a23的候選效應(yīng)子進行了功能研究。PSTha5a23的N端包含18個氨基酸的分泌信號肽，并根據(jù)酵母細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長與否的遺傳方法確認(rèn)了其具有功能性的分泌信號肽，成熟蛋白含108個氨基酸，與具有酶活性的其他蛋白比較缺乏已知的保守基序。在已發(fā)表基因組序列中未發(fā)現(xiàn)PSTha5a23的同源性基因，在小麥條銹菌基因組中也未發(fā)現(xiàn)其旁系同源基因。比對6個不同來源的Pst（中國的CY32、美國的PST-21、PST-43和PST-130以及英國的PST-08/21和PST-87/7）的PSTha5a23序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們間僅有一個堿基替換造成氨基酸變化，PSTha5a23可能是種內(nèi)多態(tài)性很低的Pst專化的效應(yīng)子。PSTha5a23-GFP融合蛋白在小麥原生質(zhì)體內(nèi)短暫熒光表達顯示，PSTha5a23定位于小麥的細(xì)胞質(zhì)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)PSTha5a23在本氏煙中過表達可以抑制Bax和inF1激發(fā)的細(xì)胞程序化死亡。在小麥中過表達PSTha5a23可以抑制小麥細(xì)胞中胼胝質(zhì)的沉積。利用VIGS技術(shù)沉默PSTha5e23，接種后14 d，產(chǎn)生的孢子量與對照無變化。沉默PSTha5a23不改變小麥條銹菌的毒性表現(xiàn)型，這可能與效應(yīng)子功能冗余有關(guān)，但過表達PSTha5a23明顯提高小麥條銹菌對小麥的毒性。

酵母雙雜交可以在體外大規(guī)模研究預(yù)測效應(yīng)子蛋白-寄主植物蛋白間的互作，與其它技術(shù)結(jié)合不但可以研究候選效應(yīng)子的功能，還能篩選出與候選效應(yīng)子互作的植物蛋白。Wang等［50］據(jù)此最先報道了具有功能的Pst候選效應(yīng)子PNPi（PucciniaNPR1 interactor），并篩選出與PNPi互作的靶標(biāo)——NPR1（Nonexpresser of PR Genes 1）。PNPi是在小麥條銹菌吸器中發(fā)現(xiàn)的，其N端含有22個氨基酸長度的分泌信號肽，預(yù)測成熟蛋白含333個氨基酸。信號肽末端緊鄰一個由24個氨基酸組成的RSLL-DEEP基序，該基序與卵菌效應(yīng)子的保守基序RxLR-dEER相似但并不完全相同，該基序或許與PNPi從吸器外基質(zhì)轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。PNPi不含有跨膜區(qū)域。通常，一個效應(yīng)子被植物識別后，病原菌將修飾或者剔除這個效應(yīng)子以逃避植物的識別，這種進化力量驅(qū)使寄主抗性基因和病原菌效應(yīng)子的進化都非常快速。不同尋常的是，PNPi表現(xiàn)出較高的保守性。6個小麥條銹菌小種（PST-78、PST-21、PST-43、PST-87/7、PST-08/21和PST-130）和2個小麥條銹菌小檗分離物［PSH-54（GenBank accession KT764126），PSH-72（GenBank accession KT764127）］的 PNPi蛋白序列100%一致，8個PNPi編碼區(qū)的核苷酸堿基序列也100%一致。同時發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌PNPi的蛋白序列與小麥稈銹菌（Pgt，XP_003325658）和小麥葉銹菌（Pt，PTTG_03809）的相似性分別達到67.2%和66.8%。甚至小麥條銹菌PNPi的C端區(qū)域與青楊葉銹菌（Melampsora larici）、玉米黑粉菌、立枯絲核菌等分類距離較遠(yuǎn)的病原菌相應(yīng)區(qū)域也具有較高的相似性。作者推測PNPi的高度保守性或許與小麥條銹菌在進化競爭中取得優(yōu)勢有關(guān)，改變PNPi蛋白結(jié)構(gòu)或許影響小麥條銹菌的寄生適合度。酵母雙雜交顯示PNPi通過它C端的DPBB-1區(qū)域直接與小麥NPR1（wNPR1）的NPR1/NIM1類區(qū)域互作，BiFC技術(shù)共表達YFPN-PNPi（23-333）和YFPC-wNPR1確認(rèn)了這種直接互作發(fā)生在本氏煙原生質(zhì)體的核中。效應(yīng)子激發(fā)寄主產(chǎn)生的抗性反應(yīng)除了局部性的HR反應(yīng)，還可以使寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)性獲得抗性（SAR），從而對再次侵染的病原菌產(chǎn)生廣譜的系統(tǒng)抗性。通常寄主植物的SAR反應(yīng)包括產(chǎn)生信號分子、水楊酸積累、PR基因轉(zhuǎn)錄等。植物中NPR1蛋白是植物免疫系統(tǒng)中的古老組分，其序列不論在單子葉還是雙子葉植物中都是保守的，NPR1在SAR的信號傳導(dǎo)中具有重要作用，病原菌侵染后，NPR1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)并與核內(nèi)的TGA2轉(zhuǎn)錄因子互作從而激活多種PR基因表達。酵母三雜交證實PNPi干擾wNPR1與小麥的TGA2轉(zhuǎn)錄因子（wTGA2.2）結(jié)合，從而阻止激活小麥的PR基因表達。進一步將過表達PNPi的轉(zhuǎn)基因大麥接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接種鄰近的區(qū)域多種PR基因表達受到抑制。作者推測PNPi通過干擾小麥wNPR1與wTGA2.2結(jié)合而影響寄主防衛(wèi)反應(yīng)，也可能通過與wNPR4互作影響 wNPR1 的穩(wěn)定性［50］。

