分子診斷技術(shù)在心房顫動(dòng)臨床診療中的應(yīng)用

張維貞 向麗 黃山

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）簡稱房顫，是一種臨床上最常見的與年齡有關(guān)的心律失常，其患病率與年齡的增長呈正相關(guān)，60歲以下的人群患病率約為1%，75至84歲人群的患病率增加至12%，而超過80歲的老年人中，大約有1/3都患有AF［1］，AF 在我國的患病率為 0.77%［2］。AF 的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，其遺傳性、臨床表現(xiàn)及預(yù)后表現(xiàn)出多樣性，引起的并發(fā)癥嚴(yán)重威脅患者生命［3］，給臨床診斷和治療帶來一定的難度，因此，分子生物學(xué)技術(shù)在AF的診斷、治療中的意義也越來越明顯。本文就分子診斷技術(shù)在心房顫動(dòng)中臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 AF與電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)

心房電重構(gòu)是指快速的心房搏動(dòng)引起一系列心房肌電生理特性，心房有效不應(yīng)期縮短和心房肌動(dòng)作電位時(shí)程均顯著縮短，在AF的維持和發(fā)展中起重要的作用。研究表明，心房肌細(xì)胞離子通道的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變所致各種跨膜離子流的變化是心房電重構(gòu)的基礎(chǔ)［4］。AF時(shí)心房收縮頻率增加，反復(fù)刺激可導(dǎo)致心房電重構(gòu)，心房肌細(xì)胞鈣離子超載，鈣通道失活以及離子通道蛋白減少，L型鈣通道下調(diào)，鈣離子內(nèi)流減少，并上調(diào)內(nèi)向整流鉀通道和乙酰膽堿依賴鉀通道，超極化增加外向鉀電流，導(dǎo)致心房有效不應(yīng)期縮短，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，離散度增加，易于心房快速刺激與折返形成，起到促進(jìn)房顫的作用。

AF除了會(huì)引起心肌電重構(gòu)外，還可導(dǎo)致患者的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。研究者發(fā)現(xiàn)，AF患者經(jīng)治療后轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律，其紊亂的心肌電重構(gòu)可能會(huì)恢復(fù)，但心房組織結(jié)構(gòu)卻存在持續(xù)的變化，進(jìn)而再次誘導(dǎo)AF，這表明AF誘發(fā)的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)能增加患者心臟對AF的易感性以及持續(xù)性［5］。間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要原因，其特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞增加，心肌細(xì)胞外間質(zhì)膠原過度沉積，心房纖維化會(huì)破壞心肌電傳導(dǎo)的連續(xù)性，引起局部傳導(dǎo)障礙，促進(jìn)折返形成和局部激動(dòng)的觸發(fā)，有利于形成更多的多發(fā)子波，易于AF的形成和維持。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（rein angiotensin aldosterone，RAAS）以及轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）參與心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)［6］。血管緊張素Ⅱ（angio?tensin II，AngⅡ）是RAAS中主要的活性物質(zhì)，也是介導(dǎo)心肌纖維化左室重構(gòu)的重要因素，研究表明，血管緊張素Ⅱ可通過多種途徑參與心肌纖維化［7］。此外，還有報(bào)道使用RAAS抑制劑在一定程度上可抑制心房肌纖維化，延緩AF的發(fā)生［8］，從另一角度表明RAAS對心房纖維化的作用。

TGF?β1是由心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌的，能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的重要促纖維化因子［9］。研究者對過度表達(dá)TGF?β1的山羊模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，纖維化加重，同時(shí)AF的易感性增加，提示TGF?β1參與AF心房纖維化的過程［10］。

AF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。AF的發(fā)展是受多種機(jī)制協(xié)同作用的，心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)是引起房顫發(fā)生和維持的重要原因，今后還需進(jìn)一步從深層次去研究房顫發(fā)生、發(fā)展以及維持的關(guān)鍵因素。

