阿薩希毛孢子菌通過分泌鐵載體在低鐵限制性條件下生長

孫偉 鄧娟 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院臨檢中心，北京 100050)

毛孢子菌病 (Trichosporosis)是由毛孢子菌感染引起的一種局部或系統(tǒng)播散性真菌病[1]。近年來，毛孢子菌病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為除念珠菌外致人類播散性感染的第2大酵母樣真菌感染[2]，這與各種原因造成的免疫功能低下患者增多有關，其中，阿薩希毛孢子菌 (Trichosporonasahii,T.asahii)是引起人類毛孢子菌病的最常見、最重要的致病菌[3]。

鐵參與眾多的生物代謝過程，是生命體必須的營養(yǎng)元素，其存在著還原型Fe2+和氧化型Fe3+兩種可以可逆變化的化合態(tài)。鐵載體是微生物在低鐵的限制性條件的條件下誘導合成的低分子量化合物，對Fe3+有特異的高親和力。絕大多數微生物都可以合成鐵載體，其與微生物的毒力有關，因為從宿主體內吸收鐵是病原菌生存與感染的必要步驟。

目前，鐵離子的利用、鐵載體的合成和轉運，及其在與宿主相互作用中的相應機制研究主要集中于細菌和部分真菌 (白念珠菌、釀酒酵母菌和煙曲霉等)[4-7]。國內外尚未見關于阿薩希毛孢子菌的鐵離子利用情況的報道。本研究主要探討阿薩希毛孢子菌在鐵限制條件下如何利用鐵離子。

1 材料與方法

1.1 菌株

阿薩希毛孢子菌臨床分離株，分離自尿路感染患者，已經過VITEK 2 COMPACT2和MALDI-TOF MS質譜儀鑒定至種，阿薩希毛孢子菌標準株CBS2479，所有菌株使用之前均于-80℃凍存。

1.2 主要試劑與儀器

絡天青 (CAS)、溴化十六碳烷基三甲銨 (HTDMA)、去鐵胺、BCS、FeCl3、無水哌嗪均購自Sigma公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD)培養(yǎng)基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)、沙氏培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板均購自Oxfoid公司；無菌培養(yǎng)皿及96孔板 (Costar)；酶標儀 (TECAN，Infinite200)；VITEK2 COMPACT及MALDI-TOF MS質譜儀 (法國生物梅里埃公司)。

1.3 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性培養(yǎng)基中生長曲線的繪制

低鐵限制性培養(yǎng)基的配制 將200 μmol/L的去鐵胺加入預先配制的YPD培養(yǎng)基中，并加入500 μmol/L的BCS去除YPD培養(yǎng)基中的銅離子。

菌株的準備 將-80℃凍存的阿薩希毛孢子菌轉種至新鮮配制的YPD培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)。

生長曲線的繪制 參照預實驗中阿薩希毛孢子菌CBS2479的實驗條件，將復蘇后的阿薩希毛孢子菌菌體用含有 (或不含有)200 μmol/L去鐵胺的YPD培養(yǎng)基分別制備成600 nm處吸光度值為0.1的菌懸液，記為YPD+去鐵胺組 (實驗組)和YPD組 (生長對照組)，35℃，水平搖床 (100 r/min)振搖培養(yǎng)。每隔1 h分別從實驗組和生長對照組取1 mL菌液并測定二者600 nm處的吸光度值，記錄OD 600 nm數值。以時間 (h)為橫坐標，以OD 600 nm為縱坐標，分別繪制實驗組和生長對照組的生長曲線。

1.4 CAS溶液法檢測鐵載體的產生情況

CAS檢測液的配制 取10 mmol/L HDTMA (十六烷基三甲基溴化銨，109.35 mg)溶液30 mL加入到500 mL洗凈干燥的容量瓶中，加入適量去離子水稀釋；將7.5 mL Fe3+溶液 (1 mmol/L FeCl3·6H2O，含10 mmol/L HCl)與37.5 mL 2 mmol/L CAS (鉻天青，45.40 mg)溶液混合均勻，一邊震蕩一邊緩慢加入容量瓶中；稱取21.54 g無水哌嗪溶于水，小心加入31.25 mL 12MHCl (pH=5.6)，隨后一起加入容量瓶中，加去離子水至500 mL，混合均勻即得CAS檢測液，裝入干凈的聚乙烯瓶中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

CAS溶液法檢測鐵載體的原理 CAS藍色檢測液是絡天青、HTDMA和鐵離子組成的一種復合物，呈藍色。當鐵離子從CAS溶液中解離出來時，CAS溶液由藍色變?yōu)榻埸S色，根據加入適量鐵載體前后CAS溶液在630 nm處的吸光度值來確定鐵載體的濃度。CAS檢測法是一種高靈敏度的化學方法，它不依賴于鐵載體的結構，而是基于鐵載體對Fe3+的親和力。

