CRISPR-Cas9技術(shù)在遺傳性疾病基因治療中的研究進(jìn)展

梅雯，孫美濤，王唯斯，柴蓓蓓，張若鵬，王仁鳳，熊偉

1.大理大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，b.第一附屬醫(yī)院，云南 大理 671000；

2.昆明市祿勸縣湯郎衛(wèi)生院，云南 昆明 651500

遺傳性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，一直是人類面臨的難治性疾病之一，也是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的研究領(lǐng)域。隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)很多人類遺傳性疾病與基因突變有關(guān)。目前，基因編輯技術(shù)如傳統(tǒng)的鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）及最新的 CRISPR-Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated endonuclease 9（Cas9）］技術(shù)在遺傳性疾病基因治療方面發(fā)揮了重要作用。CRISPR-Cas9技術(shù)作為一種新型基因編輯技術(shù)，其操作便利性和適用性引起了普遍關(guān)注。探究CRISPR-Cas9技術(shù)的作用機(jī)制是一個長期探索過程，已有研究表明CRISPR-Cas9是細(xì)菌用以保護(hù)自身對抗病毒或噬菌體的一種防護(hù)機(jī)制，也是一種對付病毒或噬菌體的基因武器。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cas9設(shè)計更為簡單，應(yīng)用領(lǐng)域更為寬廣[1-2]。迄今，科學(xué)家們利用CRISPR-Cas9技術(shù)可對目標(biāo)序列進(jìn)行精確的定位操作，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，為遺傳性疾病、癌癥及病毒感染性疾病等提供了新的治療手段。我們整理了近年來的相關(guān)文獻(xiàn)，將CRISPR-Cas9作用原理及其在遺傳性疾病基因治療中的應(yīng)用、存在問題和展望做簡要綜述。

1 CRISPR-Cas9分子機(jī)制及作用原理

目前，根據(jù)Cas位點基因組織源性的不同將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ、Ⅲ型CRISPR-Cas系統(tǒng)降解外源DNA時需多種Cas蛋白參與，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的切割復(fù)合體。Ⅱ型系統(tǒng)由CRISPR、向?qū)NA（gRNA）和Cas9組成，缺一不可。其中g(shù)RNA決定Cas9核酸酶特異性切割位點，由其5′端約20 bp堿基進(jìn)行特異性識別，Cas9蛋白具有調(diào)節(jié)crRNA（CRISPR RNA）結(jié)構(gòu)及剪切雙鏈DNA的雙重作用，其作用是特異性切割外源DNA位點。目前對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究頗多，在多領(lǐng)域基因組編輯中發(fā)揮重要作用[3-4]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較固定，由5′端的反式激活 crRNA（tracrRNA），中間的 Cas9、Cas1、Cas2等蛋白編碼基因及3′端的CRISPR-Cas9位點共同組成，CRISPR序列包括間隔序列與重復(fù)序列。CRISPR-Cas9識別位點為PAM（protospacer adjacent motif），由 1～4個堿基組成[5]，一般為5′-NGG-3′結(jié)構(gòu)，這類結(jié)構(gòu)在幾乎所有物種基因組中存在，因此CRISPR-Cas9的識別位點幾乎包含所有生物，使得其在各學(xué)科中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注和諸多研究[6]。當(dāng)細(xì)菌被噬菌體或病毒等外源基因侵襲時，CRISPR-Cas9將識別入侵者的PAM并找到其原間隔序列，然后把入侵者身份信息作為間隔序列記錄到CRISPR序列中，當(dāng)噬菌體或病毒再次入侵宿主，細(xì)菌在其前導(dǎo)區(qū)控制下，細(xì)菌轉(zhuǎn)錄重復(fù)-間隔序列轉(zhuǎn)錄形成pre-crRNA，pre-crRNA中的重復(fù)序列與同時被轉(zhuǎn)錄的tra-crRNA互補配對形成雙鏈小向?qū)NA（sgRNA），在Cas9蛋白的協(xié)同下被RNaseⅢ加工處理，形成成熟的crRNA，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合物，識別并結(jié)合在與crRNA互補的序列上，隨后DNA雙鏈解開，形成R-loop環(huán)，之后crRNA與互補鏈雜交；另一條鏈保持單鏈游離形式，然后HNH活性位點剪切與crRNA互補的DNA鏈，RuvC活性位點剪切游離單鏈，Cas9蛋白引入雙鏈斷裂（DSB），隨后啟動2種DNA修復(fù)系統(tǒng)完成修復(fù)：非同源末端連接（native nonhomologous end joinijg，NHEJ）和同源重組介導(dǎo)的修復(fù)（homology-directed repair，HDR）[7-9]。NHEJ途徑對內(nèi)源基因組DNA進(jìn)行敲出或替換，此途徑不能進(jìn)行精確控制。HDR通過引入外源DNA實現(xiàn)基因的精準(zhǔn)控制。

