重癥肌無(wú)力相關(guān)抗體及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

雷國(guó)華 劉建軍 李尊波

[摘要] 重癥肌無(wú)力是抗體介導(dǎo)、累及神經(jīng)-肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病，除了常見的乙酰膽堿受體抗體及肌肉特異性酪氨酸激酶抗體外，重癥肌無(wú)力還存在其他臨床少見抗體；通過對(duì)重癥肌無(wú)力中出現(xiàn)的多種相關(guān)抗體及檢測(cè)方法分析，提高對(duì)該疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

[關(guān)鍵詞] 重癥肌無(wú)力；連接素抗體；蘭尼堿受體抗體；放射免疫法；熒光細(xì)胞染色方法

[中圖分類號(hào)] R746.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）05-0165-04

[Abstract] Myasthenia gravis is an antibody-mediated acquired autoimmune disease， which involves in neuromuscular junctions. In addition to common acetylcholine receptor antibodies and muscle-specific tyrosine kinase antibodies， there are other clinically rare antibodies of myasthenia gravis. Through the analysis of a variety of myasthenia gravis related antibodies and detection methods， further understanding of the disease is improved.

[Key words] Myasthenia gravis； Catenin antibody； Raney-base receptor antibody； Radioimmunoassay； Fluorescent cell staining

重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis，MG）主要是由乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab） 介導(dǎo)、累及神經(jīng)-肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病。全身型MG患者中約80%可檢測(cè)出AChR-Ab，僅有不足10%的MG患者肌肉特異性酪氨酸激酶抗體（muscle-specific tyrosine kinase，MuSK）陽(yáng)性[1]，但是，仍有小部分MG患者血清AChR-Ab和MuSK-Ab均呈陰性，這部分MG被稱之為血清雙陰性重癥肌無(wú)力[2]。隨著檢測(cè)方法的不斷提高，血清雙陰性MG患者中發(fā)現(xiàn)了多種MG相關(guān)抗體，現(xiàn)主要對(duì)MG臨床少見抗體及檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)，提高對(duì)該疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

1 MG相關(guān)抗體

1.1 常見抗體

20世紀(jì)70年代Lindstrom等[3]在85%MG患者的血清中檢測(cè)到AChR-Ab，從而確立了MG在B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的地位。2001年Hoch W等[4]在70%AChR-Ab陰性MG患者的血清中發(fā)現(xiàn)了MuSK-Ab。AChR-Ab主要有IgG1和IgG3亞類，其通過補(bǔ)體介導(dǎo)的突觸后膜損傷，受體胞吞以及AChR阻滯作用產(chǎn)生嚴(yán)重的AChR損失[5]，MuSK-Ab為IgG4亞類，其不激活補(bǔ)充，主要是與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4）相互作用，從而抑制蛋白依賴性的AChR聚簇[6]。LRP4 又被稱為多表皮生長(zhǎng)因子樣域7（multiple epidermal growth factor-like domains 7，MEGF7），2011年，Higuchi O等[7]首次在dSN-MG患者血清中檢測(cè)出了LRP4-Ab，LRP4-Ab屬于IgG，過去一直認(rèn)為L(zhǎng)RP4 與脂質(zhì)代謝、肢體發(fā)育等有關(guān)[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其通過抑制神經(jīng)元釋放的Agrin與胞外LRP4的結(jié)合，使得Agrin-LRP4-MuSK信號(hào)傳導(dǎo)通路破壞而致病[9]。然而，MG發(fā)病中，AChR-Ab損害突觸后膜，PsmR-Ab通過抑制突觸前膜慢K+通道，使得突觸前膜的動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，導(dǎo)致乙酰膽堿囊泡遷移及釋放改變，從而影響肌纖維興奮收縮的發(fā)生，最終導(dǎo)致信號(hào)釋放階段的障礙。

