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    CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

    2018-03-30 05:01:16俞珺瑤杜華平
    生物技術(shù)通訊 2018年3期
    關(guān)鍵詞:外源結(jié)構(gòu)域核酸

    俞珺瑤,杜華平

    浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 血液科,浙江 杭州 310016

    CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated pro?teins,CRISPR/Cas)系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在生物進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng),用來對抗入侵的噬菌體及其他外源質(zhì)粒核酸(包括DNA和RNA)。CRISPR-Cas系統(tǒng)先將外源核酸片段整合到CRISPR回文重復(fù)序列中,當(dāng)外源核酸再次入侵時(shí),細(xì)胞表達(dá)的CRISPRRNA(crRNA)引導(dǎo)Cas核酸內(nèi)切酶迅速切割外源核酸,從而起到免疫防御的作用[1-3]。該過程主要包括以下幾個(gè)步驟[4-5]:①CRISPR間隔區(qū)的獲得:將外源核酸序列整合到CRISPR基因組5′端2個(gè)重復(fù)序列之間得到間隔區(qū)(interspacer),對應(yīng)的外源核酸序列稱為protospacer;②CRIPSR基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工):以間隔區(qū)核酸序列為模板轉(zhuǎn)錄的前體crRNA(pre-RNA)在Cas蛋白和tracrRNA幫助下剪切成小的RNA,即成熟的crRNA;③CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源入侵核酸的切割:成熟的crRNA與具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白(如Cas9、Cas12、Cas13等)形成核酸核蛋白復(fù)合物,crRNA能與外源核酸的protospacer互補(bǔ)配對,引導(dǎo)Cas蛋白在特定位置對外源核酸進(jìn)行切割。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為ClassⅠ和Ⅱ兩大類,每個(gè)大類又分為不同型(type)和亞型(sub?type)。ClassⅠ CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中較多見,但因成分相對復(fù)雜不適合作為工具使用而較少被研究[6]。ClassⅡ CRISPR-Cas系統(tǒng)(包括typeⅡ、typeⅤ、typeⅥ等)雖然少見,但其識別和切割外源核酸的靶序列只需一種Cas蛋白,因此被改造成基因編輯工具而受到越來越多的關(guān)注[7-8]。CRISPR-Cas系統(tǒng)又可根據(jù)功能分為靶向DNA和RNA等2種。以下對各種類型的CRISPRCas系統(tǒng)做具體闡述。

    1 靶向結(jié)合DNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

    1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

    發(fā)現(xiàn)于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)屬于ClassⅡtypeⅡ CRISPR-Cas系統(tǒng),其組成包括crRNA、tracrRNA和Cas9,由于成分簡單,最早被用于基因編輯的工具而被廣泛研究。研究者將tracrRNA和crRNA連接形成一個(gè)guideRNA(gRNA),使得CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步簡化為只有g(shù)RNA和Cas9這2種組分的系統(tǒng)。gRNA利用一段約20個(gè)核苷酸的RNA序列通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶DNA結(jié)合,Cas9在gRNA的引導(dǎo)下在靶DNA的特定位置對其進(jìn)行切割。同時(shí)發(fā)現(xiàn),外源 DNA5′-PAM(protospaceradjacentmotifs)結(jié)構(gòu)的存在對Cas9作用的發(fā)揮是必要的[9-10]。

    CRISPR-Cas系統(tǒng)對基因組特定的DNA片段進(jìn)行切割,形成DNA雙鏈切口(double-strand breaks,DSBs)。在真核細(xì)胞內(nèi),對DSBs的修復(fù)機(jī)制有2種:非同源末端連接(non-homologous endjoining,NHEJ)和同源重組(homologous recombina?tion,HR)。NHEJ是不依賴于模板的切口修復(fù),通過對斷端的單純連接來實(shí)現(xiàn),會導(dǎo)致核苷酸插入與缺失[11]。HR以同源DNA為模板,通過同源重組的方式修復(fù)DSBs,這種修復(fù)方式更精確。通過設(shè)計(jì)同源DNA模板,可以人為地將外源DNA片段插入基因組特定位點(diǎn)中[12-13]。

