MscL與抗生素的相互作用及其潛在用途

江 蘭，王曉敏，唐思陽，李月舟

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，杭州 310058)

21世紀，全球死亡人數(shù)的四分之一源于微生物感染，霍亂與結(jié)核被發(fā)現(xiàn)再次成為威脅人類生命健康的致命疾病[1]。人類面臨的一個主要醫(yī)療問題是細菌引起的某些重癥感染被發(fā)現(xiàn)已對常用抗生素產(chǎn)生了抗性[2]。青霉素廣泛使用后僅一年，相當(dāng)數(shù)量的金黃色葡萄球菌(Staphycococcusaureus,S.aureus)對青霉素形成了抗性；幾年后，超過50%的金黃色葡萄球菌不再對青霉素這種藥物敏感[3]。目前，每天都有越來越多的常見或罕見的細菌被報道對不同類型的抗生素形成耐藥性，抗生素的過量使用和病人未按醫(yī)囑完成完整的抗生素治療方案都在促使耐多藥細菌(multi-drug resistance, MDR)的出現(xiàn)[4]。耐藥菌如腸桿科細菌、結(jié)核桿菌、肺炎桿菌與淋球菌正嚴重威脅人類健康。但是由于財政、管理和科學(xué)等諸多障礙，新藥的研發(fā)進程已減緩甚至停滯[5-6]。因此，治療病人的MDR細菌感染日益困難。目前，在抗生素的開發(fā)渠道研究中僅存在幾種相對較新的小分子[7]。MscL在細菌中普遍存在且氨基酸序列高度保守，此外，人類基因組不含MscL的基因。MscL被認為是 20種最為頂尖的藥物靶標之一[8]。因而，本文就MscL與抗生素的相互作用及其在藥物輸送過程中的潛在用途進行綜述。

1 機械敏感通道

機械敏感通道(mechanosensitive channels, MS), 或稱“機械門控通道”，是一種跨膜通道蛋白，可以感受細胞膜表面的張力，將外界的物理刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的生化信號，從而影響細胞的生命活動[9-10]。

1.1 機械敏感通道的分布

MS通道最早在雞骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)[11]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在動物、植物與細菌中廣泛存在[12]。在哺乳動物中，MS通道涉及眾多的生理功能，如細胞生長、細胞容積調(diào)節(jié)、血壓調(diào)控、聽力、觸覺、平衡和痛覺；許多疾病，如神經(jīng)與肌肉退變、動脈硬化、高血壓、心律失常和青光眼等，都與MS通道異常有關(guān)[12-13]。

1.2 細菌上的機械敏感通道

目前，在大腸桿菌中已知有4種MS通道，根據(jù)電導(dǎo)將其分為MscM(mini, M)、MscS(small, S)、MscK(potassium, K)和MscL(large, L)[14]。迄今為止，研究最為透徹的是大電導(dǎo)機械敏感通道MscL。大腸桿菌MscL由5個相同的亞基構(gòu)成，每個亞基含有136個氨基酸，分子質(zhì)量約為17 ku，其大部分氨基酸為非極性氨基酸，不含半胱氨酸(Cys)；每個MscL亞基含有兩個跨膜區(qū)域( transmembrane1, TM1與 transmembrane 2, TM2), 一個細胞外Loop區(qū)域和位于細胞內(nèi)的N端與C端[15]。研究表明TM1形成MscL的孔道，TM2位于孔道外側(cè)并和膜脂質(zhì)作用； MscL直接感知細胞膜上的張力而開放，并介導(dǎo)離子、小分子、甚至小的蛋白質(zhì)通過細胞；MscL不具備離子選擇性，溶質(zhì)的分子直徑為其唯一的選擇依據(jù)[16]。

在革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌與古細菌中都有發(fā)現(xiàn)MscL的存在，而且細菌MscL的氨基酸序列具有很高的保守性，TM1和TM2中部分氨基酸位點的保守性可高達90%和80%[17-18]。但在哺乳動物和人類基因組中并沒有發(fā)現(xiàn)有MscL的同源體。MscL最早在大腸桿菌(E.coli)中發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，在細菌的滲透調(diào)節(jié)過程中，MscL作為 “緊急釋放閥”而起作用：在細菌的外部環(huán)境的滲透壓急劇下降時，首先，水開始進入細菌細胞引起細胞膨脹，細胞膜上產(chǎn)生張力；然后，細胞膜上的MscL直接感知張力而開放并且形成一個直徑約為30 ?的通道，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，維持滲透壓的平衡，從而避免細胞的裂解[19]。MscL敲除的大腸桿菌對低滲沖擊特別敏感，而表達MscL后，其低滲致死的表型可以被恢復(fù)正常[20]。MscL對細菌的生長也有非常重要的作用，MscL功能異常的突變體會釋放細胞內(nèi)容物導(dǎo)致細菌的生長緩慢甚至引起細菌死亡。因此，必須嚴格調(diào)節(jié)與控制MscL的開放。

