PCR熒光探針?lè)ㄔ赮染色體微缺失檢測(cè)中的應(yīng)用

陳晴晴 李少英 冼嘉嘉 王燕超 黎青

不孕不育是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，不育占所有不孕不育病例的一半［1］。遺傳因素導(dǎo)致的精子畸形是導(dǎo)致男性不育的主要原因［2］。Tiepolo 等［3］發(fā)現(xiàn)無(wú)精子患者有Y染色體長(zhǎng)臂缺失，推測(cè)Y染色體q臂上有“精子生成因子”。精子發(fā)生是由許多Y染色體特定基因調(diào)控的重要生殖過(guò)程，這些基因大多位于人類Y染色體長(zhǎng)臂的一個(gè)特定區(qū)域，被稱為無(wú)精子癥因子（azoospermia factor，AZF）區(qū)域，AZF區(qū)域有很多與精子生成相關(guān)的關(guān)鍵基因位點(diǎn)，其微缺失與男性不育有關(guān)。1992年Vogt等［4］發(fā)現(xiàn)AZF上存在a、b、c區(qū)，由于Y染色體上有Y染色體性別決定區(qū)（sex?determining region of Y?chromosome，SRY）基因，有Y染色體微缺失的患者可以將微缺失基因傳遞給下一代男性。陳暖等［5］研究認(rèn)為Y染色體微缺失的基因檢測(cè)對(duì)明確男性不育患者的病因和選擇治療方案具有非常重要的意義。這類缺失可以采用多重聚合酶鏈反應(yīng)電泳法、探針檢測(cè)法、基因芯片檢測(cè)法或毛細(xì)管電泳檢測(cè)法等方法進(jìn)行檢測(cè)［6］。目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用方法為多重聚合酶鏈反應(yīng)電泳法，但是該方法操作較為繁瑣且不能批量檢測(cè)。本研究通過(guò)對(duì)比聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熒光探針?lè)ê投嘀鼐酆厦告湻磻?yīng)（multiplex poly?merase chain reaction，multiplex PCR）結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法，比較2種檢測(cè)方法的檢測(cè)率和吻合度，探討PCR熒光探針?lè)z測(cè)Y染色體微缺失在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2016年6月至2017年6月到我院就診的208例不育男性患者，年齡23～46歲，平均年齡32.8歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organiza?tion，WHO）2010年第5版精液分析操作指南將208例患者分為正常精子癥組、無(wú)精子癥組和少精子癥組。用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法對(duì)208例不育患者的Y染色體無(wú)精子癥因子進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 抽提DNA

208例不育患者各采集5 mL外周血并進(jìn)行抗凝處理。采用 DNeasy?Blood&Tissue試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）提取基因組DNA。

1.2.2 PCR熒光探針?lè)?/p>

PCR熒光探針?lè)ú捎猛妇吧萍脊煞萦邢薰镜腨染色體微缺失檢測(cè)試劑盒。分為A反應(yīng)液和B反應(yīng)液。A反應(yīng)液檢測(cè)的位點(diǎn)是SRY、SY84、SY127和SY225，B反應(yīng)液檢測(cè)的位點(diǎn)是ZFX/ZFY、SY86、SY134和SY254。主要包括3個(gè)步驟：核酸提取、PCR試劑配制和PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件如下：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。信號(hào)收集：在第三階段60°C時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號(hào)，并保存相關(guān)文件。PCR實(shí)驗(yàn)儀器為ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems?，美國(guó)）。檢測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的AZF區(qū)域見(jiàn)表1。

表1 PCR熒光探針?lè)z測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的AZF區(qū)域Table 1 Detection sites of PCR fluorescent probe and corresponding AZF areas

1.2.3 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法

采用的是Promega的Y染色體微缺失檢測(cè)方法。對(duì)Y染色體的短DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)5個(gè)平行PCR擴(kuò)增檢測(cè)Y染色體的20個(gè)序列標(biāo)簽。PCR 擴(kuò)增條件如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min、57℃ 30 s，72℃ 1 min，37個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。檢測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的AZF區(qū)域見(jiàn)表2。

表2 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的AZF區(qū)域Table 2 Detection sites of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis and corresponding AZF areas

2 結(jié)果

2.1 用PCR熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果

無(wú)精子癥組47例，檢出微缺失1例；少精子癥組61例，檢出微缺失1例；正常精子癥組未檢出缺失型（圖1，圖2，圖3）。

圖1 無(wú)精子癥組中1例PCR熒光探針?lè)@示AZFabc缺失Figure 1 A case of AZFabc deficiency was detected by PCR fluorescence probe in azoospermia group

2.2 用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法

無(wú)精子癥組47例，檢出微缺失1例；少精子癥組61例，檢出微缺失1例；正常精子癥組未檢出缺失型（圖4）。其中應(yīng)用PCR熒光探針?lè)ê蚼ulti?plex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法檢測(cè)出的微缺失來(lái)自于相同的病人。