2 CRISPR-Cas9在遺傳疾病治療方面的研究進(jìn)展

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)對地中海貧血的基因治療

地中海貧血是一類遺傳性溶血性貧血疾病，對人類健康危害極高，也是全球最常見和發(fā)生率最高的一類單基因遺傳病。地中海貧血根據(jù)基因型不同分為4種，其中α和β型較為常見。但在基因治療方面，對β型地中海貧血（β-thalassemia，β-Thal）的研究較多。目前主要的技術(shù)思路是對β地中海貧血患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）通過CRISPR-Cas9技術(shù)校正血紅蛋白β（hemoglobin beta，HBB）基因，從而能夠分化正常紅細(xì)胞，達(dá)到治愈的目的。Ou等研究[10]證實，通過CRISPR-Cas9校正β地中海貧血患者的iPSC可以避免同種異體移植排斥反應(yīng)，將CRISPR-Cas9校正后的iPSC注射免疫缺陷小鼠，隨后在該鼠中可看到HBB的表達(dá)，并且沒有發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)與已接觸抗原的iPSC相比，處于分化早期的iPSC有更好的分化能力和修復(fù)能力[11-12]。Niu等[13]發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9與單鏈寡脫氧核苷酸組合能夠校正β地中海貧血患者iPSC中的HBB基因CD41/42突變。Luo等[14]推薦內(nèi)含子序列I2-1作為HBB的校正CRISPR靶點，可提高CRISPR對iPSC校正的安全性。但如果CRISPR-Cas9識別非目標(biāo)DNA序列，可導(dǎo)致大量非靶標(biāo)斷裂片段，致總?cè)旧w缺失[15]。Song[16]等報道了通過CRISPR-Cas9技術(shù)治療β地中海貧血，首先將患者來源的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)分化為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（β-Thal-iPSCs），再用CRISPR-Cas9技術(shù)修復(fù)血紅蛋白β珠蛋白基因。結(jié)果顯示，基因修正后的細(xì)胞核型正常，在向造血細(xì)胞分化的過程中，可以高比例的生成各類造血祖細(xì)胞，并表達(dá)正常的β珠蛋白。2014年，Xie[17]等也運用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合piggy Bac轉(zhuǎn)座子有效地糾正患者來源的iPSCs，修復(fù)HBB基因，而且沒有出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，細(xì)胞呈現(xiàn)出完整的功能性和正常的細(xì)胞核型。Ye[18]等使用CRISPR/Cas9技術(shù)在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中刪除13 kb的β珠蛋白基因，從而模仿自然情況下發(fā)生的遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合征（HPFH），結(jié)果發(fā)現(xiàn)刪除β珠蛋白位點的一部分回導(dǎo)致紅細(xì)胞的γ珠蛋白基因表達(dá)升高，這種模擬HPFH的方法可能為β地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病病人帶來新的治療前景。CRISPR/Cas9技術(shù)為地中海貧血治療帶來了希望，但是仍然面臨許多困難，如經(jīng)基因糾正后的HBB的分化能力、生存力和脫靶效應(yīng)等安全性問題。