結(jié)構(gòu)和功能的研究顯示MscL是5個TM1緊密捆綁構(gòu)成一個漏斗狀結(jié)構(gòu)的通道，在胞質(zhì)側(cè)形成一個疏水的限制性位點，此位點的通道直徑約2?，為整個通道最窄的位置。限制性位點作為通道的閘門而發(fā)揮作用，因此，在MscL的開放過程中，疏水閘門的直徑范圍約為2?～30?[21]，小分子藥物可憑借MscL進入細菌，影響細菌的生長；并且，MscL純化重組于人工膜仍然能夠保持原有的活性與功能[22]。因此，對于藥物而言，MscL是一個非常好的靶標。

2 MscL與抗生素的相互作用

2.1 MscL增強鏈霉素的藥效

鏈霉素是人類發(fā)現(xiàn)的第一種氨基糖苷類抗生素，產(chǎn)生于放線菌屬中的鏈霉菌。自1944年發(fā)現(xiàn)以來，其作用機制得到了廣泛的研究。它的主要作用機制為：首先，鏈霉素進入細胞；然后，它與核糖體30S亞基的S12蛋白結(jié)合并抑制翻譯，并且可能引起mRNA誤讀[23]。鏈霉素廣泛用于治療由革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌引起的細菌感染疾病，如結(jié)核病、心內(nèi)膜感染、腦膜感染和瘟疫[24-25]。

但是，體積大且?guī)щ姾傻逆溍顾剡M入細菌細胞內(nèi)部的機制在很大程度上是未知的。直到最近，有研究報道MscL通道的表達極大程度地增加了鏈霉素與二氫鏈霉素的效力，然而在MscS通道表達時沒有觀察到效力差異，這似乎表明鏈霉素特異性地直接激活通道MscL[26]。目前，有研究人員發(fā)現(xiàn)了鏈霉素進入細胞的一種新機制：二氫鏈霉素與MscL的特定部位(如E.coliMscL 第19位亮氨酸L19)直接結(jié)合并修飾MscL通道構(gòu)象，MscL通道被激活和打開，胞內(nèi)的K+外流，導(dǎo)致細胞膜電位超極化；超極化加大了細胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度，使胞外的帶正電的鏈霉素更容易進入細菌細胞，從而增強鏈霉素的藥效[27]。

數(shù)據(jù)表明，直徑小于30?的化合物則可以通過MscL[28]。而鏈霉素的直徑約為10?，因此，通道MscL可以介導(dǎo)鏈霉素進入細菌細胞，從而殺滅細菌。因此，MscL可能是鏈霉素進入細胞質(zhì)的一種新途徑。此外，在未表達MscL的菌株中，鏈霉素仍有藥效(但此時需要更高濃度的鏈霉素)[26]。這表明，鏈霉素還可以憑借MscL外的其他途徑進入細胞。MscL不但可以增強鏈霉素的藥效，還可以增強其他一些藥物的藥效。如奇霉素、紫霉素、硝呋奇特等抗生素在MscL表達的菌株藥效能得到極大增強[26]。

綜合結(jié)果表明，MscL可以增強抗生素進入細胞質(zhì)的效率，從而增強抗生素的藥效。這表明可以將MscL作為抗生素研究的靶標。

2.2 MscL協(xié)助治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染

金黃色葡萄球菌是造成傷口化膿的主要原因，它主要感染皮膚與軟組織等，它是威脅人類健康的主要致病菌之一[29]。1959年，甲氧西林開始用于治療耐青霉素S.aureus引起的感染；1961年開始，英國首先發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus, MRSA)；迅速地，其他歐洲國家、日本、澳大利亞和美國也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MRSA[30]。由于新型抗生素研制的緩慢，使得“超級細菌” MRSA的治療越來越難。為了解決這個問題，澳大利亞和美國的研究人員以MscL為靶標設(shè)計了一類新型抗生素10(1,3,5-tris[(1E)-2′-(4″-benzoic acid)vinyl] benzene )[31]。研究顯示，抗生素10是一種有效的抗生素，可治愈感染MRSA的秀麗隱桿線蟲。目前，許多MRSA引起的感染使用糖肽類抗生素治療，如萬古霉素[32-33]。按照FDA的標準，治療MRSA感染，萬古霉素的治療濃度范圍為20～40 μg/mL。然而，僅約1.5 μg/mL的抗生素10，即可有效治療MRSA感染。

研究顯示，抗生素10對革蘭氏陽性菌具有很強的藥效，但對革蘭氏陰性菌的作用較小[34]；抗生素10對陰性菌的藥效較弱，可能是由于革蘭氏陰性菌含有脂多糖外膜保護細菌。盡管抗生素10對MRSA感染的治療十分有效，但是它在治療濃度下在人和哺乳動物細胞系中均沒有顯示細胞毒性[35-36]。因此，以MscL為靶標的抗生素10是一種極具潛力的抗菌試劑。這也表明將MscL作為靶標來研發(fā)新藥以治療耐藥菌感染是一個很好的研究方向。