2 分子診斷技術(shù)在AF診斷中的臨床應(yīng)用

分子診斷技術(shù)是以人體生物大分子物質(zhì)為研究對象，應(yīng)用相應(yīng)的分子生物學(xué)技術(shù)和方法來研究結(jié)構(gòu)或表達(dá)上調(diào)控的變化，為臨床疾病的預(yù)測、診斷與治療提供相應(yīng)的依據(jù)［11］，廣泛應(yīng)用于單基因疾病、多基因疾病、腫瘤及感染性疾病等領(lǐng)域的分子診斷。AF是一種受環(huán)境和多種基因共同作用的疾病，限制了疾病基因的研究［12］，很難確定其遺傳標(biāo)記。因此，單核苷酸多態(tài)性（single nucleo?tide polymorphism，SNP）檢測、DNA甲基化檢測、miRNA檢測及蛋白質(zhì)組學(xué)分析等診斷方法可用于AF相關(guān)基因的檢測，以及有關(guān)復(fù)雜疾病機(jī)制研究。近年來，隨著高通量分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，其在AF的病變基因篩查、診斷中發(fā)揮了巨大的作用。

2.1 基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測

單核苷酸多態(tài)性是指DNA序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生變異，是人類最常見的遺傳變異之一。由于其具有標(biāo)記數(shù)量眾多、分布廣及遺傳穩(wěn)定性好等特征，因此，比較人群中個(gè)體的遺傳多樣性、分析基因多態(tài)性、研究群體中的藥物基因組學(xué)有重要意義。

腎素是由腎近端球狀細(xì)胞分泌的蛋白水解酶，當(dāng)腎血流量減少或血漿Na+含量下降時(shí)引起腎素分泌的增加。腎素可將來源于肝臟的血管緊張素原轉(zhuǎn)換為血管緊張素 I（angiotensin I，Ang I），然后血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting en?zyme，ACE）催化Ang I使其轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，刺激腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞釋放醛固酮，血管緊張素Ⅱ可引起心房傳導(dǎo)異質(zhì)性，縮短心房有效不應(yīng)期，為AF的發(fā)生提供了電生理基礎(chǔ)。研究證實(shí)，系統(tǒng)和局部RAAS激活導(dǎo)致的心房重構(gòu)是AF發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵［13?15］。研究發(fā)現(xiàn)，AGT?M235T 多態(tài)性與AF有關(guān)［16］。Hou等［17］以82例 AF患者和82例正常對照組為研究對象，應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（restriction fragment length poly?morphic polymerase chain reaction，RFLP?PCR）技術(shù)進(jìn)行分析并得出AF與M235T相關(guān)的結(jié)論，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AGT?M235T呈現(xiàn)多態(tài)性，AGT?M235T基因的T等位基因增加了AF的風(fēng)險(xiǎn)。梁晶等［18］在對中國漢族人群進(jìn)行基因位點(diǎn)和單倍型分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)AGT基因的rs11568023和rs2478523位點(diǎn)與非家族性AF相關(guān)。還可以由NCBI Genbank上獲得的AGT、TGF?β1等相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的基因序列，依據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性上下游引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后經(jīng)測序檢測，將測序結(jié)果與NCBI Gen?bank中公布的基因SNP位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序列比對，DNASTAR軟件觀察測序峰型，得出相應(yīng)的結(jié)論，探討基因SNP位點(diǎn)與AF的相關(guān)性。目前關(guān)于SNP位點(diǎn)檢測技術(shù)包括全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome?wide association study，GWAS）、TaqMan探針技術(shù)、RFLP?PCR以及焦磷酸測序等［19］。隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到SNP與AF的易感性有著很大的相關(guān)性，這些SNP位點(diǎn)為進(jìn)一步闡明AF的分子機(jī)制提供了更多有價(jià)值的線索，為臨床發(fā)現(xiàn)AF的致病基因和AF的相關(guān)診斷提供了新的思路。