1.2 檸檬酸提取物相關(guān)抗體（CAE-Ab）和連接素抗體（Titin-Ab）

60年代初人們利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在MG患者血清中含有與骨骼肌橫紋肌切片交叉著色的一種自身抗體，其后證明了胸腺的肌樣細(xì)胞與該抗體反應(yīng)[10]。檸檬酸提取物相關(guān)抗體（citric acid extract antibody，CAE-Ab），存在于胸腺、骨胳肌及心肌。1981年，Aarli JA等[11]在胸腺瘤MG患者的血清樣品發(fā)現(xiàn)能與MG患者產(chǎn)生反應(yīng)的骨骼肌檸檬酸提取物抗原成分為Titin蛋白，該蛋白又稱連接素，是骨骼肌和心肌中除粗細(xì)肌原纖維之外的第3種結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白長(zhǎng)約1 μm，由27000個(gè)氨基酸組成。Titin蛋白特殊的排列方式可增強(qiáng)肌節(jié)的穩(wěn)定性、靜止張力。隨后，Gautel M等[12]證實(shí)Titin蛋白的主要免疫原性區(qū)域被稱為titin-30，位于A/I帶交界區(qū)，另一個(gè)免疫原性區(qū)域位于N1和N2之間。近年來(lái)，連接素抗體（titin antibody，Titin-Ab）被認(rèn)為是MGT患者血清中重要的自身抗體之一。MG與胸腺功能紊亂之間存在相互關(guān)系，約75%MG患者存在不同程度的胸腺異常[13]。CAE-Ab多見于MGT，黃載慧等[14]利用ELISA方法檢測(cè)CEA-Ab及Titin-Ab兩種抗體診斷MGT，結(jié)果顯示對(duì)于診斷同一病理類型MGT敏感性及同一種Osserman分型抗體陽(yáng)性檢出率無(wú)明顯差異。武茜等[15]研究發(fā)現(xiàn)CAE-Ab對(duì)MGT發(fā)病具有顯著相關(guān)性，前縱隔腫瘤患者術(shù)前檢測(cè)CAE-Ab結(jié)合CT檢查，可提高診斷胸腺疾病的敏感性。

1.3 二氫吡啶受體抗體（DHPR-Ab）與蘭尼堿受體抗體（RYR-Ab）

二氫吡啶受體（dihydropyridine receptor，DHPR）是細(xì)胞膜上的L型電壓門控鈣離子通道和電壓感受器，骨骼肌、心肌中含量較高。Maruta T等[16]研究了MG患者與興奮-收縮（excitation-contraction coupling，E-C）偶聯(lián)有關(guān)的自身抗體，在37%的胸腺瘤MG患者中檢測(cè)到DHPR-Ab。蘭尼堿受體（ryanodine receptor，RyR）是位于肌質(zhì)網(wǎng)中的鈣通道蛋白，因能和一種植物堿Ryanodine結(jié)合而命名，其有骨骼?。≧yR1）和心?。≧yR2）兩種形式，MG患者的RyR-Ab與兩者均可反應(yīng)。RyR是由4個(gè)同源亞基組成四聚體，是一種含有5035個(gè)氨基酸，分子量為565 kDa的蛋白質(zhì)，RyR主要在橫紋肌組織中表達(dá)，上皮組織和神經(jīng)元中也可出現(xiàn)。肌膜去極化電位通過T管到達(dá)肌質(zhì)網(wǎng)的終端池，誘導(dǎo)RyR的構(gòu)象變化，使鈣內(nèi)流，從而觸發(fā)骨骼肌細(xì)胞收縮[17]。RyR-Ab可減弱這種作用，可能是由于胸腺的部分RyR與之產(chǎn)生反應(yīng)從而使T細(xì)胞致敏，進(jìn)一步刺激B細(xì)胞產(chǎn)生RyR-Ab，骨骼肌不能有效收縮而導(dǎo)致肌無(wú)力。有研究顯示[18]骨骼肌中DHPR和RyR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為雙向的，兩者之間機(jī)械和化學(xué)的雙向偶聯(lián)機(jī)制是E-C的基礎(chǔ)。除神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)異常，MG與肌肉的興奮收縮偶聯(lián)受損相關(guān)，DHPR-Ab是伴胸腺瘤的MG的又一個(gè)新標(biāo)志，可能與肌肉的興奮收縮耦聯(lián)有關(guān)。

