長期遞增負荷運動對大鼠胸腺上皮和胸腺激素表達的影響

任超學(xué) 郝選明 金艷平

長期從事大強度運動訓(xùn)練會引起運動性免疫抑制，對免疫功能產(chǎn)生強烈的負性影響［1］，在運動免疫抑制發(fā)生發(fā)展的過程中，作為T細胞發(fā)育成熟的中樞免疫器官，胸腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯的負性變化，使得T細胞的發(fā)育過程受阻，T 細胞凋亡增加［1?2］。免疫學(xué)研究業(yè)已證實，T 細胞在胸腺發(fā)育成熟過程中，不僅受細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的影響，而且受胸腺激素的直接調(diào)節(jié)［3］。胸腺激素是由胸腺被膜下上皮細胞分泌的，以旁分泌的方式影響著T細胞在胸腺發(fā)育的整個階段，能連續(xù)誘導(dǎo)胸腺細胞發(fā)育為成熟的T細胞，并進一步分化為不同功能的亞群。目前，有關(guān)長期運動訓(xùn)練對胸腺上皮細胞結(jié)構(gòu)和胸腺激素分泌方面的實驗研究報道少見。鑒于此，本實驗研究采用6周遞增負荷運動訓(xùn)練，觀察大鼠在運動性免疫抑制發(fā)生和發(fā)展過程中胸腺激素分泌的變化，同時通過觀察分泌胸腺激素的胸腺上皮細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化，以探索胸腺激素分泌變化的原因，為探討運動性免疫抑制發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

在通過動物實驗倫理審查后，實驗選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 SD雄性大鼠（sprague dawley，SD）42只（8周齡，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：NO.44005900001124）。實驗動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，飼養(yǎng)房溫度為（22±3）℃，濕度為60%左右。飼料為國家標準顆粒型固體大鼠飼料（廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供），飲用水為雙蒸水。動物飼養(yǎng)房、訓(xùn)練房、動物跑臺、籠具和飲水瓶定期紫外線消毒。

實驗大鼠隨機分為對照組和運動組（第0周時因大鼠未作任何干預(yù)故運動組和對照組共用1組6只大鼠，第2、4、6周運動組和對照組每組每周6只，合計36只大鼠，故該實驗共計用大鼠42只），對照組不施加任何運動干預(yù)，主要用于觀察生長發(fā)育過程對測試指標的影響；而運動組按照運動方案完成6周遞增負荷運動。

1.2 運動方案

本實驗采用本課題組沿用多年的遞增負荷大鼠運動模型，運動訓(xùn)練大鼠活動方式為跑臺運動，坡度為0，訓(xùn)練共6周，每周訓(xùn)練6天，每天訓(xùn)練30 min。運動強度為逐周遞增負荷模式，第1周起始負荷為10 m/min（適應(yīng)性訓(xùn)練），第2周增為20 m/min，隨后各周負荷強度增量為5 m/min，至第6周達到40 m/min，接近大鼠極限負荷強度。

1.3 測試指標及測試方法

胸腺上皮細胞結(jié)構(gòu)采用免疫組織化學(xué)染色法（strept avidin?biontin complex，SABC），Motic光學(xué)顯微鏡400倍鏡下觀察；胸腺素α1和胸腺生成素Ⅱ用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosor?bent assay，ELISA）測定。

1.4 實驗儀器與試劑

1.4.1 主要實驗儀器

全自動組織脫水機（型號：TP1020E）、石蠟包埋機（型號：EG1150）、石蠟輪轉(zhuǎn)切片機（型號：RM2135）、攤片機（型號：HI1210）均購于德國萊卡公司；Motic光學(xué)顯微鏡（型號：Motic B5）、彩色數(shù)碼CCD攝像頭（型號：Moticam 1300）購于加拿大麥克奧迪公司；酶標儀（型號：BIO?RAD550）、大鼠活動跑臺購于廣州飛迪生物科技有限公司。

1.4.2 主要實驗試劑

大鼠胸腺素α1和胸腺生成素Ⅱ酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；羊抗兔二抗試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蘇木素、二甲苯、PBS、不同濃度的脫水用乙醇、多聚甲醛、鹽酸、石蠟、中性樹膠等購于廣州市潔利生物醫(yī)學(xué)有限公司。

1.5 采樣時間和動物組織取材

1.5.1 采樣時間

分別于訓(xùn)練前（第0周），訓(xùn)練第2周末、第4周末和第6周末采樣，每組每次6只。具體采樣時間為當周最后一次訓(xùn)練結(jié)束后48 h，使機體得到比較充分的恢復(fù)，避免測試結(jié)果受上次運動負荷的影響。

1.5.2 動物胸腺取材

實驗取材當天，實驗大鼠按照每100 g體重腹腔注射0.4 mL 10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后取出大鼠胸腺。取出胸腺分離剔除結(jié)締組織和脂肪，稱濕重，然后沿縱軸將胸腺兩葉分開，一葉胸腺組織加入適量生理鹽水搗碎，反復(fù)凍融2次后，5 000g離心5 min取上清，按一次用量10 mL分裝2管，凍存于-80℃冰箱，分別用于測大鼠胸腺素α1和胸腺生成素Ⅱ；另一葉置于4%的多聚甲醛磷酸緩沖液中24 h，用于免疫組化分析，觀察胸腺上皮細胞的形態(tài)變化。