檢測方法 本研究中通過向YPD培養(yǎng)基中加入200 μmol/L的去鐵胺制備低鐵限制培養(yǎng)基，與阿薩希毛孢子菌共培養(yǎng)，如果該菌可以分泌產生鐵載體，則可以解離后續(xù)加入的CAS溶液中的鐵離子，使CAS溶液由藍色變?yōu)辄S色，分別檢測實驗組和對照組630 nm的吸光度值來分析阿薩希毛孢子菌產生鐵載體的情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性培養(yǎng)基中的生長不受影響

生長對照組和實驗組阿薩希毛孢子菌24 h內的生長曲線如圖1所示，加入去鐵胺后5 h，阿薩希毛孢子菌的生長曲線雖略低于生長對照組，但差異沒有統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，即低鐵限制性條件并不影響阿薩希毛孢子菌的生長。

2.2 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性條件下可以產生鐵載體

實驗組與對照組阿薩希毛孢子菌分別培養(yǎng)16 h后，取各組上清100 μL進行CAS溶液法檢測。與空白對照組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基)、陰性對照組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基+T.asahii)相比，實驗組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基+T.asahii+去鐵胺)阿薩希毛孢子菌產生的鐵載體高于其他兩組，且差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，試驗重復3次，見圖2。

3 討 論

阿薩希毛孢子菌是引起人類毛孢子菌病最主要的致病菌。由于毛孢子菌對很多常規(guī)抗真菌藥物耐藥，目前該病治療困難，免疫受損患者感染后死亡率較高。有研究表明阿薩希毛孢子菌對兩性霉素B存在耐藥性，并且有研究使用棘白菌素類藥物導致播散性毛孢子菌病的病例[8-9]。我們前期的研究顯示，三唑類藥物 (尤其是伏立康唑)對阿薩希毛孢子菌有較好的療效，但在治療過程中逐漸呈現對唑類耐藥的趨勢[6-7，10-11]。因此亟需新的療法來治療反復發(fā)作的和播散性的毛孢子菌病。

圖1 低鐵限制性環(huán)境對阿薩希毛孢子菌的生長曲線無顯著影響 圖2 CAS法檢測T.asahii在鐵離子限制條件下可以產生鐵載體

Fig.1There was no significant influence of iron-restricted condition on the growth curve ofT.asahiiFig.2T.asahiicould secrete siderophore under iron-restricted condition

鐵在宿主和微生物之間的競爭中發(fā)揮著重要的作用，其參與許多代謝過程，并且與微生物的侵襲和毒力密切相關。另外，鐵在維持機體自穩(wěn)和免疫功能的發(fā)揮中起到交叉調節(jié)的作用[4-5]。鐵是參與眾多生物代謝過程的必須元素，其存在還原型和氧化型兩種可逆變化的化合態(tài)，在自然條件下主要以三價的氧化物或氫氧化物形式存在，溶解性和生物可利用度極低。微生物在低鐵的限制性環(huán)境中可以合成和利用鐵載體從環(huán)境吸收鐵，這是它們適應生長代謝的需要而發(fā)展出來的一種主要的鐵吸收機制[6]。絕大多數微生物都可以合成鐵載體，目前，關于鐵載體的研究主要集中于細菌和部分真菌 (白念珠菌、釀酒酵母菌、曲霉菌屬真菌)[7,12-14]。本研究選取臨床分離的阿薩希毛孢子菌在低鐵條件下培養(yǎng)，檢測其是否產生鐵載體，為后續(xù)相關研究提供實驗室依據。研究結果顯示，阿薩希毛孢子菌在低鐵限制條件下可以分泌鐵載體，從而保證其在低鐵環(huán)境中的生長不受影響。

由于鐵載體對鐵的螯合作用是病原微生物在鐵限制條件下攝取鐵離子的重要途徑，因此通過阻斷鐵載體的產生或阻斷鐵載體與鐵離子的結合 (比如使用鐵載體配體)可以抑制病原微生物對鐵的利用，從而達到抑制其生長和代謝的目的。這提示鐵載體途徑可能會是治療阿薩希毛孢子菌感染的新途徑，與傳統(tǒng)抗真菌藥物聯合使用可望起到事半功倍的效果[7]。因此，后續(xù)研究我們將進一步探索阿薩希毛孢子菌通過鐵載體攝取鐵離子的具體機制，為治療播散性毛孢子菌病提供新策略。

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