2.2 CRISPR-Cas9技術(shù)對杜氏肌營養(yǎng)不良的基因治療

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種X染色體隱性遺傳疾病，臨床表現(xiàn)主要是因骨骼肌不斷退化出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，目前尚無有效療法。該病通常由抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因突變引起，該基因位于染色體Xp21.2-p21.1，全長約2220 kb，包含89個外顯子，cDNA全長14 kb，是目前已知最大的人類基因。DMD的突變多為1個或幾個外顯子的缺失導(dǎo)致移碼突變或提前終止，不能合成正常的抗肌萎縮蛋白。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)在杜氏肌營養(yǎng)不良的基因治療領(lǐng)域有著較大潛力。Mendell等[19]用腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）載體將特定的gRNA/Cas9轉(zhuǎn)入肌營養(yǎng)不良癥模型鼠（mdx）骨骼肌和心肌中，借此敲除mdx小鼠產(chǎn)生自發(fā)突變的23號外顯子，結(jié)果可翻譯成具有部分功能的抗肌萎縮蛋白。Li[20]等用CRISPR-Cas9技術(shù)通過3種校正方法（外顯子跳躍、移碼和外顯子敲入）校正DMD病人來源的iPS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外顯子敲入最有效，進(jìn)一步通過研究基因組的完整性、核型分析、拷貝數(shù)變異和外顯子測序來確定具有最小變異的克隆，最后成功檢測到抗肌萎縮蛋白的表達(dá)。Long[21]等建立杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠模型，用腺病毒相關(guān)病毒AAV9在mdx小鼠模型特異性表達(dá)CRISPR-Cas9，觀察肌肉的結(jié)構(gòu)和功能，糾正突變的抗肌萎縮蛋白基因。有研究[22]通過CRISPR-Cas9移除突變位點后，小鼠肌收縮力增加，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肌肉組織中壞死現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)、炎癥細(xì)胞浸潤減少、肌纖維化比例降低；此外，心肌細(xì)胞中的抗肌萎縮蛋白表達(dá)也有恢復(fù)。通過僅使用針對內(nèi)含子區(qū)域的一個引導(dǎo)RNA（gRNA）來實現(xiàn)外顯子移除，野生型肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)得到恢復(fù)，這種技術(shù)可以提高編輯效率并減少脫靶效應(yīng)的風(fēng)險，因而這項研究為攜帶致病基因的患者開辟了新的治療視角[23]。有研究表明，肌營養(yǎng)相關(guān)蛋白（utrophin）量的增加能夠彌補部分抗肌萎縮蛋白的損失[24]。CRISPR-Cas9可調(diào)控基因表達(dá)，sgRNA靶標(biāo)肌營養(yǎng)相關(guān)蛋白基因的啟動子能使其編碼蛋白質(zhì)的量增加1.7～6.9倍，通過提高肌營養(yǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來治療該疾病。Ousterout[25]等同樣也用CRISPR-Cas9技術(shù)糾正DMD患者成肌細(xì)胞中的DMD基因突變，糾正后的肌細(xì)胞能表達(dá)正常的抗肌萎縮蛋白。目前我國仍有大量杜氏肌營養(yǎng)不良患者，雖然該病尚無非常有效的療法，但CRISPR-Cas9技術(shù)的迅速發(fā)展給DMD的治療帶來了曙光。

2.3 CRISPR-Cas9技術(shù)對α1抗胰蛋白酶缺乏癥的基因治療

α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）缺乏癥是一種先天性代謝遺傳疾病[26]。通過CRISPRCas9技術(shù)將α1-AT基因（AAT或SERPINA1，NC-000014.9）整合到人細(xì)胞系HEK293T的AAVS1位點，可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組α1-AT，因此，生成重組AAT蛋白是治療α1-AT缺乏癥極有希望的治療手段，可進(jìn)一步用基因編輯手段改良肝臟干細(xì)胞，治療α1-AT 缺乏癥[27]。Smith 等[28]用 CRISPRCas9技術(shù)對含有Z-AAT點突變的α1-AT缺乏患者來源的iPSC進(jìn)行遺傳修飾，發(fā)現(xiàn)能特異性靶向野生型和突變型等位基因，并能糾正基因突變位點，為α1-AT缺乏癥的治療開辟了新的思路。