1.6 圖像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

1.6.1 圖像處理

用顯微鏡觀察組織切片，在400倍鏡下每張切片隨機選取5個具有代表性的視野，視野不相互重疊，用數(shù)字圖像采集系統(tǒng)采集圖像，用Imagepro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析計算每張圖片的陽性產(chǎn)物積分光密度（integrated optical density，IOD）及其陽性面積（area），用公式Density=IOD/Area計算該張圖片上陽性產(chǎn)物的平均光密度，然后求5個視野平均光密度的均值，即為該樣本陽性產(chǎn)物的平均光密度值。

1.6.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差表示，用SPSS 17.0進行統(tǒng)計處理；組內(nèi)前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性用皮爾遜相關(guān)分析，以P＜0.05作為差異顯著性水平。

表1 2組大鼠胸腺指數(shù)變化情況Table 1 Changes of thymus index of the 2 groups

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸腺形態(tài)的變化

2組大鼠胸腺指數(shù)各周變化情況見表1，隨著年齡的增加，對照組正常發(fā)育大鼠的胸腺指數(shù)會逐漸下降，與第0周相比，至第6周末有極顯著下降（P＜0.01）；但運動組大鼠胸腺指數(shù)下降的速率更甚，同周2組組間比較，第2周末、第4周末和第6周末運動組均顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2 大鼠胸腺中胸腺素α1的變化

由表2可見，對照組隨著年齡的增加，大鼠胸腺組織中胸腺素α1含量呈先升高再降低的趨勢，但各周之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；運動組大鼠胸腺素α1的含量也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，與第0周相比，第2周末、第4周末胸腺組織中胸腺素α1的含量略有升高，但無顯著性差異（P＞0.05），但至第6周末，胸腺素α1的含量明顯降低（P＜0.05），不僅明顯低于自身第0周值（P＜0.05），而且明顯低于對照組第6周末值（P＜0.05）。

2.3 大鼠胸腺中胸腺生成素Ⅱ的變化

由表3可見，對照組大鼠胸腺生成素Ⅱ含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但各周之間無顯著性差異（P＞0.05）；運動組大鼠胸腺生成素Ⅱ的含量總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，至第6周末，胸腺生成素Ⅱ的含量突然明顯降低，不僅明顯低于自身第0周值（P＜0.05），而且明顯低于對照組第6周末值（P＜0.05），胸腺生成素Ⅱ的含量呈現(xiàn)出前4周保持平穩(wěn)而隨后出現(xiàn)突降的趨勢。在6周遞增負荷運動過程中，2組大鼠胸腺生成素Ⅱ的變化（表3）與胸腺素α1的變化（表2）表現(xiàn)出相似的變化趨勢，相關(guān)程度高（r=0.86）。

表2 2組大鼠胸腺組織胸腺素α1的表達量（pg/mL）Table 2 The content of thymosin α1 in the 2 group（pg/mL）

表3 2組大鼠胸腺生成素Ⅱ的表達量（pg/mL）Table 3 The content of thymopoietinⅡ in the 2 group（pg/mL）

圖1 對照組大鼠胸腺上皮細胞層形態(tài)與結(jié)構(gòu)（SABC，×400）Figure 1 The structure of thymic epithelial cell changes in control group（SABC，×400）

2.4 大鼠胸腺被膜下上皮細胞層形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化

對照組大鼠6周遞增負荷運動過程中胸腺被膜下上皮層細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化情況參見圖1。由圖1A（第0周）可見，大鼠胸腺被膜下上皮細胞層非常完整，上皮細胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰。經(jīng)過正常發(fā)育生長6周后（圖1B，第6周末），胸腺上皮細胞層結(jié)構(gòu)和細胞排列未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

圖2A為大鼠執(zhí)行運動方案前（第0周）胸腺上皮層形態(tài)結(jié)構(gòu)，圖2B為完成6周遞增強度負荷運動后的變化。由B圖可見，大鼠胸腺上皮細胞層形態(tài)的完整性遭到嚴重破壞，細胞層發(fā)生嚴重的斷裂或缺失現(xiàn)象，上皮細胞排列松散，細胞間隙增寬，胸腺上皮細胞的結(jié)構(gòu)明顯不完整。