1.4 電壓門控性鉀通道抗體（Kv-Ab）

Kv抗體常見的有Kvl.1、Kvl.2或Kvl.6，而抗Kvl.4抗體主要存在于骨骼肌、心肌及腦中。Suzuki S等[19]在2005年利用兔耳肌細(xì)胞提取物作為抗原來(lái)源，S35標(biāo)記的橫紋肌肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Kvl.4抗體，924例MG患者中發(fā)現(xiàn)8例（男1例，女7例）發(fā)展為炎癥性肌病，但存在非肌炎特異的自身抗體，其中3例患者發(fā)現(xiàn)抗Kvl.4抗體。MG相關(guān)的炎癥性肌病的臨床和免疫學(xué)特征與多發(fā)性肌炎不同，首先，心肌受累和胸腺瘤在多發(fā)性肌炎中并不常見[20]。其次，MG患者相關(guān)的炎癥性肌病的自身抗體與多發(fā)性肌炎患者中的肌炎特異性自身抗不同[21]。Kvl.4抗體陽(yáng)性的MG患者易發(fā)生延髓型肌無(wú)力、胸腺瘤及心肌炎。目前關(guān)于Kvl.4抗體的MG的報(bào)道較少，其在MG發(fā)病機(jī)制中的作用尚需進(jìn)一步探討。

1.5其他更少見抗體

MG還可出現(xiàn)膠原蛋白XIII抗體、聚蛋白抗體、DHPR-Ab、抗補(bǔ)體C5-Ab、HSP70-65-Ab、IFN抗體[22]等臨床少見抗體。值得注意的是：①IFN抗體在MG伴胸腺瘤患者外周血中水平較高，IFN具有抗腫瘤作用，并且具有多生物學(xué)效應(yīng)，主要由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子[23]。②膠原蛋白是稱為MACITs（具有間斷的三螺旋的膜相關(guān)的膠原蛋白）的膠原亞組的成員，由短的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和大部分的膠原胞外域組成[24]。膠原蛋白是神經(jīng)肌肉接頭成熟所需的跨膜蛋白。最近的研究表明膠原蛋白位于神經(jīng)肌肉接頭的功能區(qū)，結(jié)合乙酰膽堿酯酶相關(guān)膠原蛋白（ColQ），并有助于神經(jīng)肌肉接頭的乙酰膽堿酯酶的分布形式。因此，我們推測(cè)膠原蛋白自身抗體的致病機(jī)制可能是阻礙膠原蛋白和其他突觸基底層組分之間的相互作用，并使神經(jīng)肌肉接頭突觸不穩(wěn)定[25]。

2 檢測(cè)方法

2.1 放射免疫法（radioimmunoprecipiation assay：RIA）

RIA又叫做競(jìng)爭(zhēng)性飽和法，抗原和抗體由放射性物質(zhì)標(biāo)記，隨之結(jié)合待檢樣本，形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行測(cè)定。以往的放射免疫測(cè)定方法關(guān)鍵在于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體，競(jìng)爭(zhēng)雙方為放射性標(biāo)記的抗原與待檢樣本中未標(biāo)記的抗原；另一種方法是在前者的基礎(chǔ)上擴(kuò)展，關(guān)鍵在于放射性物質(zhì)標(biāo)記足量抗體，結(jié)合待檢抗原，利用固相免疫吸附載體的原理的一種非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法。RIA優(yōu)勢(shì)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高、可一次完成大量樣本的檢測(cè)、血清的消耗量少。國(guó)外研究多采用敏感度和特異度均高的RIA檢測(cè)AChR-Ab的滴度[26]，尤其是類似MG癥狀的初步篩選時(shí)，RIA應(yīng)用更廣泛。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA法其本質(zhì)是一種特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，優(yōu)勢(shì)在于該方法利用高度特異性抗原抗體結(jié)合，可以有效消除樣本的本底和對(duì)位量干擾，得到更高的靈敏度。目前，ELISA法可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，減少了系統(tǒng)及隨機(jī)誤差，因此廣泛應(yīng)用于MG抗體檢測(cè)中。但是，該法易受多方面因素的干擾：①代謝物，測(cè)定易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，干擾生物利用度；②抗體的形成，對(duì)蛋白的定量測(cè)定產(chǎn)生影響；③基質(zhì)特異性，蛋白的反應(yīng)性易改變。因此，國(guó)內(nèi)外多推薦利用特異度和靈敏度均高的RIA檢測(cè)抗體及其滴度。