2.4 CRISPR-Cas9技術(shù)對帕金森病的基因治療

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其致病機(jī)理目前仍不清楚，但有研究表明遺傳因素在PD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

目前藥物和手術(shù)只可對癥支持治療PD，不能治愈疾病。有一種α突觸核蛋白與PD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，這是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)，有人提出能用CRISPR-Cas9對該蛋白進(jìn)行實時監(jiān)測，從而找出引發(fā)其水平異常的原因，對PD的治療十分重要[29]。CRISPRCas9技術(shù)作為治療遺傳疾病的一種新型手段，對PD的治療意義重大。迄今已發(fā)現(xiàn)至少6個易感基因與家族性PD有關(guān)，PARK16、PARK17和PARK18是PD的遺傳風(fēng)險基因[30]，其中PARK17的病理機(jī)制研究較少。Ishizu等[31]為了研究PARK17在體內(nèi)的作用機(jī)制，構(gòu)建了Vps35 D620N敲入小鼠，表達(dá)具有內(nèi)源性表達(dá)模式的同源突變蛋白。同時用CRISPR-Cas9技術(shù)移除小鼠PARK17基因外顯子15中的Vps35將顯著降低中腦黑質(zhì)多巴胺的釋放，對緩解PD有一定的療效。此外，CRISPR-Cas9可通過逐個敲除相關(guān)發(fā)病基因?qū)ふ疑l(fā)性PD的基因變異[32]。

2.5 CRISPR-Cas9技術(shù)對遺傳性酪氨酸血癥的基因治療

CRISPR-Cas9技術(shù)在遺傳性酪氨酸血癥基因治療領(lǐng)域也顯現(xiàn)出了它的優(yōu)勢。有研究[33]通過CRISPR-Cas9敲除小鼠羥基苯基丙酮酸氧化酶（hydroxy phenyl pyruvate oxidase，Hppd）基因的3、4號外顯子，從而將Ⅰ型酪氨酸血癥肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Ⅲ型良性酪氨酸血癥，與非編輯肝細(xì)胞Fah（-/-）/Hppd（+/+）相比，基因編輯后的肝細(xì)胞Fah（-/-）/Hppd（-/-）Ⅰ型酪氨酸含量明顯增長，而在部分小鼠中只出現(xiàn)Ⅰ型酪氨酸，在成功敲除小鼠Hppd基因的3、4號外顯子后的8周內(nèi)，酪氨酸分解代謝變?yōu)檎?，?jīng)治療后的小鼠健康，且無異常癥狀。2014年，Yin[34]等在活體成年動物體內(nèi)糾正缺陷基因，治愈了遺傳性Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠。他們以攜帶突變延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的成年小鼠為模型，設(shè)計了3條單鏈引導(dǎo)RNA，靶向靠近突變位點的不同DNA序列，進(jìn)一步將這些RNA引導(dǎo)鏈、編碼Cas9的基因，以及由199個核苷酸構(gòu)成、包含正常FAH基因序列的DNA模板轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，采用高壓尾靜脈注射方式將上述CRISPR元件注入動物體內(nèi)，最終進(jìn)入肝細(xì)胞，1/250的肝細(xì)胞中存在正確的基因插入。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞增殖，取代病變肝細(xì)胞，最終占據(jù)約1/3肝細(xì)胞，小鼠最終生存下來。