5 問題及展望

小麥條銹菌既要盡可能小的傷害侵入點小麥細(xì)胞，又要逃避寄主識別引發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)才能侵染成功，為此Pst進化出復(fù)雜、精巧的系列效應(yīng)子。目前在效應(yīng)子預(yù)測、定位及功能研究方面已經(jīng)發(fā)展出多種技術(shù)，但Pst效應(yīng)子研究還比較緩慢，仍有一些受限制因素。首先，預(yù)測Pst效應(yīng)子的指標(biāo)和基因組注釋錯誤一定程度上阻礙Pst效應(yīng)子發(fā)掘進程。Pst預(yù)測效應(yīng)子數(shù)量高于實際數(shù)量，目前采取的預(yù)測指標(biāo)雖然能極大程度降低待驗證的效應(yīng)子數(shù)量，但研究Pst效應(yīng)子時仍需要不斷對這些指標(biāo)進行完善。將來一方面加強已知效應(yīng)子特征研究、提高Pst基因組注釋程度以完善現(xiàn)有指標(biāo)，另一方面發(fā)展新技術(shù)也非常重要，如效應(yīng)子三維結(jié)構(gòu)相似性對效應(yīng)子辨別可能有極大幫助［51］。其次，Pst效應(yīng)子-GFP融合蛋白在本氏煙細(xì)胞中短暫表達可實現(xiàn)高通量的細(xì)胞定位研究，為研究Pst-小麥互作提供有價值的信息，但仍需要注意該體系的不足，同時發(fā)展遺傳的、生化的和細(xì)胞生物學(xué)的方法用于在Pst侵染過程中標(biāo)記、檢測和觀察效應(yīng)子。未來研究效應(yīng)子定位的理想狀態(tài)是可視化，可以研究效應(yīng)子在侵入的植物細(xì)胞中的動態(tài)定位，以及植物細(xì)胞組分相應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化。

小麥條銹菌若要侵染成功，除了分泌合適的效應(yīng)子外，還要在合適的時間將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運到準(zhǔn)確的小麥亞細(xì)胞組分。Pst在不同的侵染階段需要按照時間順序分泌不同的效應(yīng)子，分泌的效應(yīng)子還需要穿過吸器外基質(zhì)以及多種界面后才能到達亞細(xì)胞組分。目前人們不僅對Pst如何實現(xiàn)這一時間過程一無所知，而且對Pst效應(yīng)子從吸器外基質(zhì)轉(zhuǎn)運到寄主亞細(xì)胞組分的途徑知之甚少。因此Pst效應(yīng)子如何轉(zhuǎn)運進入寄主亞細(xì)胞組分是將來研究的一個重點問題。另一個同樣重要的問題是Pst效應(yīng)子在轉(zhuǎn)運過程中如何逃避寄主的免疫識別。研究發(fā)現(xiàn)，病原真菌和寄主共同進化過程中，病原真菌效應(yīng)子被寄主免疫受體識別后，病原真菌通過多種方式產(chǎn)生變異以逃避、抑制或改變這種識別。這種逃避機制主要包括兩類，一類是被識別效應(yīng)子的基因序列發(fā)生轉(zhuǎn)座插入、突變甚至該效應(yīng)子基因被完全丟棄。已有結(jié)果證實為便于這類逃避寄主識別機制發(fā)揮作用，病原真菌基因組在進化過程中把效應(yīng)子經(jīng)常安排在序列重復(fù)區(qū)域［52］、富含轉(zhuǎn)座子區(qū)域［53］或非必需區(qū)域［54］。另一類則不丟棄或不改變被識別效應(yīng)子基因序列，而是使該效應(yīng)子的調(diào)控區(qū)域發(fā)生突變或調(diào)節(jié)病原菌基因組中影響該效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，這樣被識別效應(yīng)子編碼區(qū)域DNA序列不變，但效應(yīng)子的表達發(fā)生了改變［55］。這類逃避機制的特點是可以在基因組中保留被識別效應(yīng)子基因本身，該效應(yīng)子基因可被重復(fù)使用。目前在大雄疫霉大豆專化型Phytophthora sojae中發(fā)現(xiàn)這類逃避機制［56］，但在小麥條銹菌中尚未有類似報道。因為小麥條銹菌是雙核病原菌，存在兩個或多個有功能的效應(yīng)子拷貝，如效應(yīng)子調(diào)控區(qū)某雙顯性等位基因位點中一個等位基因發(fā)生突變，該位點雖然變?yōu)殡s合位點但并未影響表型，只有兩個等位基因全部突變才會改變表型。顯然，這些效應(yīng)子全部發(fā)生毒性變化比只有單拷貝的病原菌將更加困難。

小麥條銹菌效應(yīng)子研究仍處于起步階段，Pst基因組含有兩千多個預(yù)測效應(yīng)子基因，但絕大多數(shù)功能是未知的。目前的研究技術(shù)仍有不足，還不能滿足規(guī)?；?、系統(tǒng)化的研究需要。因此，創(chuàng)建新的研究方法和技術(shù)，建立高通量研究體系，規(guī)?；b定Pst效應(yīng)子功能，對其分泌、轉(zhuǎn)運分子機制進行詳細(xì)研究將有助于了解Pst致病機制，也有助于制定新的抗病策略。

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