2.2 DNA甲基化檢測

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶?磷酸?鳥嘌呤二核苷酸（cytosine phosphate?guanosine，CpG）中的胞嘧啶與甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，是最常見的表觀遺傳學(xué)修飾之一。DNA甲基化轉(zhuǎn)錄過程中穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和下游生物過程的重要表觀遺傳機(jī)制［20］。研究證明，DNA甲基化與房顫的發(fā)生有一定的關(guān)系［21］。最近的研究檢查了一個(gè)中等大型社區(qū)成人中DNA甲基化與AF的關(guān)聯(lián)，并確定了與AF相關(guān)的多個(gè)甲基化特征，得出DNA甲基化的變化與 AF 相關(guān)的結(jié)論［20］。隨后 ZHAO 等［22］采用全基因組CpG的高濃度甲基化微陣列技術(shù)，比較永久性AF患者左心房與正常竇性心律（sinus rhythm，SR）者組織標(biāo)本DNA甲基化，綜合分析全基因組甲基化和mRNA表達(dá)譜。研究中發(fā)現(xiàn)AF患者中的420個(gè)上調(diào)基因和567個(gè)下調(diào)基因，相對于正常SR患者，12個(gè)基因低甲基化，8個(gè)基因高甲基化。同時(shí)為了確定DNA甲基化對基因表達(dá)的影響，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative?polymerase chain reaction，RT?qPCR）分析了其中1個(gè)高甲基化基因homeo?box A3和3個(gè)低甲基化基因C3orf59、RUNX1和鈣調(diào)磷酸酶1調(diào)節(jié)物的表達(dá)水平，結(jié)果表明DNA甲基化介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)可能在AF發(fā)病機(jī)制中起重要作用。目前DNA甲基化可通過直接測序法、亞硫酸氫鹽處理法、基因芯片技術(shù)以及高效液相色譜法等多種方法進(jìn)行檢測。基因表達(dá)異常的DNA甲基化參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，鈉通道和鉀通道離子流的改變，纖維化的激活和脂質(zhì)代謝的降低，在AF的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，為臨床尋找新的治療方案提供參考意見，以便更好地治療AF。

2.3 miRNA檢測

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的小的非編碼RNA，參與生理和病理下基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明miRNA是一種潛在的新型生物標(biāo)志物，是基因表達(dá)的有力調(diào)節(jié)者，它們不僅在心血管系統(tǒng)的生理和正常發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，而且還可用于心血管疾病的診斷和治療［23?24］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，心臟中存在不同miRNA表達(dá)，參與調(diào)節(jié)AF相關(guān)的心房重構(gòu)機(jī)制［25?26］，有助于 AF 的發(fā)生和維持，基于 miRNA 靶點(diǎn)對AF進(jìn)行干預(yù)，在AF的診斷和治療中具有一定的指導(dǎo)意義。最近一項(xiàng)關(guān)于人類右心房組織和綿羊左心房組織的研究中［27］，miR?208b 在慢性心房勯動(dòng)患者中上調(diào)，而 miR?1、miR?499和 miR?133a則下調(diào)。MiR?208b上調(diào)可導(dǎo)致心肌肌球蛋白基因激活和肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶2（SERCA2）下調(diào)，表明miR?208b參與調(diào)節(jié)心房肌細(xì)胞中的Ca2+穩(wěn)態(tài)和電重構(gòu)［28］，提示這些miRNA可用于研究AF發(fā)生和發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制。

研究表明，miRNA是AF電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控分子［29］。心肌電重構(gòu)是AF發(fā)生和維持的電生理學(xué)基礎(chǔ)，其基本機(jī)制是心房肌細(xì)胞中的跨膜離子通道發(fā)生功能及表達(dá)上的變化，動(dòng)態(tài)平衡被破壞。研究者［30］用乳鼠心房肌細(xì)胞體外模擬AF模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real?time PCR，qPCR）、TaqMan探針法對AF組心房肌細(xì)胞相關(guān)miRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對照組進(jìn)行比較，AF組其電重構(gòu)機(jī)制相關(guān)miRNAs存在表達(dá)差異，其中miR?101a、miR?101b、miR?26a和miR?26b 低表達(dá)，而 miR?21、miR?328、miR?499高表達(dá)，發(fā)現(xiàn) AF 與 miRNA相關(guān)。

