煙草胞質(zhì)雄性不育系與保持系內(nèi)源植物激素水平差異性研究

陳建國(guó)，王建波，胡如忠，陳釗德，楊振智，丁 丁，郭大芳，謝晉云，安開宇，朱列書，彭 妙

(1.畢節(jié)市煙草公司金沙縣分公司，貴州畢節(jié) 551800；2.貴州省煙草公司質(zhì)檢站，貴州貴陽 550081；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

植物的雄性不育現(xiàn)象通常是指產(chǎn)生的花粉沒有正常的生活力，雄性不育的表現(xiàn)形式有多種，如雄蕊的畸形或缺失，花藥無法正常開裂，無法形成花粉等。一般煙草雄性不育的表現(xiàn)形式為雄蕊的缺失。煙草雄性不育多為細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。煙草從形成雄蕊原基到形成成熟具有生活力的花粉，在此過程中要經(jīng)歷一系列的生理生化與形態(tài)特征等各個(gè)方面的變化。對(duì)于植物來說這是一個(gè)復(fù)雜的過程，在此過程中出現(xiàn)任何影響，不管是內(nèi)因或外因，植株都不能形成正常的花粉，從而導(dǎo)致雄性不育。植物雄性不育性狀是植物雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要工具，具有巨大的生產(chǎn)利用價(jià)值。煙草的胞質(zhì)不育現(xiàn)象在煙草的育種應(yīng)用方面有著重要的意義。

煙草雄性胞質(zhì)雄性不育系的形成過程，包括一系列的物質(zhì)和能量代謝，涉及各種復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，對(duì)煙草胞質(zhì)雄性不育系及其相應(yīng)保持系的生化指標(biāo)進(jìn)行比較研究，有助于了解煙草胞質(zhì)雄性不育系發(fā)生機(jī)制和有關(guān)代謝過程。物質(zhì)代謝是植物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，植株間的生理生化差異，必然反映在物質(zhì)代謝的差異上，而植物對(duì)物質(zhì)和能量的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育均要通過體內(nèi)的內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。鑒于此，筆者研究了煙草包質(zhì)雄性不育系與其保持系生長(zhǎng)期內(nèi)源植物激素含量的變化規(guī)律和激素水平差異，為更好地應(yīng)用煙草的雄性不育現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料以煙草雄性不育系及其保持系為供試材料，共設(shè)3個(gè)處理，即MSK326與K326(處理①)、MSK394與K394(處理②)、MS云煙87與云煙87(處理③)。

1.2試驗(yàn)方法采用大田試驗(yàn)，前茬作物為水稻，土壤肥力均勻，地勢(shì)平坦，有較好的灌溉條件。采用漂浮育苗的方式。株行距50 cm×120 cm種植。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，四周設(shè)保護(hù)行?；手械嗜繛橄趸姿徜@，磷肥為普鈣，鉀肥為硫酸鉀，硝酸鉀用于追肥，基肥∶追肥=60∶40，追肥分2次施用，其他田間管理同當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范。分別在苗期、團(tuán)棵期與旺長(zhǎng)后10 d、現(xiàn)蕾期和中心花開放期取樣，每個(gè)小區(qū)選取5株有代表性的高頻樣品，苗期取整株幼苗的地上部分，團(tuán)棵期與旺長(zhǎng)后10 d用直徑為1.5 cm的打孔器取煙株所有功能葉片(需煙樣20.0 g)，現(xiàn)蕾期和中心花開放期取花蕾和所有功能葉片。用超純水洗凈，濾紙吸干，立即放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3內(nèi)源激素的提取、純化、測(cè)定樣品的提取、純化和檢測(cè)參考王若仲等[1]的方法進(jìn)行。稱取20.0 g新鮮煙樣，迅速放入液氮處理2～3 min，遮光條件下將樣品進(jìn)行真空冷凍干燥。稱取凍干樣品0.50 g左右(精確至0.000 1 g)，樣品中加入預(yù)冷的提取液甲醇∶水∶乙酸(V∶V∶V=15∶4∶1)8 mL，搖勻，-20 ℃避光浸提。將過夜浸提的樣品4 ℃低溫離心20 min，取上清液。殘?jiān)屑尤? mL預(yù)冷的提取液再次提取，振蕩離心20 min，2次重復(fù)，合并上清液，再進(jìn)行真空冷凍離心，去甲醇，待溶液濃縮至3 mL，加入醋酸銨8 mL進(jìn)行復(fù)溶，4 ℃高速離心，取上清液。上清液過SEP-C18小柱，過柱前，小柱先用5 mL甲醇活化，然后用5 mL 1 mol/L乙酸平衡固相萃取柱，平衡后上樣，收集樣品中內(nèi)源激素，先后以6 mL 50%甲醇、5 mL 0.35 mol/L NH4OH的60%甲醇洗脫，合并洗脫液，真空冷凍離心濃縮至干。最后樣品用500 μL的80%甲醇復(fù)溶后高速離心待測(cè)。