2.6 CRISPR-Cas9技術(shù)對Crygc基因突變白內(nèi)障的基因治療

白內(nèi)障是影響老年人視力及致盲的主要眼部疾病之一。2013年中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松團(tuán)隊將Cas9 mRNA和sgRNA-4共同注射到攜帶Crygc基因突變的小鼠白內(nèi)障遺傳疾病模型受精卵細(xì)胞質(zhì)中，與對照組相比，經(jīng)CRISPR-Cas9處理后的小鼠沒有出現(xiàn)白內(nèi)障，最后發(fā)現(xiàn)有1/3的新生小鼠白內(nèi)障得到治愈[35]。白內(nèi)障小鼠突變的DNA得到修復(fù)后，正?；蛞搽S之遺傳給子代，子代的白內(nèi)障得到根治。這是首次將CRISPR-Cas9技術(shù)用于Crygc基因突變所致白內(nèi)障領(lǐng)域。此后，他們還成功地在精原干細(xì)胞中利用CRISPR-Cas9技術(shù)治療Crygc基因突變引起的白內(nèi)障[36]。

2.7 CRISPR-Cas9技術(shù)對囊性纖維化的基因治療

囊性纖維化是囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞膜對部分離子（如Na+）的通透性降低進(jìn)而造成黏液分泌過多的一種疾病。過多的黏粘液不能自由流出呼吸管，因而一再造成感染，臨床表現(xiàn)為慢性阻塞性肺疾病，除此之外它也可能造成胰酶分泌不足，因而造成腹瀉。在囊性纖維化基因治療方面，Krishnan等[37]通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除CFTR基因的7號外顯子后，導(dǎo)致Cl-釋放減弱，并抑制氨基丁酸產(chǎn)生，降低神經(jīng)興奮，此結(jié)果提示，敲除CFTR基因可調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度，且參與神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)。Schwank等[38]用CRISPR技術(shù)以及一個包含插入修補序列的供體質(zhì)粒糾正囊性纖維化患者的蛋白質(zhì)錯誤折疊，修正后的基因表達(dá)正常，克隆類器官也獲得了適當(dāng)?shù)倪z傳糾正，此項研究為單基因遺傳缺陷患者的原代成體干細(xì)胞同源重組基因校正提供了證據(jù)。

2.8 CRISPR-Cas9技術(shù)對鐮狀細(xì)胞性貧血的基因治療

鐮狀細(xì)胞病是在全球范圍內(nèi)影響人類健康和壽命的一種血紅蛋白遺傳性疾病。鐮狀細(xì)胞貧血患者D鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，形成異常的血紅蛋白S（HbS），取代了正常血紅蛋白（HbA）。Dever[15]等發(fā)現(xiàn)，矯正患者的體外造血干細(xì)胞基因能治療鐮狀細(xì)胞貧血。研究者獲取患者造血干細(xì)胞后，用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在HBB基因的造血干細(xì)胞中實現(xiàn)同源重組，矯正突變的基因，然后對鐮狀紅細(xì)胞貧血病人的造血干細(xì)胞設(shè)計一個濃縮模型，對其細(xì)胞進(jìn)行濃縮，超過90%的患者實現(xiàn)了靶向整合，獲得矯正的造血干細(xì)胞，16周后被編輯的細(xì)胞均移植入小鼠骨髓，矯正的造血干細(xì)胞仍具有造血功能，而且具有正常的紅細(xì)胞壽命。Huang等[39]用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對鐮狀細(xì)胞性貧血患者的iPSC進(jìn)行基因編輯，將病人的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSC，采用同源重組來修復(fù)發(fā)生突變的HBB基因，再將修復(fù)的iPSC定向誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)，基因修正后的iPSC可以成功地分化至網(wǎng)織紅細(xì)胞階段，并表達(dá)正常的β珠蛋白。