心房纖維化是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要原因，其將導(dǎo)致心房電活動(dòng)的破壞，形成多子波折返，導(dǎo)致AF的發(fā)生。miR?21在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)增加，抑制miR?21表達(dá)時(shí)可減輕小鼠心臟纖維化，改善其心臟功能，主要是通過靶向作用于SPRY1（sprouty homologue 1）間接抑制蛋白激酶?絲裂原活化蛋白激酶活性。miR?21在AF患者左心房中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致SPRY1表達(dá)降低，結(jié)締組織生長因子表達(dá)增加，Rac1?GTPase和膠原含量增加［31］。在大鼠的缺血性心力衰竭模型中，左心房直接注射抑制劑抑制miR?21導(dǎo)致SPRY1上調(diào)，纖維化減輕，同時(shí)AF持續(xù)時(shí)間縮短，表明miR?21參與AF的結(jié)構(gòu)重構(gòu)［32］。另外，Cao 等［33］研究發(fā)現(xiàn) miR?21通過CADM1/STAT3途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和心臟纖維化，提示miR?21是心臟纖維化重塑和AF的重要信號分子，且miR?21、CADM1和STAT3可能成為纖維化的治療靶點(diǎn)。

miRNAs功能異常與AF發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過抑制或過表達(dá)miRNAs調(diào)控其下游靶點(diǎn)，可改善AF發(fā)生時(shí)的心房病理性重構(gòu)，達(dá)到治療效果。另外，血漿中檢測miRNA，可作為房顫的臨床診斷標(biāo)志物之一，但目前還處于臨床研究階段。miR?NA在AF的診斷和治療中有著巨大的潛力，所以檢測miRNA為AF的發(fā)生預(yù)測、發(fā)展、發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)及評估患者預(yù)后情況等方面提供新的研究方向與應(yīng)用前景。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是后基因組學(xué)時(shí)代的一門新興學(xué)科，是一種應(yīng)用多種技術(shù)方法，在整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析和處理，研究蛋白質(zhì)組表達(dá)功能的技術(shù)方法。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因時(shí)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)及主要內(nèi)容，因其具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)而備受世界各國研究者的關(guān)注，逐漸應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域和疾病分子機(jī)制的研究。

AF的發(fā)生和維持是由多種信號通路之間共同作用的。在質(zhì)譜基礎(chǔ)上發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)已成為廣泛應(yīng)用的分析工具，使得人們更全面更系統(tǒng)地了解關(guān)于AF具體的發(fā)生機(jī)制［34］。目前，對AF的蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容包括：①運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)，定量分析凝膠中相應(yīng)的蛋白質(zhì)，為分析AF提供有價(jià)值的蛋白質(zhì)指標(biāo)。LAI等［35］首次采用雙向凝膠電泳技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)豬右心房快速起搏6周后心室肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈?2V（myosin light chain?2V，MLC?2V）表達(dá)上調(diào)。同樣，研究者［36］應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（matrix assisted laser desorption ionization?mass spectrometry，MAL?DI?MS）對持續(xù)性AF患者的右心耳進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，與竇性心律者相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17種差異表達(dá)蛋白，成功鑒定了涉及心房重構(gòu)過程中的特定蛋白。②運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)芯片尋找新的預(yù)測AF風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，探索AF潛在的新的生物標(biāo)志物。Lind等［37］基于鄰近延伸測定（proximity extension assay，PEA）技術(shù)開發(fā)了一種定制蛋白質(zhì)組學(xué)芯片，該技術(shù)能夠同時(shí)測定92種蛋白質(zhì)。每種蛋白質(zhì)通過一對互補(bǔ)的抗體進(jìn)行評估，在這個(gè)過程中部分互補(bǔ)的寡核苷酸被連接在一起。通過2種抗體將靶蛋白與寡核苷酸連接，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測。因此，Lind在2個(gè)獨(dú)立的社區(qū)隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)腦自然肽N端前體蛋白（N terminal?precursor protein of brain natural pep?tide，NT?ProBNP）和成纖維細(xì)胞生長因子 23（Fi?broblast growth factor 23，F(xiàn)GF?23）與 AF 強(qiáng)烈相關(guān)，并且在隨后基于隊(duì)列研究的薈萃分析中，還發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素?6（Interleukin?6，IL?6），脂肪酸結(jié)合蛋白 4（fatty acid?binding protein 4，F(xiàn)ABP4）和生長分化因子 15（Growth differentiation factor?15，GDF?15）在AF的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。