測(cè)定色譜條件如下：流動(dòng)相為A(泵)0.27%三乙胺溶液，pH=3.0，B(泵)乙腈。流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，波長(zhǎng)254 nm。用Zorbax SB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱按表1梯度洗脫。5種激素按照ZRs(反玉米素核苷)、GA(赤霉素)、iPAs(N6-異戊烯腺嘌呤)、IAA(吲哚乙酸)及ABA(脫落酸)的順序出峰，設(shè)定高效液相色譜儀(Agilent 1290，美國(guó))測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm，采用紫外可見檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

表1 梯度洗脫程序

1.4數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進(jìn)行測(cè)定值和平均值的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1不同時(shí)期煙草雄性不育系與其保持系內(nèi)源激素含量變化由表2可知，苗期IAA的含量明顯低于其他時(shí)期。保持系K326葉片中IAA的含量從苗期到中心花開放期逐漸升高，而K394與云煙87則逐漸下降。各不育系材料葉片中的IAA含量變化不大。K326葉片從苗期到中心花開放期的ABA含量有較明顯的上升趨勢(shì)，但其他處理沒有明顯的上升或下降的趨勢(shì)。各處理在現(xiàn)蕾期和中心花開放期的葉片和花蕾中的ABA含量差別較大，花蕾中的ABA含量明顯高于葉片。各不育系材料葉片中ZRs含量總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，現(xiàn)蕾期葉片中ZRs含量最高。不育系與保持系苗期與團(tuán)棵期ZRs含量均較低?；ɡ僦械腪Rs含量也較低，不育系和保持系同一時(shí)期的葉與花蕾中，葉片的ZRs要明顯高于花蕾。各處理不同生育期iPAs與GA含量無明顯的規(guī)律性變化。

表2 煙草雄性不育系與保持系各時(shí)期內(nèi)源激素含量差異的比較

2.2不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期IAA含量的比值比較從表3可以看出，苗期到中心花開放期葉片中保持系IAA的含量與不育系的比值均大于1，云煙87與MS云煙87在團(tuán)棵期的IAA含量比達(dá)到2.53。各時(shí)期保持系與不育系的IAA含量比值變化差異不大。而在現(xiàn)蕾期與中心花開放期的花蕾中，保持系與不育系的IAA含量比值與其同一時(shí)期的葉片中IAA含量比值相反，保持系與不育系的IAA含量比值小于1。其中，云煙87與MS云煙87中心花開放期的花蕾中的IAA含量比值只有0.33?？梢钥闯鰺煵荼３窒蹬c其不育系從苗期到中心花開放期葉片中保持系的IAA 含量高于不育系，而在花蕾中不育系的IAA含量高于保持系。

表3 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期IAA含量的比值比較

2.3不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ABA含量的比值比較從表 4可以看出，除K394與MSK394中心花開放期葉片中ABA的值小于1外，其他材料保持系各時(shí)期部位的ABA含量與不育系的比值均大于1?，F(xiàn)蕾期的花蕾中各保持系的ABA含量均是不育系A(chǔ)BA含量的2倍以上，其中K394現(xiàn)蕾期花蕾中的ABA含量是MSK394的5.18倍。各處理進(jìn)入中心花開放期后，保持系與不育系的ABA比值縮小。煙草保持系與不育系在生長(zhǎng)過程中，葉片和花蕾中的ABA含量保持系均要高于不育系。

表4 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ABA含量的比值比較

2.4不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期iPAs含量的比值比較由表5可看出，不同處理現(xiàn)蕾期和中心花開放期的花蕾中保持系與不育系iPAs的含量比均大于1，中心花開放期的花蕾中K326與MSK326、K394與MSK394的iPAs含量比值均大于10。除少數(shù)的幾個(gè)時(shí)期外，不同處理葉片比值均小于1。在現(xiàn)蕾期與中心花開放期，煙草花蕾中的iPAs含量不育系比保持系低。

表5 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期iPAs含量的比值比較

2.5不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs含量的比值比較從表6可以看出，保持系與不育系在苗期、旺長(zhǎng)10 d、中心花開放期(葉)的ZRs比值均大于1。保持系與不育系在現(xiàn)蕾期花蕾中ZRs比值均小于1。中心花開放期的花蕾除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，其他2個(gè)處理的比值小于1，因此可以看出在煙草花蕾中不育系的ZRs含量高于保持系。

表6 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs含量的比值比較

2.6不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值比較表7表明，從苗期到中心花開放期的葉片中，3個(gè)處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值多數(shù)時(shí)期大于1，有時(shí)小于1。在現(xiàn)蕾期的花蕾中，除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，另外2個(gè)處理小于1。在中心花開放時(shí)期的花蕾中，K326與MSK326的比值小于1，其他2個(gè)處理均大于1。