    Cas9有2個(gè)發(fā)揮切割作用的結(jié)構(gòu)域——HNH和RuvC,分別切割靶序列的非互補(bǔ)鏈和互補(bǔ)鏈。有研究報(bào)道[14],突變RuvC或HNH可以產(chǎn)生切口酶,切口酶只有單鏈切割活性,可以降低Cas9的脫靶效應(yīng)。另外,同時(shí)突變HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域,可以得到?jīng)]有切割活性的dCas9[7]。dCas9保留了特異性結(jié)合DNA的功能,可以通過聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,如轉(zhuǎn)錄抑制因子(KRAB、Mxi1等)[15-16]或轉(zhuǎn)錄激活因子(VP64、p65等)[17-18]來調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄過程。

    1.2 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)

    Cas12a(之前被命名為Cpf1)是CRISPR-Cas ClassⅡtypeⅤ-A系統(tǒng)的一種核酸內(nèi)切酶。與Cas9不同,Cas12a對DNA的切割不需要tracrRNA的協(xié)助[19],同時(shí)它參與前體crRNA的成熟過程[20]。因此,CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對DNA進(jìn)行靶向切割只需要crRNA和Cas12a這2種組分。

    RuvC和Nuc是Cas12a蛋白對DNA進(jìn)行切割的2個(gè)結(jié)構(gòu)域[21-22]。與Cas9的RuvC結(jié)構(gòu)域不同,Cas12aRuvC直接切割DNA雙鏈,Nuc在這個(gè)過程中起輔助作用[22-23]。因此,Cas12a蛋白RuvC結(jié)構(gòu)域的突變直接導(dǎo)致其DNA切割作用的喪失。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對靶DNA的切割依賴于對非互補(bǔ)鏈上富含T的PAM序列的識別[19,24],Cas12a蛋白在遠(yuǎn)離PAM端對DNA雙鏈進(jìn)行切割[19,25]。

    與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相比,CRISPR-Cas12a更適于編輯富含AT的DNA序列,因其切割作用的發(fā)揮依賴于富含T的PAM的存在。同時(shí),Cas12a蛋白切割DNA雙鏈形成互補(bǔ)的粘性末端,能增加同源重組修復(fù)的幾率,從而提高外源基因?qū)胄蔥19]。在特異性方面,也有研究報(bào)道,Cas12a的脫靶效應(yīng)比Cas9更低[26-27],這些優(yōu)勢讓CRISPRCas12a系統(tǒng)有望成為比Cas9更適于靶向基因編輯的工具。

    2 靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

    2.1 CRISPR-RCas9

    2014 年,O′Connell等[28]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)可以對ssRNA進(jìn)行切割。我們知道,SpCas9識別和切割DNA作用的發(fā)揮依賴于非互補(bǔ)配對鏈上5′-NGG-3′PAM的存在。O′Connell等通過外源提供一段含有PAM序列的ssDNA寡聚核苷酸鏈(稱為PAMmers),這段序列能與靶ssRNA互補(bǔ)配對,SpCas9就能在crRNA的協(xié)同作用下識別PAM結(jié)構(gòu),在靶ssRNA的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割。

    RCas9系統(tǒng)對靶RNA的切割需要SpCas9、gRNA和PAMmer這3種組分。如何有效地將3種組分轉(zhuǎn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用,是該系統(tǒng)實(shí)際應(yīng)用的難題之一。其次,PAMmer是一段寡聚核苷酸單鏈,在細(xì)胞內(nèi)容易被RNaseH降解[28-29]。另外,該系統(tǒng)也會對含有PAM結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核DNA進(jìn)行攻擊,造成基因突變。這些缺點(diǎn)限制了RCas9在科學(xué)研究中的使用。

