Cell-SELEX技術(shù)為基礎(chǔ)的靶向藥物遞送系統(tǒng)研究進展

寧宇綜述；李章華，鄒季審校

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；

2.武漢大學(xué) 附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院），湖北 武漢 430074

指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolu?tion of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)的發(fā)明以Tuerk和Ellington等在體外獲得了能與蛋白質(zhì)或染料等小分子特異結(jié)合的RNA片段為標(biāo)志[1-2]。通過SELEX方式獲得的這一類特異性的核苷酸配基被稱為適配體（aptamer）。適配體的本質(zhì)是一段能形成三維空間結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸配基，即RNA或DNA。由于單鏈RNA的結(jié)構(gòu)在空間上的多變性，可以形成諸如莖環(huán)、發(fā)夾、口袋等結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其在理論上能與各種靶物質(zhì)結(jié)合。因此在此技術(shù)的發(fā)展過程中，由最初的核酸結(jié)合蛋白等發(fā)展到包括活細胞、核酸、多肽類、病毒甚至金屬離子等[3-4]。與抗體相比，適配體的特異性更高，同時其能夠耐受相應(yīng)的溫度、pH值變化，穩(wěn)定性較高。并且適配體可以完全通過體外獲得，能夠根據(jù)實際需要進行修飾與組裝，成本時長較抗體而言大為降低。因此，SELEX技術(shù)在靶向藥物、生物基礎(chǔ)研究、醫(yī)療臨床方面得到廣泛應(yīng)用。2004年，美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)適配體培加他尼（pegatanib，商品名Macugen）用于治療濕性老年黃斑變性（AMD），標(biāo)志著SELEX在臨床治療中得到正式應(yīng)用[5]。

1 Cell-SELEX技術(shù)

腫瘤等疾病的治療在很大程度上取決于患病部位的藥物濃度，而適配體與目的細胞的特異性結(jié)合，給腫瘤等疾病的治療提供了新的方向。其總體思路是將各種目的細胞的適配子與相應(yīng)的藥物和材料結(jié)合，使藥物和材料通過與適配子在相應(yīng)部位聚集，進入或者與相應(yīng)細胞連接，從而達到治療疾病的目的。目前已有多種物質(zhì)通過這種藥物遞送系統(tǒng)進入細胞。適配體在靶向藥物材料方面應(yīng)用，主要通過篩選活的目的細胞而實現(xiàn)。

1.1 Cell-SELEX技術(shù)的特點

活細胞的適配子篩選方式被稱為Cell-SELEX技術(shù)，即以活的目的細胞為靶物質(zhì)，獲取能與特定目的細胞相結(jié)合的適配體的技術(shù)。在傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)中，須首先明確并純化靶細胞上的膜蛋白，然后通過與膜蛋白的結(jié)合來篩選相應(yīng)的適配體。但由于膜蛋白在體外擴增重組無法形成生理狀態(tài)下正常的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致體外無法獲得大量高純度的膜蛋白，同時篩選出的適配體的特異性也并不理想，因而限制了這一技術(shù)的發(fā)展[6]。而Cell-SELEX技術(shù)無須預(yù)先對細胞膜蛋白進行研究，也無須明確適配體與細胞上具體膜蛋白的種類和位點。由于適配子自身的特異性，可通過洗滌和離心提取結(jié)合物，從而無須固定和提純所需蛋白，解決了靶蛋白純化的難題[7]。

同時，Cell-SELEX技術(shù)不僅能特異結(jié)合相應(yīng)靶細胞，也能分辨細胞表面生物標(biāo)記物，從而將同源細胞進行分離。Berezovski等[8]運用核酸適配體促進的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)技術(shù)（AptaBiD）區(qū)別成熟與未成熟的樹突狀細胞上的生物標(biāo)記物，不僅獲得了合成親和力的適配體探針，并且發(fā)現(xiàn)了其生物標(biāo)記物，獲得的適配體能夠同時用于細胞分離、可視化及細胞的體內(nèi)追蹤。Jiang等[9]利用適配體證實了膜蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）作為診斷白血病的生物標(biāo)志物的可行性。Ara等[10]構(gòu)建了小鼠原代腫瘤內(nèi)皮細胞（mTECs）的適配體AraHH001，通過AptaBiD技術(shù)，將適配體與mTECs結(jié)合后進行提純分離，發(fā)現(xiàn)AraHH001能結(jié)合mTECs上的肌鈣蛋白T，從而獲得了mTECs的新生物標(biāo)記物肌鈣蛋白T，從而為限制腫瘤血管生長提供了新的診斷治療工具。