表7 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值比較

2.7不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期GA含量的比值比較從表8可以看出，除K326/MSK326團(tuán)棵期與K394/MSK394中心花開放期GA含量的比值小于1外，各處理其他時(shí)期保持系與不育系葉片中GA含量的比值均大于1。K326與MSK326現(xiàn)蕾期葉片中的GA比值最高，達(dá)2.73。K326與MSK326團(tuán)棵期葉片中的GA比值最低，為0.73。花蕾中保持系與不育系GA含量的比值，K326與MSK326的比值均大于1，而K394與MSK394的比值均小于1，云煙87與MS云煙87的比值現(xiàn)蕾期小于1，而中心花開放期大于1。3個(gè)處理保持系與不育系在現(xiàn)蕾期花蕾中GA的比值，K326與MSK326的比值為1.01，其他2個(gè)處理小于1。中心花開放期的花蕾中，K394與MSK394的比值為0.95，其他2個(gè)處理大于1。

表8 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期GA含量的比值比較

3 結(jié)論與討論

采用高效液相色譜法測(cè)定了3個(gè)處理煙草不育系與保持系材料5種內(nèi)源植物激素的含量，結(jié)果表明內(nèi)源植物激素在不育系與保持系中有較大差異。

(1)保持系與不育系的IAA含量比值在各時(shí)期葉片中均大于1，而花蕾中小于1。在所測(cè)的生長(zhǎng)期中，保持系葉片中的IAA水平均高于不育系，花蕾和葉片中則相反，不育系花蕾中表現(xiàn)為IAA的積累。但一般在植株中IAA含量高的部位是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入的“庫(kù)”。大量研究表明，許多雄性不育植物種類都是由于IAA的虧缺導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入不足，花藥的發(fā)育不良，從而導(dǎo)致雄性不育。如CMS玉米[2]、水稻[3]、柑橘[4]、榨菜[5]、小麥[6]等植物都有相同的研究結(jié)果，這些植物的不育系花藥中的IAA水平明顯低于可育植株。但也有些植物的研究結(jié)果相反，如番茄雄性不育突變體sl2以及GMS和CMS油菜的不育系雄蕊中生長(zhǎng)素的含量高于相應(yīng)可育系[7-8]，這表明生長(zhǎng)素的積累也與雄性不育的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，這可能與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生有關(guān)，而乙烯是公認(rèn)的殺雄劑。但在煙草雄性不育系花蕾中，IAA的積累和育性的表現(xiàn)是否與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生有關(guān)還要作進(jìn)一步的研究。

(2)各生育期保持系和不育系的ABA含量比值在葉片和花蕾中均大于1。不育系與保持系在現(xiàn)蕾期ABA含量差別最大，現(xiàn)蕾期過后有縮小的趨勢(shì)。當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)的ABA會(huì)急劇上升，ABA的積累與抗逆性的增強(qiáng)存在顯著正相關(guān)[9]。煙草雄性不育系的ABA含量要明顯低于保持系，而相應(yīng)的煙草雄性不育系的抗逆性比保持系低。在生長(zhǎng)發(fā)育的過程遇到復(fù)雜的環(huán)境，低水平的ABA可能導(dǎo)致不育系的抗逆性差，這可能是導(dǎo)致其雄性器官發(fā)育不良的原因之一。

(3)ZRs與iPAs都屬于細(xì)胞分裂素類。細(xì)胞分裂素的主要生理效應(yīng)是促進(jìn)細(xì)胞的分裂。不同作物種類雄性的育性與細(xì)胞分裂素含量的關(guān)系不一致。如番茄[7]、榨菜[10]雄性不育株中細(xì)胞分裂素含量低于可育株；而CMS玉米[1]、辣椒[11]以及K、T型CMS小麥[6]的不育系花藥組織或者花蕾與可育系相比，卻表現(xiàn)為內(nèi)源細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的積累。該試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)顯示，在煙草不育系與保持系的生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，葉片中的ZRs含量多表現(xiàn)為保持系高于不育系，而在花蕾中則表現(xiàn)為不育系低于保持系，在煙草不育系與保持系生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，葉和花蕾的ZRs含量表現(xiàn)出不同的規(guī)律。而iPAs則與ZRs大致呈相反的變化規(guī)律。在葉片中多數(shù)時(shí)期保持系要低于不育系，而在花蕾中則反之。iPAs在不育系煙株中的積累與ZRs在煙草不育系中的虧缺，特別是在花蕾中，可能與不育系植株的不育表現(xiàn)有關(guān)。

(4)不育系與保持系的GA含量比較顯示，在生育期內(nèi)

不育系GA含量表現(xiàn)出無規(guī)律的升高或降低，3個(gè)處理多數(shù)時(shí)期不育系GA含量低于保持系，低濃度的GA可能是與煙草的雄性不育有關(guān)，具體機(jī)制可作進(jìn)一步的研究討論。

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