微生物介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）和間日瘧原蟲（P.vivax，Pv）是寄生人體的2種常見瘧原蟲，可分別引起惡性瘧和間日瘧。大量研究[1-7]表明，用X線照射的瘧原蟲子孢子或紅內(nèi)期原蟲、熱滅活的紅內(nèi)期原蟲以及去除紅細(xì)胞的裂殖體免疫小鼠均可有效對(duì)抗瘧原蟲子孢子的攻擊。Renia等[8]認(rèn)為瘧原蟲疫苗大體經(jīng)歷了全蟲疫苗、減毒活疫苗和分子疫苗這幾個(gè)階段，但全蟲疫苗幾乎不能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生有效的保護(hù)力，減毒活疫苗存在恢復(fù)毒力和臨床感染的風(fēng)險(xiǎn)，單個(gè)重組蛋白疫苗的免疫效果較差，這就需要進(jìn)一步研制新型疫苗。

Pfs25和Pvs25存在于瘧原蟲的配子、合子和動(dòng)合子的表面，是相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為25 000的受精后抗原，具有4個(gè)串聯(lián)的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域、大量半胱氨酸殘基和復(fù)雜的四聚體結(jié)構(gòu)，在動(dòng)合子穿透蚊胃上皮及動(dòng)合子轉(zhuǎn)為卵囊的過程中起重要作用。呂芳麗等[9]將100 μg的pCDPfs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后10和20 d加強(qiáng)2次，在首次免疫后40 d發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，脾細(xì)胞增殖，CD8+T細(xì)胞數(shù)目增加；Shimp等[10]將Pfs25與銅綠假單胞菌的外蛋白A（exopro?tein A，EPA）融合為Pfs25-EPA，將2.5 μg融合蛋白加鋁佐劑皮下注射CD1鼠，在首次免疫后4周加強(qiáng)1次，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高75倍；Kongkasuriyachai等[11]將 25 μg的 VR1020-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后5和10周加強(qiáng)2次，在首次免疫后100 d發(fā)現(xiàn)血清IgG、IgG1和IgG2a升高，間接免疫熒光（IFA）證實(shí)此血清識(shí)別Pv合子內(nèi)的Pvs25蛋白，這些研究表明Pfs25和Pvs25是2種有希望的疫苗分子。

微生物通常對(duì)人體具有一定的致病性，隨著對(duì)微生物致病機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)編碼微生物的毒力因子或編碼關(guān)鍵代謝途徑的酶基因突變以及控制微生物在體內(nèi)生存的調(diào)節(jié)基因失活，均可使微生物減毒且保留高度的免疫原性。隨后人們構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌、酵母菌、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等微生物的減毒株，這些減毒株均可成為有希望的疫苗載體。在此，我們就微生物介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗的研制現(xiàn)狀做簡(jiǎn)要綜述。

1 細(xì)菌介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗

1.1 重組根癌農(nóng)桿菌

1983年Fraley等[12]首次將細(xì)菌基因?qū)胫参锛?xì)胞，而Curtiss等[13]在煙草種子中成功表達(dá)了變形鏈球菌的表面蛋白抗原，這為研制轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了可行性。Jones等[14]將Pfs25基因插入pGRD4得pGRD-Pfs25，電穿孔轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacieu，At）的 GV3101株，真空浸染煙草的子葉，培育轉(zhuǎn)基因植株；SDS-PAGE證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)Mr為46 000的Pfs25-FhCMB-6His融合蛋白；將 5 μg融合蛋白加 Al（OH）3佐劑肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3周加強(qiáng)1次，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血清IgG滴度為1∶3318～1∶5835，標(biāo)準(zhǔn)膜飼養(yǎng)試驗(yàn)（standard membrane feed?ing assay，SMFA）發(fā)現(xiàn)首次免疫后6周的鼠血清在體外抑制蚊胃卵囊的發(fā)育，抑制率為92%。

Blaborough等[15]將Pvs25基因插入pGRD4得pGRD4-Pvs25，電穿孔轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101株，轉(zhuǎn)染煙草子葉，培育轉(zhuǎn)基因植株；SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)Pvs25-FhCMB融合蛋白；將50 μg融合蛋白加Abisco-100佐劑腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3周加強(qiáng)1次，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，IFA證實(shí)此血清可識(shí)別Pv的合子和動(dòng)合子；合子發(fā)育試驗(yàn)（zygote de?velopment assay，ZDA）發(fā)現(xiàn)此血清抑制蚊胃卵囊的發(fā)育，抑制率為65%～74%；在首次免疫后6周腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株的子孢子進(jìn)行攻擊，在攻擊后6～12 d發(fā)現(xiàn)鼠血瘧原蟲的數(shù)目減少。