1.2 Cell-SELEX技術(shù)的篩選方法

Cell-SELEX技術(shù)的篩選方式與傳統(tǒng)的蛋白類核酸適配體篩選方式相似。①首先合成一個隨機的寡核苷酸ssDNA文庫，中間包括25～30個隨機排列的堿基，隨機區(qū)域的長度由合成效率和制備的難易度所決定；②將目的細胞與合成的隨機ssDNA文庫共同孵育；③洗滌未結(jié)合的文庫并通過離心等方式洗脫，獲得親和力強的ssDNA；④將目的細胞的同源細胞與篩選出的ssDNA文庫孵育，消減能夠共同識別2種同源細胞的適配體；⑤去除親和力低的ssDNA文庫，獲取的親和力較高的文庫通過PCR等技術(shù)擴增，形成下一輪擴增的次級文庫，重復(fù)上述步驟。經(jīng)過10～15輪的篩選過程，直到獲取的文庫親和力不再明顯增強。然后選取這些特異性高的文庫進行鑒定和擴增，即獲得所需目的細胞的適配體。

一些條件對篩選結(jié)果有較大影響。如目的細胞的狀態(tài)，在與寡核苷酸文庫的孵育中，細胞的過度生長和死細胞都會影響篩選的成功率，并且貼壁細胞應(yīng)用胰蛋白酶或非蛋白酶消化試劑后，都會影響其表面形態(tài)表達[11]。Souza等[12]利用磁懸浮技術(shù)（magnetic levitation method，MLM）對細胞進行懸浮培養(yǎng)，產(chǎn)生的球形懸浮細胞比傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)的前列腺腫瘤細胞表面蛋白更能夠均勻地與適配體接觸，從而獲得納摩爾級別解離常數(shù)親和力的適配體。

寡核苷酸ssDNA文庫對于適配體的篩選也同樣重要。自上世紀(jì)90年代初Switzer等發(fā)現(xiàn)了DNA或RNA中增加非自然堿基的可能性之后。Kimoto 等[13]將一個第五堿基 7-（2-thienyl）imidazo［4，5-b］ pyridine（Ds）加入隨機文庫，構(gòu)建人血管內(nèi)皮細胞因子（VEDF-165）和干擾素（IFN-γ）的DNA適配子，結(jié)果表明其特異性較自然堿基文庫的適配子提高100倍。Zhang等[14]構(gòu)建了2個嚴(yán)格按照Watson-Crick幾何形態(tài)配對的新核苷酸來構(gòu)建能特異性結(jié)合肝癌細胞的適配體的隨機文庫，這個基于所謂的GACTAP文庫所篩選出的具有Z和P堿基的6核酸DNA適配體的親和力較自然堿基組成的適配體更高。提示具有非自然堿基的核苷酸文庫有著更好的生物功能性。

除體外孵育之外，有學(xué)者通過將文庫注射入動物體內(nèi)，直接在體內(nèi)將文庫與靶細胞孵育，取出目的組織細胞后洗脫擴增獲得次級文庫，從而獲得生理狀態(tài)下的特異細胞適配體，避免了體外篩選孵育可能出現(xiàn)的潛在問題[15]。

2 結(jié)合適配體的靶向藥物遞送系統(tǒng)

由于適配體能夠與靶細胞特異結(jié)合，通過對適配體的修飾和連接，能夠應(yīng)用于諸如藥物遞送、疾病診斷、生物成像、分子探針等領(lǐng)域。對很多疾病來說，藥物分子在目標(biāo)部位的富集和藥物毒副作用的降低，是藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展方向。適配體作為分子靶向藥物遞送系統(tǒng)的新工具，具有半衰期短、分子小、成本較低、性質(zhì)穩(wěn)定等特點。通過Cell-SELEX技術(shù)篩選出來的各種細胞特異的適配體通過各種方式與不同的藥物或材料連接后，能夠特異遞送藥物分子到相應(yīng)靶細胞，從而達到診斷治療疾病的目的。

2.1 適配體的藥物樣作用

某些適配體能與細胞表面的特異蛋白結(jié)合，從而影響細胞的信號傳遞。依據(jù)這一原理，適配體能夠直接作用于靶細胞，抑制靶細胞的生長，本質(zhì)上具有藥物的作用。Ohuchi等[16]運用TECSSELEX技術(shù)篩選出一個RNA適配體，能夠與CHO細胞膜表面的TGF-βⅢ受體結(jié)合，抑制CHO的生長。培加他尼作為第一種進入臨床試驗的適配體藥物，其原理即是能特異結(jié)合黃斑變性細胞表面的主要表型VEDF-165，抑制其與受體Flt-1和KDR的結(jié)合，從而減少病變組織內(nèi)的血管形成，延緩病變的發(fā)展。