    2.2 CRISPR-FnCas9

    CRISPR-FnCas9是CRISPR-CastypeⅡ的一種亞型。FnCas9的作用方式與SpCas9相似,在crRNA和tracrRNA的協(xié)同作用下,通過識別5′-NGG-3′PAM結(jié)構(gòu)對dsDNA進(jìn)行切割[30]。但與CRISPR-SpCas9不同的是,CRISPR-FnCas9中存在一種被稱為 scaRNA(smallCRISPR/Casassociat?edRNA)的小RNA,能與tracrRNA形成雜合雙鏈RNA,scaRNA:tracrRNA雜合雙鏈引導(dǎo)FnCas9對真核細(xì)胞中的病毒RNA進(jìn)行切割[31]。CRISPR-Fn?Cas9對靶RNA的識別不依賴PAM結(jié)構(gòu)[32]。Price等[32]對CRISPR-FnCas9系統(tǒng)進(jìn)行改造,將tracrRNA和scaRNA整合形成rgRNA(RNA-targetingguide RNA),利用FnCas9:rgRNA復(fù)合物對人肝癌細(xì)胞中的丙肝病毒(HCV)基因進(jìn)行失活,檢測結(jié)果顯示病毒蛋白的表達(dá)下降約60%。然而,F(xiàn)nCas9靶向切割RNA的機(jī)制并不清楚[30],Price等發(fā)現(xiàn)Fn?Cas9對HCV的表達(dá)抑制似乎是通過抑制病毒本身的復(fù)制和翻譯過程實(shí)現(xiàn)的,而不是直接降解病毒RNA。另外和CRISPR-RCas9一樣,CRISPRFnCas9同樣可以對細(xì)胞核的DNA發(fā)生作用,這種脫靶效應(yīng)的存在限制了它的使用。

    2.3 CRISPR-Cas13a

    CRISPR-Cas13a系統(tǒng)屬于CRISPR-CasClassⅡ typeⅥ-A,最早由Abudayyeh等在纖毛菌Lepto?trichiashahii中發(fā)現(xiàn)[33]。Abudayyeh 等[33]發(fā)現(xiàn)L.sha?hiiCas13a(LshCas13a)蛋白能在一段含28個(gè)核苷酸的特異性RNA序列的協(xié)同作用下,幫助大腸桿菌抵御噬菌體MS2(一種ssRNA病毒)的入侵。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)在Cas13a的切割過程中存在其他旁系ssRNA的非特異性切割,這種作用機(jī)制可能與病毒入侵過程中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞程序性死亡有關(guān)。之后該系統(tǒng)的作用機(jī)制逐漸被闡明。該系統(tǒng)主要包括crRNA和Cas13a(之前被命名為C2c2)蛋白2種組分。成熟的crRNA由含有28個(gè)核苷酸的靶RNA結(jié)合序列和骨架結(jié)構(gòu)組成。Cas13a蛋白是具有雙重作用的RNA酶[34],不僅參與crRNA的成熟過程,同時(shí)能特異性地對靶RNA進(jìn)行切割。Cas13a切割活性的發(fā)揮主要依賴2個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域,對HEPN結(jié)構(gòu)域的組氨酸和精氨酸殘基進(jìn)行突變可造成Cas13a的失活,形成dCas13a。dCas13a保留ssRNA的結(jié)合能力,但不能對其進(jìn)行切割。同時(shí),Liu等發(fā)現(xiàn)靶RNA3′端的Non-GPSF(protospacerflankingsite)結(jié)構(gòu)的存在對crRNA和Cas13a作用的發(fā)揮至關(guān)重要[35]。

    2017年,Abudayyeh等[36]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)纖毛菌L.wadei來源的Cas13a(LwaCas13a)蛋白的切割活性和特異性比包括之前發(fā)現(xiàn)的LshCas13a在內(nèi)的其他Cas13a蛋白都高,并且第一次利用多個(gè)crRNA在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對ssRNA的多位點(diǎn)打靶,另外并沒有觀察到因Cas13a的非特異性切割而造成真核細(xì)胞的死亡。CRISPR-Cas13a系統(tǒng)展現(xiàn)出與RNA干擾相同的作用效果,但較后者有更高的特異性,同時(shí)該系統(tǒng)組分簡單,易于作為RNA編輯工具使用,目前已越來越受到研究者的關(guān)注。

