脂肪干細胞治療勃起功能障礙新進展

王明珠，羅莉，邱卓琳，朱建斌，李昊，蔡祥勝

1.西安市第四醫(yī)院 生殖醫(yī)學中心，陜西 西安 710004；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 生殖中心，廣東 廣州 510515；3.廣東唯泰生物科技有限公司 技術中心，廣東 佛山 528000；4.廣東藥科大學 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510080

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）嚴重影響患者及其配偶的生活。ED是多種疾病的結果，被定義為陰莖持續(xù)不能達到和（或）維持足夠的勃起以獲得滿意的性生活。流行病學研究資料表明全球ED的高發(fā)病率。ED是由神經源性引起的內皮細胞或平滑肌功能障礙。例如，長期糖尿病導致內皮功能障礙，減少氮能神經信號，并增加了陰莖組織氧化應激，這反過來又導致一氧化氮合成下降、平滑肌松弛及海綿體細胞凋亡和纖維化[1]。而前列腺切除術后，ED是神經血管束直接受損的結果。前列腺切除術后，由于直接神經損傷或間接神經失用癥，導致陰莖組織缺氧、纖維化和細胞凋亡，進而導致ED發(fā)生[2]。目前磷酸二酯酶5型抑制劑（phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5-I）是 ED 患者的一線治療選擇[3]，其他方法如尿道內栓劑、陰莖假體等也用于治療ED。多數(shù)情況下，PDE5-I治療ED有效，但是對糖尿病相關ED和根治性前列腺切除術后ED的治療效果差，因此，為這類患者提供有效的治療方案成為臨床難題。近10年來已經建立了糖尿病ED、前列腺切除術后ED動物模型，使得可以探討疾病的發(fā)展和治療方案，而其中一個令人欣喜的治療方案是干細胞的使用。過去的20年里，研究者們在干細胞治療方面取得了重大成就。最近，干細胞的應用已擴展到ED治療。在此，我們簡要綜述干細胞治療ED的相關研究進展。

1 干細胞

1998年，美國威斯康星大學的Thomson等報道發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細胞[4]。隨后，日本京都大學的山中伸彌發(fā)現(xiàn)了成體干細胞的再編程方法，可使分化的成體干細胞逆向分化為胚胎干細胞，被稱為誘導多能干細胞[5]。該發(fā)現(xiàn)擴大了干細胞研究領域，并為疾病提供了新的治療方案。

干細胞具有自我更新和分化潛能[6]?？傮w來說，分化為早期胚胎的稱為胚胎干細胞，來自成熟組織的稱為成體干細胞。與成體干細胞相比，胚胎干細胞可以分化為更多種細胞，并且可供分化的時間長。但是，考慮到胚胎干細胞研究的倫理爭議較多，其臨床研究受到很大限制，而成體干細胞則成為目前研究關注的熱點。

干細胞具有特定的細胞表面標記物和轉錄因子。胚胎干細胞表面標記包括階段特異性胚胎抗原（stage specific embryonic antigen，SSEA）3和4、腫瘤排斥抗原（tumor rejection antigen，TRA）1-60和1-81。首次發(fā)現(xiàn)的成體干細胞是源于骨髓的造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）[7]，其次是骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）。MSC是脂肪組織、臍帶血、胎盤和牙齒中發(fā)現(xiàn)的成體干細胞，表達幾種細胞表面標記物 ，包 括 CD105、CD73、CD44、CD166和 CD54/CD102，同時，其缺乏HSC特征性表面標記物如CD14、CD34、CD45、CD11a及 CD31。人體內很多器官都具有成體干細胞，如心臟組織、脂肪組織、骨骼肌、睪丸細胞、內皮、腸和腦組織，有望用于修復受損組織[8]。

2 脂肪干細胞

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）及其再生潛能于2001被發(fā)現(xiàn)[9]。通過全麻抽脂術（吸脂）分離脂肪干細胞，體外培養(yǎng)并加入適當?shù)恼T導因子可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和成肌細胞等。脂肪組織中的ADSCs比骨髓MSCs數(shù)量高出100～500倍[10]。因此，皮下脂肪和內臟脂肪是獲得ADSCs最簡單和最實用部位。皮下脂肪中ADSCs的提取安全、微創(chuàng)、得率高。