2.2 適配體與藥物連接

適配體與藥物的直接連接一般通過共價鍵或非共價鍵（即將藥物分子嵌入適配體內(nèi)）實現(xiàn)。藥物與適配體的共價鍵一般較為牢固，通常是將適配體末端修飾的氨基與藥物經(jīng)過化學(xué)修飾產(chǎn)生的羥基、羧基等結(jié)合，形成共價鍵，達到連接的目的。Huang等[17]將腫瘤藥物阿霉素（doxoru?bicin，Dox）與人急性T細胞型淋巴母細胞白血病細胞的表面酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）的DNA適配體sgc8c通過共價鍵連接。由于sgc8c與目標(biāo)蛋白PTK7結(jié)合后可以內(nèi)化進入細胞，通過共聚焦顯微鏡觀察，2 h后Dox在細胞內(nèi)均勻分布，表明細胞內(nèi)涵體的酸性環(huán)境能夠切割復(fù)合物的共價連接，使Dox進入細胞核內(nèi)并發(fā)揮作用。其缺點在于適配體與藥物的低結(jié)合比率。

由于蒽環(huán)的存在，Dox能夠通過非共價鍵直接嵌入DNA鏈。Meng等[18]利用Dox的這一特性，將LH86細胞（人肝癌細胞）特異性DNA適配體TLS11a與Dox結(jié)合，通過修飾適配體TLS11a，將一個GC尾加到TLS11a的5′端，形成TLS11a-GC，從而形成一種二聚體結(jié)構(gòu)。最終形成的TLS11a-GC適配體與Dox結(jié)合后的理論比例達到1∶28，其實際比例維持在1∶25的高水平。同時還構(gòu)建了諸如自組裝雙特異性適配體藥物遞送系統(tǒng)sgc8csgd5a（SD），在混合細胞系中對不同亞型的腫瘤細胞均可特異識別。通過這種連接方式，適配體不僅能夠作為靶向結(jié)構(gòu)，同時也能成為運載結(jié)構(gòu)，表明這種結(jié)構(gòu)在藥物遞送中載藥量方面具有巨大優(yōu)勢[19]。

2.3 適配體與納米材料連接

適配體與不同的納米材料結(jié)合，在發(fā)揮適配體靶向結(jié)合作用的基礎(chǔ)上，利用納米材料能夠裝載大量藥物分子、產(chǎn)生活性氧，或者某些納米材料能夠同時結(jié)合不同極性藥物的特性從而實現(xiàn)不同的目的。

金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）具有很多優(yōu)良性能[20]，如：①AuNPs性質(zhì)穩(wěn)定、無毒，同時具有良好的生物相容性；②AuNPs的粒子大小可進行隨意控制（1～150 nm），匹配所連接的生物分子；③納米粒子具有高表面面積體積比，能夠提供大量生物分子結(jié)合位點。這些優(yōu)點決定了AuNPs成為藥物遞送系統(tǒng)中的理想材料。Shiao等[21]通過組裝13 nm的AuNPs，將其與具有21個堿基對的適配體AS1411連接，同時將光敏劑TMPyP4及化療藥物阿霉素Dox通過物理方式連接到納米金適配體復(fù)合物上。通過適配體的靶向性，將這個復(fù)合物遞送到靶細胞HeLa或耐阿霉素MCF-7R細胞中，經(jīng)過632 nm的光照后，TMP?yP4誘導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）毒性和釋放的Dox同時對細胞產(chǎn)生損傷。這種復(fù)合給藥方式被證明比單獨給藥更為優(yōu)異。

氧化鋅納米粒子（ZnO NPs）作為一種新興的納米材料，在經(jīng)過表面修飾后能釋放抗腫瘤藥物，同時由于腫瘤細胞的酸性環(huán)境，ZnO不僅能夠分解產(chǎn)生ROS殺傷腫瘤細胞，并且二價鋅Zn2+也能夠?qū)δ[瘤產(chǎn)生治療作用。將乳腺癌細胞表面蛋白MUC1的適配體S2.2與ZnO NPs結(jié)合，將Dox嵌入適配體組成復(fù)合物，適配體功能化的ZnO NPs能夠特異結(jié)合靶細胞，在紫外線照射下，細胞存活率由64%下降到42%，從而使靶向光催化療法和化療方法的治療效果疊加[22]。