    2.4 CRISPR-Cas13b

    Cas13b是屬于CRISPR-CasClassⅡ typeⅥ-B的Cas蛋白。Smargon等[37]研究發(fā)現(xiàn),Cas13b的作用機(jī)制基本與Cas13a相同,例如靶向切割ssRNA而不能切割dsRNA,參與前體RNA的成熟過程,存在對旁系ssRNA的非特異性切割等。但與Cas13a不同的是,Cas13b發(fā)揮作用需要靶RNA的兩端均存在PFS結(jié)構(gòu),增加了該系統(tǒng)對ssRNA打靶的限制。Smargon等[37]同時(shí)也發(fā)現(xiàn)2種小的功能蛋白Csx27和Csx28,Csx27能抑制Cas13b對靶RNA序列的識別和切割作用,而Csx28則正好相反,能加強(qiáng)Cas13b的這種作用。

    3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用及潛在應(yīng)用價(jià)值

    3.1 靶向結(jié)合DNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

    3.1.1 尋找新的功能基因或致病基因 已有研究者[38-39]利用多個(gè)gRNA組成的gRNAlibrary聯(lián)合Cas9對不同基因中編碼外顯子的序列進(jìn)行打靶,造成相應(yīng)基因表達(dá)蛋白功能的喪失,再經(jīng)后續(xù)的陰性和陽性篩選過程,幫助找到影響細(xì)胞正常功能或?qū)е录膊〉年P(guān)鍵基因。雖然用傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)全基因組功能基因篩選,但CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性更高,適用范圍更廣。

    3.1.2 構(gòu)建疾病動物/細(xì)胞模型 將Cas9和gRNA注入實(shí)驗(yàn)動物的受精卵中修飾特定的基因,獲得可以遺傳的基因型,從而得到轉(zhuǎn)基因動物模型。這種方法的優(yōu)勢在于明顯縮短了建模時(shí)間,編輯特異性高,適用于大規(guī)模操作等。已有利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立靈長類動物模型來研究神經(jīng)精神疾病的研究[40]。目前,該方法建立動物模型最大的挑戰(zhàn)在于存在遺傳學(xué)嵌合現(xiàn)象(genetic mosaicism),產(chǎn)生該現(xiàn)象部分受到CRISPR-Ca9s系統(tǒng)基因打靶效率的影響。

    也有研究[41]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)中插入2種與產(chǎn)生阿爾茲海默癥β淀粉樣蛋白有關(guān)的遺傳突變,隨后誘導(dǎo)這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細(xì)胞并產(chǎn)生大量β淀粉樣蛋白,從而模擬阿爾茲海默癥的疾病表現(xiàn)。

    3.1.3 用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控 dCas9可以通過直接與DNA作用元件結(jié)合,或聯(lián)合轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子,來調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄過程,但目前認(rèn)為dCas9的這種調(diào)節(jié)作用相對較弱。有研究[18,42-43]利用多個(gè)gRNA引導(dǎo)攜有不同轉(zhuǎn)錄因子的dCas9結(jié)合同一個(gè)DNA作用元件(如轉(zhuǎn)錄啟動子),不同轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)揮協(xié)同作用,從而大大增強(qiáng)了dCas9對轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)效應(yīng)。

    3.1.4 用于活細(xì)胞的基因/蛋白顯像 帶有熒光蛋白標(biāo)簽的dCas9能結(jié)合特定的DNA序列,通過熒光蛋白顯示活細(xì)胞內(nèi)某個(gè)基因的空間位置。傳統(tǒng)用于標(biāo)記DNA的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)需要固定細(xì)胞,無法用于活細(xì)胞的基因追蹤。CRISPR-dCas9系統(tǒng)這種顯像的功能不僅可以用于檢測某種特定基因,還可用于研究基因組中各功能和結(jié)構(gòu)元件之間的空間位置關(guān)系。

    Yasuda等[44]利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)同源重組修復(fù)對內(nèi)源性蛋白進(jìn)行單細(xì)胞標(biāo)記(single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair,SLENDR)精確標(biāo)記發(fā)育大腦中的內(nèi)源性蛋白。更實(shí)際的一項(xiàng)研究[45]利用CRISPR-Cas9輔助的基于紙片的診斷模塊來檢測血液、尿液或唾液樣品的寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)