1.2 重組酵母菌

酵母菌及其菌體成分是有效的佐劑，與抗原結(jié)合后形成免疫刺激復(fù)合物，促進(jìn)免疫應(yīng)答。Gozar等[16]將Pfs25基因插入pIXY154得pIXY155，轉(zhuǎn)化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2905株，篩選培養(yǎng)陽性菌株；免疫印跡發(fā)現(xiàn)Pf患者血清識(shí)別重組菌表達(dá)Mr為39 000的Pfs25蛋白；將1250 pmol重組蛋白加Al（OH）3佐劑腹腔注射免疫CAF1鼠，在首次免疫后3和6周加強(qiáng)2次，在首次免疫后12周發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞增殖，血清IgG升高，該血清可抑制血涂片中Pf配子體的發(fā)育。Zou等[17]將 25 μg重組蛋白加 Al（OH）3佐劑腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加強(qiáng)3次，在首次免疫后12周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，該血清在體外可抑制血涂片中Pf配子體的發(fā)育。雷青等[18]將Pfs25基因分別插入pPIC9和pGAPZαA得pPIC10和pGAP-10，分別電穿孔轉(zhuǎn)化畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115株，篩選陽性菌株，命名為IC-PfS25和GAP-PfS25；然后再將pIC10電轉(zhuǎn)GAP-PfS25株，篩選培養(yǎng)陽性菌株IC-GAP-PfS25；免疫印跡發(fā)現(xiàn)Pf患者血清識(shí)別血涂片中的Pfs25蛋白，但未進(jìn)行保護(hù)力試驗(yàn)。

2 病毒介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗

2.1 重組腺病毒

Schuldt等[19]認(rèn)為腺病毒血清型 5（Adenovirus serotype 5，Ad5）以及猩猩腺病毒血清型63（Chim?panzee adenovirus serotype 63，ChAd63）是2種有希望的疫苗載體，均可有效表達(dá)瘧原蟲的外源抗原；重組腺病毒可誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞，誘發(fā)長期應(yīng)答，可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)；外源抗原表達(dá)在衣殼蛋白纖維或六環(huán)上可以提高疫苗效率，降低毒副作用。Goodman等[20]將 1×1010病毒顆粒（viral particles，VP）的 ChAd63-Pfs25肌肉注射 BALB/c鼠，在首次免疫后10周肌肉注射1×107PFU的MVA-Pfs25進(jìn)行加強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)血清IgG在首次免疫后2～12周升高，在首次免疫后12周達(dá)較高水平，血清IgG1和IgG2a增加；SMFA試驗(yàn)表明首次免疫后12周血清抑制蚊胃卵囊的發(fā)育；在首次免疫后12周腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株子孢子進(jìn)行攻擊，在攻擊后3 d用斯氏按蚊（Anopheles stephensis）叮咬24 h，叮咬24 h后解剖蚊胃，發(fā)現(xiàn)蚊胃的卵囊數(shù)目減少67%～93%。Miyata等[21]將5.1×109PFU的rAd5-Pvs25皮下或肌肉注射BALB/c鼠,在首次免疫后3、5和7周加強(qiáng)3次，在末次反應(yīng)后2周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，SMFA試驗(yàn)證實(shí)皮下或肌肉注射組的血清顯著降低蚊胃的卵囊數(shù)目，減囊率分別為82.4%～87.8%和82.9%～98.6%。

2.2 重組牛痘病毒

Sutter等[22]發(fā)現(xiàn)牛痘病毒的減毒株可表達(dá)流感病毒的核殼蛋白、麻疹病毒的融合蛋白F以及呼吸道合胞病毒的糖蛋白等。Tine等[23]以Pf基因組DNA為模板擴(kuò)增Pfs25基因，插入pMLB得pMLB-Pfs25，加牛痘病毒減毒株NYVAC共同轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞，篩選培養(yǎng)重組病毒；免疫印跡發(fā)現(xiàn)Pf患者血清識(shí)別MYVAC-Pfs25表達(dá)Mr為25 000的Pfs25蛋白；將108PFU重組病毒肌肉注射恒河猴，在首次免疫后2和26周加強(qiáng)2次，發(fā)現(xiàn)血清IgG在首次免疫后2～35周升高，在首次免疫后6周達(dá)較高水平；IFA表明首次免疫后28周血清識(shí)別血涂片Pf的Pfs25蛋白。