3 MscL的潛在用途

MscL能夠在體外表達，并且當(dāng)MscL純化重組于脂質(zhì)雙分子層后仍具有機械敏感性；MscL的激活不需要其他蛋白等輔助成分，完全依賴于脂質(zhì)雙分子層，脂質(zhì)雙分子層的厚度、膜的剛度與脂質(zhì)單分子層的自發(fā)曲率都會影響MscL的機械敏感性[22, 37]。此外，MscL具有極大的開放孔徑和廣泛的物質(zhì)通透性。MscL的這些特征，促使它在藥物的攝入與釋放應(yīng)用研究中十分具有吸引力。

3.1 MscL可介導(dǎo)藥物進入細胞

目前，不能透過細胞膜的生物大分子主要依靠細胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)介導(dǎo)進入細胞，CPPs已經(jīng)成為大分子跨越細胞膜的有效工具，但是生物分子必須與CPPs有關(guān)聯(lián)才可以透過細胞膜進入細胞[38]。因此，對于沒有關(guān)聯(lián)CPPs但又需要進入細胞發(fā)揮其作用的生物活性分子，必須尋找其他途徑。

例如，生物活性分子——鬼筆環(huán)肽，它不易透過細胞膜，但是它是微絲的特異性標志物，因此在微絲的相關(guān)研究中需采取特殊的理化處理，鬼筆環(huán)肽才可透過細胞膜進入細胞，這給研究工作帶來不便[39]。MscL雖然只存在于細菌，但是MscL可以人工重構(gòu)于哺乳動物細胞，并且其仍然具有完好的生理功能[40]。因此，有研究人員將MscL在體外表達，并將其重構(gòu)于哺乳細胞，發(fā)現(xiàn)一些重要的生物活性分子如鬼筆環(huán)肽、聚賴氨酸肽、乳鐵蛋白衍生肽等不能透過細胞膜的大分子通過MscL進入哺乳動物細胞[41-42]。

因此，MscL可介導(dǎo)不能透過細胞膜的生物活性分子轉(zhuǎn)運進入哺乳動物細胞，表明MscL可作為轉(zhuǎn)運工具將多肽或者藥物分子轉(zhuǎn)入細胞，這為藥物的攝取提供了新的研究方向。

3.2 MscL可調(diào)控藥物釋放

大腸桿菌MscL作為大電導(dǎo)的機械敏感離子通道，是目前研究最為清楚的通道蛋白之一。MscL通道的開放需要克服極大的能量障礙，因此，在正常的情況下MscL通道是關(guān)閉的；但是，當(dāng)細胞膜上的壓力達到閾值時，MscL通道的構(gòu)象將發(fā)生變化，由閉合轉(zhuǎn)為開放[43]。

通常情況下，MscL的開放是來源于膜上的壓力刺激。然而，引進極性或者帶電氨基酸，以及其他帶電化合物到E.coliMscL的第22位氨基酸或者第26位氨基酸的位置同樣會引起MscL的自發(fā)開放[44-45]。研究顯示，MscL的兩個氨基酸位點G22或者G26突變?yōu)榘腚装彼?，然后用人工合成的光敏感化合物修飾G22C或者G26C，用波長為366 nm的紫外光照射MscL通道，光敏感化合物將會發(fā)生電荷分離，引起與化合物連接的MscL通道打開；然后再用可見光照射MscL通道，通道則回到關(guān)閉狀態(tài)[46-47]。在光照條件下，修飾后的MscL的開放或者關(guān)閉是可調(diào)控的。

因此，MscL作為一個在光照下可自由開放與關(guān)閉的納米閥門，為今后研究調(diào)控藥物的釋放提供了一個新的研究方向。

4 總結(jié)與展望

數(shù)據(jù)顯示，細菌耐藥性問題已經(jīng)成為一個全球問題，革蘭氏陽性菌，特別是金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌和肺炎鏈球菌的耐藥性問題對人類健康構(gòu)成嚴重威脅[48]。盡管耐藥菌日漸增多，但是新藥的研發(fā)進程卻十分緩慢[49]，因此，人類急需尋找能有效抑菌的藥物或者治療方案。大量的實驗數(shù)據(jù)表明，MscL通道具有在細菌中普遍分布和在不同細菌中有很強的序列保守性等多方面的特點，使得MscL靶標在治療細菌感染有很好的前景[47-50]。近年來，關(guān)于MscL的研究逐漸增多，研究人員開始注意MscL在治療耐藥菌方面的應(yīng)用，研究主要集中于E.coliMscL，但是并沒有E.coliMscL的晶體結(jié)構(gòu)。這需要盡快獲得E.coliMscL的晶體，將理論知識與晶體結(jié)構(gòu)相對應(yīng)，考慮設(shè)計藥效更強的藥物分子。目前，其他細菌中的MscL的研究仍然較少，因此，也需要加大在其他種類細菌中的MscL研究，積累更多的理論依據(jù)，確定不同細菌中的MscL與抗生素作用的機制，在理論指導(dǎo)下篩選或者設(shè)計有效的藥物分子。

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