3 討論

孫華賓等［7］分析了不育男性無(wú)精子因子基因檢測(cè)結(jié)果，認(rèn)為AZF區(qū)域微缺失是引起男性無(wú)精、少精子癥的重要原因之一，對(duì)原發(fā)無(wú)精、少精子癥患者在單精子注射（intracytoplasmic sperm injec?tion，ICSI）之前進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)。陳云等［8］在研究廈門地區(qū)男性無(wú)精子癥患者Y染色體微缺失情況中發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥患者AZF微缺失發(fā)生率約為10%，丑廣程等［9］在研究Y染色體微缺失及臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥患者AZF微缺失發(fā)生率接近10%。在此次研究中無(wú)精子癥檢測(cè)率低于10%，原因可能是在納入無(wú)精子癥組的時(shí)候，沒(méi)有做精液分析項(xiàng)目檢測(cè)的不育患者沒(méi)有納入此次統(tǒng)計(jì)研究。在研究的過(guò)程中，有2例不育患者PCR熒光探針?lè)z測(cè)為SY127/SY134及SY255/SY254位點(diǎn)缺失，1例為SY84/SY86位點(diǎn)缺失，由于這3例沒(méi)有相應(yīng)的精液分析結(jié)果無(wú)法分組所以沒(méi)有納入此次研究。

圖2 少精子癥組1例PCR熒光探針?lè)@示AZFc缺失Figure 2 A case of AZFc deficiency was demonstrated by PCR fluorescence probe in oligospermia group

圖3 正常精子癥組1例PCR熒光探針?lè)@示未缺失型Figure 3 A case of normal spermatozoa showed no missing type by PCR fluorescence probe

圖4 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法結(jié)果Figure 4 Results of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis

multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法在臨床上已應(yīng)用多年，近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)也開(kāi)始應(yīng)用于臨床。段晉燕等［10］研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在男性不育患者Y染色體微缺失檢查中的應(yīng)用，得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可用于Y染色體微缺失的檢測(cè)，且對(duì)篩查不育癥患者具有臨床價(jià)值的結(jié)論，張媛媛等［11］研究利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF?PCR）篩查男性不育患者Y染色體微缺失，認(rèn)為多重QF?PCR技術(shù)，一個(gè)反應(yīng)即能檢測(cè)樣本的多個(gè)位點(diǎn)，并可提示性染色體是否存在異常，有助于男性不育患者盡早明確病因，也為后續(xù)的檢查和治療提供依據(jù)。2013年發(fā)布的關(guān)于Y染色體微缺失指南中提出了6個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tan?dem repeat，STR）位點(diǎn)［12］。本研究中PCR熒光探針?lè)▽?duì)SY86等6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)缺失位點(diǎn)為multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法檢測(cè)AZF區(qū)域的20個(gè)位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示應(yīng)用PCR熒光探針?lè)z測(cè)208例不育患者，無(wú)精子癥組中1例是AZFabc缺失，少精子癥組中1例是AZFc缺失，其他未檢測(cè)到缺失，用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥組中同一病例AZFabc缺失，少精子癥組中同一病例是AZFc缺失，2種檢測(cè)方法結(jié)果一致。崔瑾等［13］研究發(fā)現(xiàn)PCR熒光探針?lè)z測(cè)Y染色體微缺失結(jié)果與multi?plex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)結(jié)果相同，且該法的檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷相符，因此PCR熒光探針?lè)ㄟm用于Y染色體微缺失的臨床實(shí)驗(yàn)室篩查。楊洋等［14］研究PCR熒光探針?lè)z測(cè)少精子癥和無(wú)精子癥患者認(rèn)為PCR熒光探針?lè)ㄔ赮染色體微缺失檢測(cè)中穩(wěn)定快捷，結(jié)果可靠。

王健等［15］研究認(rèn)為多重?zé)晒釶CR方法操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高且重復(fù)性好，在Y染色體微缺失檢測(cè)上有重要應(yīng)用價(jià)值，實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間和費(fèi)用明顯少于multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法，而且PCR熒光探針?lè)梢曰九懦行圆挥颊遈染色體常見(jiàn)的微缺失，可作為臨床篩查男性不育患者的推薦方法，若PCR熒光探針?lè)z測(cè)有異常，可進(jìn)一步用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法檢測(cè)確認(rèn)。由于PCR熒光探針?lè)z測(cè)項(xiàng)目在本院開(kāi)展時(shí)間不久，本研究納入病例有限，還未能充分認(rèn)識(shí)其與傳統(tǒng)檢測(cè)手段之間的優(yōu)勢(shì)，后期我們將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量以及多診斷中心合作，進(jìn)一步研究PCR熒光探針檢測(cè)法在臨床上對(duì)AZF缺失區(qū)域的檢出率及應(yīng)用價(jià)值。