此外還有一種金屬納米材料，即超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamagneticironoxide nanoparticles，SPION）。SPION材料是由二價和三價鐵鹽經(jīng)由化學(xué)共沉淀法在基質(zhì)的存在下合成的。Farini等[23]通過Cell-SELEX技術(shù)篩選出能夠與熱處理后損傷的牛精子結(jié)合的適配體，利用抗生物素包被的SPION與適配體和靶細胞結(jié)合，形成新的復(fù)合物，獲得功能正常精子的懸浮液。這種方式可達到剔除損傷精子同時又不損傷正常精子的囊胚卵裂率的目的，顯示了與適配體結(jié)合應(yīng)用方式的新思路。

碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）是一種具有很多獨特物理和化學(xué)特性的納米材料，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其中的單壁碳納米管（sin?gle-walled carbon nanotubes，SWNTs）表現(xiàn)出獨特的電光學(xué)特征，如光熱、拉曼效應(yīng)等。得益于其特殊的sp2雜化碳表面，在理論上能達到1300 m2/g的表面積，從而能夠為藥物或生物分子等提供大量結(jié)合位點，通過細胞的內(nèi)吞和擴散作用，能自由進出細胞并對細胞無害，成為藥物運載的理想材料[24]。將柔紅霉素（daunorubicin，Dau）與針對白血病的生物標(biāo)志蛋白PTK7的DNA適配體sgc8c結(jié)合后與單壁碳納米管連接來增強柔紅霉素與Molt-4細胞的靶向遞送作用，在細胞內(nèi)pH5.5的酸性環(huán)境下具有較高的藥物釋放率[25]。Tan等[26]構(gòu)建了一個單壁碳納米管輔助的Cell-SELEX篩選系統(tǒng)，在篩選洗脫非結(jié)合ssDNA的過程中，利用ssDNA能夠通過π電子堆疊作用螺旋纏繞到單壁碳納米管上，但較適配體與靶細胞親和力低的特性，篩選中分離未與靶細胞結(jié)合的ss?DNA，達到比傳統(tǒng)洗脫更高的純度，從而將傳統(tǒng)15輪的篩選過程下降到僅需6輪的水平。

介孔二氧化硅顆粒（mesoporoussilica nanoparticles，MSNs）于 1992年被首次合成，因其具有較大的表面積、可調(diào)的孔徑和便于修改的特性，在藥物控釋領(lǐng)域廣受關(guān)注。可以對MSNs表面進行修飾，合成通過pH值和光照雙重調(diào)控的藥物遞送系統(tǒng)[27]。Zhang等[28]構(gòu)建了一個基于介孔二氧化硅包覆的光熱劑Cu1.8S顆粒的近紅外光反應(yīng)的DNA混合門控納米載體。將介孔二氧化硅作為藥物載體，而具有豐富GC堿基的DNA適配體作為門控和藥物載體及靶向元件。其中MSNs裝載疏水性的姜黃素，適配體裝載親水性的阿霉素Dox。通過適配體介導(dǎo)的復(fù)合物能夠在近紅外光輻射合理的釋放阿霉素和姜黃素，姜黃素增強MCF-7細胞對阿霉素的協(xié)同生長的抑制作用，對MCF-7細胞中的某些凋亡相關(guān)基因產(chǎn)生更大影響。說明這一復(fù)合物在藥物靶向運輸中具有巨大潛力。

2.4 適配體與其他分子材料

脂質(zhì)體是一種由磷脂構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，目前已被廣泛應(yīng)用于藥物遞送。由于脂質(zhì)體表面疏水內(nèi)部親水的特征結(jié)構(gòu)，既可以在其內(nèi)部裝載親水性藥物，也可以在外部脂質(zhì)雙分子膜上裝載疏水性藥物，是一種運載藥物的理想材料。目前已有多種脂質(zhì)體復(fù)合藥物進入臨床試驗，早在1995年，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體Doxil已被FDA批準(zhǔn)用于艾滋病相關(guān)化療難治型卡波西肉瘤[29]。由于其優(yōu)良的載藥性能，增強其靶向性成為研究的重點方向，將其與適配體連接則能夠達成這一目的。Ara等[30]通過聚乙二醇（PEG）修飾的脂質(zhì)體，連接適配體后形成復(fù)合物Apt-PEG-LPs，用熒光分光光度法、激光掃描共聚焦顯微鏡分別檢測小鼠腫瘤內(nèi)皮細胞的吸收能力，表明復(fù)合物從內(nèi)涵體脫離，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用后參與受體介導(dǎo)的通路。將人腎腫瘤細胞注射小鼠后用共聚焦顯微鏡觀測Apt-PEG-LPs，表明該復(fù)合物較單純的PEG-LP復(fù)合物有更高的累積量，且這類復(fù)合物除了傳遞化療藥物外，還能通過脂質(zhì)體包裹并傳遞siRNA而不引起免疫系統(tǒng)的特異性激活[31]。