3 討論

胸腺的主要作用是產(chǎn)生大量的T淋巴細胞，分泌各種胸腺激素和胸腺因子，發(fā)揮細胞免疫的作用［4］。筆者研究團隊前期探索了影響T細胞發(fā)育成熟、增殖分化的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)隨著訓(xùn)練進程的進展，調(diào)控T細胞發(fā)育的正性調(diào)節(jié)因子白細胞介素?7（interleukin?7，IL?7）和轉(zhuǎn)錄因子?1（transcription factor?1，TCF?1）逐步降低，負性調(diào)節(jié)因子及轉(zhuǎn)化生長因子?β1（transforming growth fac?tor beta 1，TGF?β1）則逐步升高，兩者綜合作用的結(jié)果，使得T細胞的整個發(fā)育全程（包括胸腺雙陰選擇階段、雙陽選擇階段和最后的單陽選擇階段）均受到顯著影響［5］，從而導(dǎo)致免疫功能下降。胸腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化對于機體的免疫功能至關(guān)重要。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，胸腺隨著機體年齡的增長在一定程度上會發(fā)生增齡性萎縮，而長期大強度運動訓(xùn)練會加劇胸腺萎縮速度［6?9］，本研究結(jié)果與以上學(xué)者研究結(jié)果一致（如表1所示）。長期遞增負荷運動作為對機體的強烈刺激，對胸腺形態(tài)產(chǎn)生非常顯著的負性影響。功能的變化源于結(jié)構(gòu)的變化，隨運動時間的延長，胸腺萎縮加劇，提示胸腺細胞發(fā)育過程受阻，胸腺細胞凋亡增加，從而導(dǎo)致T細胞所介導(dǎo)的細胞免疫功能降低，以及機體細胞免疫和體液免疫兩者協(xié)調(diào)關(guān)系的失衡。

圖2 運動組大鼠胸腺上皮細胞層形態(tài)與結(jié)構(gòu)（SABC，×400）Figure 2 The structure of thymic epithelial cell changes in exercise group（SABC，×400）

胸腺素α1是一種具有免疫活性的多肽類物質(zhì)，主要存在于胸腺上皮細胞、外周血、精液和羊水等中，能降低CD4+CD8+雙陽性胸腺細胞的凋亡，改變胸腺細胞亞群的比值，增加CD4+CD8+雙陽性胸腺細胞的數(shù)量，提高機體的免疫力［10?11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，長期遞增負荷運動對大鼠胸腺組織中胸腺素α1含量會產(chǎn)生嚴重的負性影響，而自然生長對胸腺素α1含量并未造成明顯改變，這可能是由于前4周運動強度較小，對大鼠胸腺發(fā)育的影響不大，結(jié)合胸腺上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)光鏡圖（圖1、圖2）發(fā)現(xiàn)，運動前期大鼠胸腺上皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整，但隨著運動負荷持續(xù)加重，至第6周末可見大鼠胸腺上皮結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，胸腺皮質(zhì)厚度變薄，T淋巴細胞排列疏松，皮髓質(zhì)界限不復(fù)存在，上皮細胞有明顯破壞。運動組胸腺結(jié)構(gòu)的破壞情況也與他人實驗結(jié)果相符［8?9］。有研究發(fā)現(xiàn)，在長期遞增負荷過程中，外源性補充胸腺素α1能夠有效對抗胸腺組織的萎縮程度［9］。胸腺素α1是由胸腺上皮細胞產(chǎn)生的，胸腺上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞應(yīng)該是胸腺素α1在6周遞增負荷后明顯降低的主要原因。

胸腺生成素是由胸腺被膜下上皮細胞分泌的一種胸腺激素，誘導(dǎo)前胸腺細胞分化成胸腺細胞，進而分化發(fā)育為成熟的T淋巴細胞，胸腺生成素對成熟T淋巴細胞有強烈的免疫調(diào)節(jié)作用，并在神經(jīng)肌肉接頭信息的傳遞中起重要作用。Goldstein從胸腺生成素中分離出了胸腺生成素Ⅱ，具有雙向調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，不僅能抑制過強的免疫反應(yīng)，而且能使受到抑制的免疫反應(yīng)趨向正常［12?14］。本文實驗發(fā)現(xiàn)，在 6 周遞增負荷運動影響下，運動組胸腺生成素Ⅱ的分泌變化與胸腺形態(tài)顯著萎縮的變化趨勢一致，提示胸腺激素分泌的減少與胸腺結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞有關(guān)，而胸腺激素所具有的調(diào)節(jié)胸腺細胞發(fā)育、拮抗胸腺細胞凋亡等功能因分泌量減少會出現(xiàn)弱化，進而又會反過來加速胸腺的萎縮速率。兩者存在著這種互為因果的特殊關(guān)系，構(gòu)成了運動對免疫功能或者促進、或者抑制這兩種迥然不同的影響。

大量研究顯示，經(jīng)常進行適中強度的運動鍛煉能夠改善免疫器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，從而提升機體免疫功能［1，15?16］。但長期從事超負荷類型的大強度運動訓(xùn)練則對兩者有強烈的負性影響［18?19］。本實驗也證實，在長期遞增負荷前期，因負荷較小對兩者的負性影響不大，機體可通過動員、激活或補償機制尚可維持胸腺的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。但隨著訓(xùn)練進行到負荷后期（第6周末），因負荷強度過大，機體難于恢復(fù)，兩者之間的平衡關(guān)系被徹底打破，從而導(dǎo)致胸腺形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)進行性破壞，同時胸腺細胞功能呈現(xiàn)漸進性降低。