盡管脂肪干細胞的存在已被證實，但精確定位仍然存在困難。我們現(xiàn)在知道ADSCs存在于基質干細胞龕中。更具體地說，研究表明它們位于脂肪脈管系統(tǒng)的微環(huán)境中[11]。實驗結果證實ADSCs由于存在于脂肪組織中的不同血管干細胞群中，其分化潛能不同，取決于細胞所在環(huán)境[12]。

獲得脂肪組織后，須用膠原酶溶解基質血管組分（stromal vascular fraction，SVF）[13]，分離出干細胞，然后根據(jù)特異性細胞標記分類干細胞，而定義這些細胞的表面標記物一直是很困難的事情。目前常用的特征標記分類包括CD29、CD34、CD105、CD73、CD90和CD105[14]。科學家在各種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADSCs，并刺激其分化為軟骨細胞、平滑肌和神經細胞[15-17]。

3 脂肪干細胞用于治療ED

ADSCs在臨床前期治療ED中顯示出巨大的再生潛能。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs治療ED時可以改善海綿體神經擠壓傷后勃起功能[18]。該研究可以作為前列腺切除術后的神經失用癥模型。Albersen等在研究中使用這一模型，證明ADSCs和ADSCs衍生的細胞裂解物的識別機制和作用[19]。雙側海綿狀神經損傷采用ADSCs、干細胞裂解物治療后4周做勃起功能及陰莖組織學評價，與對照組比較，治療后勃起功能顯著恢復[20]。且神經型一氧化氮合酶（nNOS）顯著高表達、平滑肌含量升高、纖維化程度減輕。事實上，并不是把干細胞移入后生長并分化，而是干細胞溶解物中可溶性因子的釋放發(fā)揮旁分泌效應使勃起功能恢復[21]。

Fandel等研究自體脂肪組織來源SVF治療方案是否和ADSCs一樣，能夠改善海綿體神經受損后勃起功能[22]。ADSCs和SVF治療的動物nNOS陽性率顯著大于對照組動物，但ADSCs治療與SVF治療的動物組中nNOS陽性率或顱內壓/平均動脈壓（ICP/MAP）無顯著性差異。這些結果表明，神經元陽性反應與含nNOS神經纖維再生相關。為進一步闡明ADSCs依賴的勃起功能恢復機制，研究人員使用了胸腺嘧啶核苷類似物（EdU）標記的ADSCs，并在不同時間點追蹤這些細胞。他們觀察到在骨盆神經節(jié)（MPG）基質中細胞衍生因子1（SDF-1）的表達上調，這為向MPG募集ADSCs提供了信號。在募集到的ADSCs的組中觀察到海綿體中神經再生和改善的平滑肌/膠原比。

Song等結合上述觀察的神經營養(yǎng)因子，評價血管生成因子在海綿體神經損傷后勃起功能恢復中的作用。神經受損后采用海綿體內注射SVF后2周，觀察到神經刺激性勃起的劑量依賴性反應。此外，他們發(fā)現(xiàn)血管生成因子，包括血管生成素1（Ang-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子的表達增加[23]。Castiglione等對陰莖硬結癥大鼠模型進行被膜內注射人ADSCs的治療，以評估ADSCs預防纖維化和改善勃起功能的效果[24]。對比之前更換不可逆損傷組織的研究，該小組評估了ADSCs預防急性炎癥期陰莖硬結癥的效果。治療后5周，評價勃起功能并取陰莖組織進行蛋白質表達分析。結果表明，和對照組相比，ADSCs治療組ΔICP、ICP/MAP顯著增加，腫大組織明顯減??；免疫印跡顯示膠原蛋白Ⅲ和彈力蛋白增加。5周后檢測到小部分干細胞，這一發(fā)現(xiàn)支持了旁分泌機制導致上述結果的假設。進一步的研究提供了更多對旁分泌機制的支持。例如，在體外培養(yǎng)時，干細胞釋放細胞因子和生長因子進入其環(huán)境，類似于體內注射干細胞，提示干細胞可以作為一種治療方法。