膠束（micelles）是一類諸如脂肪酸、皂和磷脂等表面活性分子的聚集體，具有一個強極性的頭和非極性烴鏈的尾。在水溶液中，這一類分子非極性的尾部聚集成一個類似球形結(jié)構(gòu)的中心，自主裝成所謂的膠束[32]。膠束在目前被廣泛應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)的研究。雷公藤甲素（triptolide，TP）能夠?qū)δ退幰认侔┘毎脑鲋称鹨种谱饔?，然而對所有組織細胞無特異性的損傷也阻礙了其臨床應(yīng)用。將適配體AS1411連接到PEG的C端并和聚（D，L-丙交酯）連接，組成AS1411-PEGPDLLA膠束，通過固體分散技術(shù)裝載TP后形成AS-PPT，這一復(fù)合物比單純TP有更好的抗腫瘤效果，且其靶向特異性較AS1411并無下降。實驗表明，用AS-PPT治療患吉西他濱抗人胰腺癌細胞（MIA PaCa-2）的小鼠，較使用單純抗腫瘤藥物鹽酸吉西他濱Gemzar的小鼠壽命顯著延長，表明膠束適配體復(fù)合物能夠通過提高靶向性減輕某些藥物的毒副作用[33]。

量子點（quantum dots，QD）是把導(dǎo)帶電子、價帶空穴及激子在3個空間方向上束縛住的納米晶體半導(dǎo)體材料。由于其優(yōu)異的光穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于實時追蹤成像，也為這種材料成為藥物遞送系統(tǒng)打下堅實基礎(chǔ)。目前已將pH反應(yīng)性的量子點和異常糖基化黏蛋白-1（MIC1）適配體通過共價鍵連接，將阿霉素Dox通過pH敏感的腙鍵與量子點連接，形成的復(fù)合物顯著促進藥物在內(nèi)涵體內(nèi)的釋放[34]。Singh等[35]將ZnSe/ZnS量子點與光敏劑PS及MUC1適配體裝配成復(fù)合物，連接到MUC1腫瘤標(biāo)志物，經(jīng)光照后復(fù)合物產(chǎn)生ROS，殺傷腫瘤細胞，達到靶向治療的目的。

除上述材料之外，還有一些藥物遞送系統(tǒng)逐漸被研究開發(fā)。如聚合物納米顆粒PLGA連接適配體同時傳遞阿霉素Dox、紫杉醇PTX兩類不同藥物[36]；用ATP適配體構(gòu)建的樹枝狀大分子內(nèi)嵌入阿霉素Dox后，再經(jīng)表面連接其他腫瘤蛋白特異適配體后靶向進入目的細胞進行藥物釋放[37]；氧化石墨烯等或?qū)⑸鲜瞿硯追N材料組合而成的藥物遞送系統(tǒng)。

3 結(jié)語

SELEX技術(shù)經(jīng)過20多年的研究，已經(jīng)發(fā)展了多種類的篩選方式與篩選靶分子，其篩選的最終目標(biāo)都是特異性高的適配體。而Cell-SELEX技術(shù)的應(yīng)用價值也主要在于獲得與靶細胞特異結(jié)合的適配體。通過獲得的靶細胞特異適配體，我們不僅能夠?qū)δ康募毎M行診斷檢測，而且能夠結(jié)合各種藥物載體對靶細胞進行靶向治療。目前大部分研究集中在化療藥物對腫瘤細胞的靶向治療，但特異細胞適配體的應(yīng)用遠遠不僅限于此。我們也可以通過某些正常體細胞特異適配體遞送藥物及生物分子等，從而起到預(yù)防及治療某些非腫瘤性疾病的作用。相信隨著研究的深入，SELEX技術(shù)及適配體無論在生物醫(yī)藥系統(tǒng)還是在化學(xué)材料工程中都會有更為廣闊的應(yīng)用。

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