    3.1.5 在基因治療上的潛在應(yīng)用 CRISPR-Cas9能在特定位點(diǎn)切割DNA形成DSB,再通過NHEJ或HR方式引起異?;蚴Щ罴罢;蛑亟ǎ瑥亩迯?fù)特定的基因功能,為人類遺傳性疾病提供了新的治療手段。近年,利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)治療鐮刀形貧血[46]、杜氏肌營養(yǎng)不良癥[47]等遺傳性疾病及清除受感染細(xì)胞中的人免疫缺陷病毒(HIV)治療艾滋病[48-49]的研究取得了較大進(jìn)展。

    3.2 靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

    CRISPR-RCas9、CRISPR-FnCas9、CRISPRCas13系統(tǒng)均能靶向作用于ssRNA,被認(rèn)為是對mRNA轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行調(diào)控的重要工具,mRNA轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控相較于DNA基因組水平的調(diào)控更加靈活、直接。自2014年O′Connell等發(fā)現(xiàn)RCas9可以靶向切割ssRNA以來,研究者就開始關(guān)注靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)在mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA顯像、mRNA定向定位、RNA病毒干擾等方面的潛在應(yīng)用價(jià)值,并做了初步探索。而最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas13系統(tǒng),由于其組分簡單、特異性高、作用機(jī)制相對明確等優(yōu)點(diǎn),成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。以下以CRISPR-Cas13系統(tǒng)為例做進(jìn)一步闡述。

    3.2.1 利用CRISPR-Cas13系統(tǒng)對RNA的直接切割作用 Cas13可以通過直接切割特定mRNA來下調(diào)基因的表達(dá),與傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)相比,其適用范圍更廣。crRNA可以設(shè)計(jì)成gRNA庫,同時(shí)針對mRNA的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行打靶,實(shí)現(xiàn)對多個(gè)基因表達(dá)的下調(diào)。另外,先前有研究[50]將一段RNA剪切結(jié)構(gòu)域和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Pumilio/fem-3整合成一個(gè)人工RNA核酸內(nèi)切酶,利用該酶對細(xì)菌和人的多種RNA實(shí)現(xiàn)表達(dá)沉默。Cas13的出現(xiàn)使上述過程的實(shí)現(xiàn)變得更加容易,可以用于沉默人體細(xì)胞中致病mRNA的表達(dá)[51]。

    3.2.2 利用CRISPR-dCas13系統(tǒng)對RNA的特異性識別作用 通過對dCas13的切割結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變,可以得到?jīng)]有切割活性的dCas13蛋白。dCas13保留了特異性結(jié)合ssRNA的功能,可以作為一種gRNA引導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的編輯。

    ①轉(zhuǎn)錄后水平的mRNA編輯 利用dCas13能靶向結(jié)合但不能切割RNA的這一特性,聯(lián)合GFP等熒光顯示蛋白,可以用于顯示細(xì)胞內(nèi)mRNA的活動軌跡。2016年Nelles等[29]最先利用沒有切割活性的RCas9-GFP、sgRNA和PAMmer追蹤ACTB mRNA從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中的過程,同時(shí)通過FISH觀察到ACTB、CCNA2和TFRC等3種mRNA的聚集現(xiàn)象。同樣我們可將dCas13蛋白與GFP等熒光顯示蛋白結(jié)合,用于顯示特定mRNA在細(xì)胞內(nèi)的位置及轉(zhuǎn)移軌跡,從而監(jiān)測細(xì)胞在不同環(huán)境狀態(tài)(如應(yīng)激、損傷、疾病及藥物干預(yù)等)下mRNA轉(zhuǎn)錄組的行為學(xué)變化。更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值在于利用dCas9的這種追蹤定位功能來富集某些表面標(biāo)志不明確的成體干細(xì)胞,利用這些成體干細(xì)胞表達(dá)某種特定的mRNA,通過CRISPRCas13系統(tǒng)進(jìn)行顯示來達(dá)到分離純化這些細(xì)胞的目的[52]。