2.9 CRISPR-Cas9技術(shù)對血友病的基因治療

血友病為一組X染色體連鎖遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，表現(xiàn)為血漿中凝血因子合成減少或功能缺陷，凝血時間延長，輕者很輕微創(chuàng)傷就出血不止，重者即使不受傷也有“自發(fā)性”出血傾向。血友病分為A、B、C 3種，治療方法有替代治療和基因治療[40]。血友病A（hemophilia A，HA）又稱血友病甲，是由于凝血因子Ⅷ（F8）缺乏或功能缺陷引起的一種隱性遺傳性出血性疾病，一般女性為攜帶者但不發(fā)病，男性發(fā)病，患者可出現(xiàn)反復(fù)的關(guān)節(jié)出血，重者腦出血，目前尚無根治方法，近年來的基因治療給HA突變基因的修復(fù)帶來了曙光。Park等[41]用HA患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs，然后用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對iPSCs來源的F8進(jìn)行校正，校正后的iPSCs可產(chǎn)生表達(dá)F8基因的內(nèi)皮細(xì)胞，然后把校正后的成熟內(nèi)皮細(xì)胞移植到F8缺失的血友病小鼠體內(nèi)，移植內(nèi)皮細(xì)胞的小鼠能正常產(chǎn)生F8凝血因子，出血癥狀得到控制，HA總體上得到控制和緩解。血友病B（hemophilia B，HB）是由于凝血因子Ⅸ（F9）缺乏或血漿凝血活酶成分缺乏而引起的一種遺傳病。血友病模型是基因治療的理想模型，很多研究者采用導(dǎo)入外源基因的方法治療基因疾病。Huai等[42]利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的原位基因組編輯技術(shù)構(gòu)建HB小鼠模型，從小鼠尾靜脈注入Cas9/sgRNA，檢測到62.5%的HB小鼠中F9突變基因得到糾正，這對凝血功能不全具有有效的緩解作用。Cas9以蛋白質(zhì)形式、sgRNA以RNA的3種不同形式發(fā)揮作用，將這3種形式的Cas9顯微注入血友病小鼠生殖細(xì)胞，研究基因校正的效率和安全性，可知Cas9蛋白具有較高的基因恢復(fù)率、胚胎毒性小，更適合生殖細(xì)胞基因治療。Guan等[43]在HB家族的F9基因中發(fā)現(xiàn)了一個新的突變位點y371d，用Cas9技術(shù)模擬y371d突變的HB小鼠模型，通過尾靜脈把Cas9/sgRNA注入y371d突變的HB小鼠，超過0.56%的突變F9基因得到糾正，極大地提高了止血效率和小鼠的存活率；與此相反，腺病毒載體系統(tǒng)具有更高的糾正效率，但由于它有嚴(yán)重的肝毒性而沒有治療效果。上述研究表明，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的原位基因組編輯可為人類遺傳性疾病提供可行的治療策略，但其臨床有效性還須進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

CRISPR-Cas9技術(shù)在基因遺傳病治療領(lǐng)域有潛在優(yōu)勢，科學(xué)界為CRISPR-Cas9基因治療從概念變?yōu)楝F(xiàn)實付出了極大的努力，但目前該技術(shù)發(fā)展還存在瓶頸，在臨床應(yīng)用上受到一定的限制。因為CRISPR-Cas9技術(shù)實現(xiàn)其特異性是由PAM前后20 bp不完全匹配序列的位點決定的，因此在理論上存在產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（off-target effects）的可能，實際應(yīng)用也印證了其脫靶概率不低的事實。另外，CRISPR-Cas9技術(shù)在不同物種間的穩(wěn)定性和重復(fù)性存在較大差異。因此，有必要對CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行深入研究和優(yōu)化，進(jìn)一步提高其臨床應(yīng)用的普遍性。但CRISPR-Cas9有其顯著的優(yōu)勢，比如構(gòu)建和設(shè)計方法簡單快捷、對基因組的點突變編輯效率高、可同時編輯多個基因。CRISPR-Cas9以其獨特的優(yōu)勢為遺傳病、傳染病、癌癥等疾病提供強(qiáng)有力的研究和治療手段。遺傳性疾病一直是威脅人類健康的難治性疾病，從遺傳疾病相關(guān)突變基因的發(fā)現(xiàn)，到小鼠模型的構(gòu)建，再到CRISPR-Cas9治療遺傳性疾病，CRISPR-Cas9在人類遺傳病基礎(chǔ)理論研究、臨床治療等領(lǐng)域具有光明前景。