Gokce等用相同的大鼠模型評估ADSCs作為預防ED的措施和治療方法[25]。結合已有研究，他們觀察的2種治療方法都有效增加了ICP和ICP/MAP值。為了解釋可能的分子機制，他們也發(fā)現(xiàn)抗肝纖維化的酶濃度、基質金屬蛋白酶（MMP）增加，金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）減少。這一發(fā)現(xiàn)為Castiglione研究中膠原和彈性蛋白減少的機制提供了證據(jù)。最近，Gokce等報道基因編輯后ADSCs移植，具有或不具有干擾素α2b的ADSCs減弱了模型大鼠陰莖硬結癥樣改變并增強了勃起功能。這表明ADSCs具有臨床應用的可能性，可阻止硬結癥斑塊的形成，或至少限制疾病的自然進展[26]。另一項研究表明，豬小腸黏膜下同源ADSCs的移植可保留和維持正常的勃起功能[27]。ADSCs的小腸黏膜下移植可誘導誘導型一氧化氮合酶（iNOS）轉錄上調及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、nNOS和VEGF下調。這一結果進一步支持修復損傷白膜可作為治療陰莖硬結癥的選擇。

前列腺癌的放射治療是另一個導致ED原因，ADSCs可以改善這類患者的勃起功能障礙。Qui等研究了ADSCs改善放療誘導的ED大鼠勃起功能障礙[28]。接受放療的大鼠勃起功能明顯減弱，nNOS和海綿體平滑肌含量減少；而當放療大鼠注射ADSCs后，勃起功能恢復，nNOS表達和平滑肌含量恢復。

Garcia等利用2型糖尿病大鼠模型研究ADSCs在治療2型糖尿病ED中的作用[29]。通過提取自體腺體周圍脂肪組織分離培養(yǎng)干細胞注入大鼠陰莖，并與對照組相比，觀察到大鼠勃起功能改善、細胞凋亡減少、nNOS水平升高。以往研究表明，治療第3周的組織內只有少量干細胞可見，表明細胞因子和生長因子通過旁分泌釋放。

脂肪源性SVF移植也有助于糖尿病患者勃起功能的恢復。研究證實SVF通過恢復內皮、提高平滑肌含量、增加血管生成因子的釋放，促進磷酸化eNOS產生和恢復陰莖神經纖維，改善勃起功能[30]。有趣的是，與常氧環(huán)境下培養(yǎng)的ADSCs相比，低氧預處理的ADSCs可更高程度地誘導血管生成因子表達，從而改善大鼠勃起功能[31]。

研究者也采用其他策略提高ADSCs的有效性，其中之一是基因工程技術。Chen等將VEGF基因轉染ADSCs并將其移植到2型糖尿病大鼠ED模型中[32]，與單獨使用ADSCs和VEGF相比，用表達靶基因的ADSCs組大鼠勃起功能顯著改善。此外，還證明了VEGF轉染ADSCs組能更好地恢復VEGF信號通路、增加內皮和平滑肌功能，這些都是恢復勃起功能的基礎。

另一種用于增強ADSCs的策略是用生長因子包被的水凝膠和生物降解膜。Piao等研究了被聚乳酸-乙醇酸（PLGA）膜包被的ADSCs和腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）對海綿體神經損傷大鼠模型的療效[33]。與單獨使用ADSCs或BDNF/PLGA膜組相比，使用PLGA膜包被ADSCs的治療組更顯著地改善了神經再生和勃起功能。隨后，他們觀察了BDNF/PLGA膜與含有堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的ADSCs凝膠相結合的治療效果。這種治療策略與采用ADSCs+BDNF/PLGA膜或單獨使用bFGF相比，可以顯著改善勃起功能至接近正常水平。

目前，ADSCs是惟一可以分離并自體移植的細胞類型。此外，已有商業(yè)化的自動ADSCs分離儀器。因此，就成本、風險、倫理和有效性而言，ADSCs在治療ED的應用中有很大潛力[34]。

顯然，ADSCs為今后治療ED提供了一種有效的治療方法。臨床前各種ED動物模型為ADSCs治療提供了證據(jù)，將會有更多支持干細胞安全性和有效性的研究。預計在不久的將來，醫(yī)生們將能夠采用ADSCs治療ED。