2.3 重組桿狀病毒

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)，可提高外源基因的表達(dá)效率，可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化、磷酸化和蛋白切割等。Blagborough等[24]用桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirusdual ex?pression system，BDES）表達(dá) Pvs25，將 5×107PFU的BDES-Pvs25肌肉注射或滴鼻免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加強(qiáng)3次，在首次免疫后11周發(fā)現(xiàn)血清 IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b升高，此時(shí)腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株的子孢子進(jìn)行攻擊，在攻擊后3 d用50只斯氏按蚊叮咬小鼠，叮咬后24 h解剖蚊胃，計(jì)數(shù)卵囊數(shù)目，發(fā)現(xiàn)肌肉注射組和滴鼻免疫的卵囊數(shù)目分別下降83.8%和92.1%。

環(huán)子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）位于成熟子孢子的表面，是Mr為40 000～60 000的細(xì)胞前期抗原，在子孢子入侵肝細(xì)胞時(shí)起關(guān)鍵作用。Epstein等[25]發(fā)現(xiàn)pCD-PfCSP肌肉注射健康志愿者可產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。由于宿主MHC分子的多樣性和瘧原蟲抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，宿主將針對(duì)抗原的多個(gè)表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使得單一抗原成分誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答效果往往較低，因此，將PvCSP和Pvs25抗原的編碼基因連接起來可能更為有效。Mizutani等[26]用BDES表達(dá)Mr為110 000的PvCSP-Pvs25融合蛋白，將1×108PFU的BDES-PvCSP-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3和6周加強(qiáng)2次，在首次免疫后8周用3～7只感染伯氏瘧原蟲的斯氏按蚊叮咬15 min進(jìn)行攻擊，攻擊后5～7 d發(fā)現(xiàn)免疫組的原蟲血癥為0.01%～0.77%，而對(duì)照組為0.12%～1.69%。

3 結(jié)語

盡管大部分現(xiàn)有微生物介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)性免疫應(yīng)答，但它們產(chǎn)生的保護(hù)力通常較低，遠(yuǎn)未達(dá)到人們所期望的水平；轉(zhuǎn)基因植物疫苗的質(zhì)量控制和認(rèn)證較難，普遍不被公眾認(rèn)可和接受[27]；酵母表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)水平較高，但其加工修飾與天然蛋白質(zhì)存在差異；腺病毒的自身蛋白及其雙鏈RNA可作為免疫佐劑，但病毒載體有潛在致癌和致病性，人群普遍存在抗腺病毒的抗體，影響其免疫效果；重組牛痘病毒的安全性和有效性值得進(jìn)一步的關(guān)注；昆蟲桿狀病毒表達(dá)蛋白可以糖基化和磷酸化，但其修飾位點(diǎn)與天然蛋白不同。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，人們將對(duì)瘧原蟲的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀遺傳學(xué)進(jìn)行深入研究，從而弄清瘧原蟲的抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，篩選新的抗原分子，構(gòu)建由各期抗原分子組成的多期多價(jià)疫苗；研究這些疫苗的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率、MHC限制性以及能否長期在宿主體內(nèi)表達(dá)；研制新型佐劑、疫苗載體和制備融合抗原，提高疫苗的免疫原性；在人體內(nèi)正確評(píng)價(jià)新型疫苗分子的保護(hù)力及其免疫機(jī)制；積極開展瘧原蟲抗原蛋白家族及其他相關(guān)蛋白生物學(xué)功能研究，提高疫苗的設(shè)計(jì)水平；探索瘧原蟲的體外培養(yǎng)、功能試驗(yàn)、遺傳變異、分子病理和理想的動(dòng)物模型；由于瘧原蟲已對(duì)氯喹產(chǎn)生抗藥性以及蚊媒對(duì)殺蟲劑DDT產(chǎn)生耐受性，還需要研制新型滅瘧藥和殺蟲劑。相信隨著這些問題的闡明，必將推動(dòng)微生物介導(dǎo)的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗研究躍上一個(gè)新的臺(tái)階。

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