    其次,CRISPR-dCas13系統(tǒng)可以在轉(zhuǎn)錄后水平增強(qiáng)或抑制基因的表達(dá)。通過與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯的增強(qiáng)子或沉默子結(jié)合,dCas13可以在沒有改變mRNA數(shù)量的情況下增強(qiáng)或抑制某個(gè)特定基因的蛋白表達(dá),這種調(diào)控基因表達(dá)的方式不會對基因組本身造成影響。

    另外,dCas13可以幫助mRNA定位到細(xì)胞的特定位置從而發(fā)揮其功能。例如,在神經(jīng)元細(xì)胞中維持突觸結(jié)構(gòu)和活性的PSD-95(postsynaptic densityprotein95)蛋白,其mRNA需要通過樹突到達(dá)特定作用部位后再翻譯成PSD-95蛋白[53],發(fā)揮相應(yīng)的功能。dCas13可以通過與轉(zhuǎn)運(yùn)因子結(jié)合幫助mRNA運(yùn)輸?shù)教囟ú课唬缤挥|前或突觸后末端,從而維持突觸的生長和功能,這對神經(jīng)元損傷后再生修復(fù)有重要意義[52]。

    ②pre-mRNA水平的編輯 dCas13可以引導(dǎo)剪接因子至pre-mRNA的特定位置,從而調(diào)控mRNA的剪接過程。之前有研究[54-55]利用RNA結(jié)合蛋白(如PUF、MS2等)聯(lián)合剪接增強(qiáng)因子(如富含精氨酸/絲氨酸的結(jié)構(gòu)域)或剪接抑制因子(如富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域)來改變特定mRNA的剪接模式。Cas13能使靶向pre-mRNA的過程更容易實(shí)現(xiàn),并且能對多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行操作,可用于干預(yù)mRNA的異常剪接過程,從而逆轉(zhuǎn)因mRNA的異常剪接而導(dǎo)致的細(xì)胞功能異常等后果。

    另外,dCas13可用于REPAIR的編輯過程,REPAIR的全稱為RNA Editing for Programmable adenosine-to-inosine(A-to-I) Replacement。已有研究[56]利用dCas13b-ADARDD實(shí)現(xiàn)了這一編輯過程。其意義在于,許多疾病如局灶性癲癇、杜氏肌營養(yǎng)不良癥及帕金森病等都與G-to-A的基因突變有關(guān),REPAIR過程可以在mRNA水平逆轉(zhuǎn)A突變,從而達(dá)到治療疾病的目的。

    3.2.3 對RNA病毒的干擾 發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌體內(nèi)的CRISPR-Cas13系統(tǒng)不僅能直接對侵入細(xì)菌的噬菌體RNA進(jìn)行切割,同時(shí)能激活細(xì)菌的免疫系統(tǒng)來抵御外來的噬菌體RNA[33]。利用CRISPRCas13系統(tǒng)的這一特性,可以干擾RNA病毒在真核細(xì)胞中的表達(dá)。早前也有研究[32]利用FnCas9來抑制真核細(xì)胞中人HCV的表達(dá)。相較于Fn?Cas9,Cas13的作用機(jī)制更加明確,不僅可以直接或通過細(xì)胞自身的免疫系統(tǒng)抑制RNA病毒的活性,而且可以用于干擾需要轉(zhuǎn)錄成RNA發(fā)揮作用的DNA病毒。

    3.2.4 腫瘤等疾病的治療 目前腫瘤的治療注重于靶向殺傷腫瘤細(xì)胞而不對正常細(xì)胞造成影響。理論上,CRISPR-Cas13系統(tǒng)能特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的mRNA,能夠直接影響某一特定mRNA功能的發(fā)揮,同時(shí)可以激活細(xì)胞程序性死亡過程,直接殺死腫瘤細(xì)胞[57-58]。目前尚須進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證和完善這一推論,但Cas13用于腫瘤靶向治療的前景不容忽視。

    4 結(jié)語

    參考文獻(xiàn)

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