采用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)對AF進(jìn)行研究，有助于從分子水平了解AF病理生理學(xué)機(jī)制，以開發(fā)新的藥物，發(fā)現(xiàn)更安全、更有效的AF治療方法，并篩選出與房顫診斷、治療及評估預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。當(dāng)前對于AF的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作還處于初級階段，發(fā)展還未成熟，仍有許多待解決的問題，如缺乏大規(guī)模的前瞻性隊(duì)列研究等。

3 分子技術(shù)在AF治療中的臨床應(yīng)用

目前臨床上AF的治療方法主要是用抗心律失常藥物或射頻消融術(shù)來恢復(fù)竇性心律和控制心室率，但效果并不是很理想，副作用大且容易復(fù)發(fā)，為了提高生活質(zhì)量，減少AF相關(guān)癥狀，需要研究發(fā)現(xiàn)更為行之有效的方法來治療AF?；蛑委熓鞘褂煤怂嵝蛄衼聿倏v靶細(xì)胞或組織中的基因表達(dá)，達(dá)到特定治療效果。因此，從基因水平上阻斷AF發(fā)生與維持的機(jī)制，達(dá)到根治及預(yù)防AF的目的，是臨床上非常重視的問題。

近年來，心房顫動(dòng)的基因?qū)W研究已證實(shí)了基因在房顫發(fā)病、心房重構(gòu)及房顫維持中的重要作用。目前AF治療所涉及的基因包括Caspase 3基因、縫隙連接蛋白基因（Cx40、Cx43）、SERCA2a基因等。心房注射、電穿孔方法和心房涂敷技術(shù)應(yīng)用的研究證實(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)加入Cx40和Cx43可有效地改善AF的發(fā)生，表明基因治療AF的可行性［38?39］?，F(xiàn)在基因治療中應(yīng)用最廣泛的基因載體是腺病毒載體［40］，研究表明，注射和心房肌電穿孔傳遞腺病毒載體Ad?siRNA?Cas3，其編碼caspase 3基因敲除的siRNA，減少細(xì)胞凋亡，抑制或延遲持續(xù)性 AF 的發(fā)生［41］。此外，Kuken 等［42］的研究發(fā)現(xiàn)，SERCA2a轉(zhuǎn)基因治療使SERCA2a蛋白的表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝取鈣離子進(jìn)一步增加，從而提高心肌收縮力。由于基因治療載體可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，且目前只研究于動(dòng)物體內(nèi)，因此現(xiàn)階段大多數(shù)基因治療仍處于發(fā)展過程的早期階段，有待進(jìn)一步的探索研究。

4 展望

AF是一種多基因調(diào)控的疾病，由于受環(huán)境、基因等因素共同影響，使得其具體的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今仍未明確，臨床上AF治療后容易復(fù)發(fā)，同樣也給臨床治療帶來一定的難度。近年來，隨著越來越多的遺傳因子被發(fā)現(xiàn)與AF的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸在AF的診療中發(fā)揮著作用。國內(nèi)有關(guān)AF相關(guān)聯(lián)基因的研究尚處于起步階段，AF的臨床檢測主要還是以心電圖或其他影像學(xué)方法檢測為主，基本上未涉及分子生物學(xué)技術(shù)，這使AF在個(gè)性化診斷和個(gè)體化治療方面都受到了極大的限制。因此，在今后的基礎(chǔ)及臨床研究中，將分子診斷技術(shù)應(yīng)用于AF的診斷和治療，加快推廣分子技術(shù)在房顫診療中的臨床應(yīng)用，將對我國AF的診斷、治療、預(yù)后甚至預(yù)測方面都有著非常重要的意義。