2.3 熒光細(xì)胞染色方法（cell-based assays，CBA）

CBA原理在于通過編碼蛋白的互補(bǔ)DNA（cDNA）轉(zhuǎn)染活的人胚胎腎（HEK）細(xì)胞，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)錨定蛋白rapsyn共同表達(dá)，從而使得AChR在HEK細(xì)胞表面上表達(dá)。測(cè)定AChR-Ab時(shí)，可用AChR亞基的cDNAs以及rapsyn增強(qiáng)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞。測(cè)定LRP4-Ab時(shí)，用LRP的cDNAs轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞表面表達(dá)。CBA的優(yōu)勢(shì)在于可檢測(cè)生物膜環(huán)境中的AChR結(jié)合的抗體，這些抗體具有天然構(gòu)象狀態(tài)和適當(dāng)?shù)奶腔?，與神經(jīng)肌肉接頭處的抗體類似。因此，CBA可提高血清陰性MG患者的抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率。CBA高敏感性很可能是由于其檢測(cè)到的抗體通過二價(jià)結(jié)合使細(xì)胞表面上的AChR簇交聯(lián)作用，從而增加了CBA檢測(cè)抗體的敏感性。但是CBA的劣勢(shì)在于，它需使用活細(xì)胞，需組織培養(yǎng)設(shè)備，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，目前主要應(yīng)用于專門的研究中心[27]。

2.4 時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）

MG患者中AChR-Ab可通過放射免疫沉淀測(cè)定，為研究一種非放射性免疫測(cè)定法，人們建立了一種鑭系元素的高靈敏度檢測(cè)，可標(biāo)記多種化合物。TRFIA使用Eu3+-a-CTx而不是125I-a-BuTx標(biāo)記的抗原[28]。其優(yōu)勢(shì)在于用于標(biāo)記抗原的試劑是比125 I-a-BuTx更穩(wěn)定，克服了酶不穩(wěn)定性及RIA中放射性同位素的污染問題，但是，要求專業(yè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

MG是臨床少見疾病，同其他自身免疫疾病一樣，其發(fā)病的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，自身抗體與MG的發(fā)病機(jī)制密不可分，已發(fā)現(xiàn)MG相關(guān)抗體十余種，是否還存在與MG相關(guān)的抗體仍在探索，目前存在許多問題需進(jìn)一步解決，如自身抗體之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是如何啟動(dòng)和調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答等，隨著對(duì)于MG的深入研究將會(huì)有更新的進(jìn)展；國(guó)內(nèi)外多推薦利用特異度和靈敏度均高的RIA檢測(cè)抗體及其滴度，提高檢測(cè)抗體的準(zhǔn)確性以及擴(kuò)展檢測(cè)方法，從而更好地去認(rèn)識(shí)MG這一疾病。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Carr AS，Cardwell CR，Mc Carron PO，et al. A systematic review of population based epidemiological studies in Myasthenia Gravis[J]. BMC Neurology，2010，10（1）：46.

[2] Sieb JP. Myasthenia gravis：An update for the clinician[J].Clinical & Experimental Immunology，2014，175（3）：408-418.

[3] Lindstrom JM，Seybold ME，Lennon VA，et al. Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis. Prevalence，clinical correlates，and diagnostic value[J]. Neurology，1976，26（11）：1054-1059.

[4] Hoch W，Mc Conville J，Helms S，et al. Auto-antibodies to the receptor tyrosine kinase MuSK in patients with myasthenia gravis without acetylcholine receptor antibodies[J]. Nature Medicine，2001，7（3）：365-368.

[5] Vincent A. Timeline：Unravelling the pathogenesis of myasthenia gravis[J]. Nature Reviews Immunology，2002，2（10）：797-804.

[6] Koneczny I，Cossins J，Waters P，et al. MuSK myasthenia gravis IgG4 disrupts the interaction of LRP4 with MuSK but both IgG4 and IgG1-3 can disperse preformed agrin-independent AChR clusters[J]. PLoS One，2013，8（11）：e80695.

[7] Higuchi O，Hamuro J，Motomura M，et al. Autoantibodies to low-density lipoprotein receptor-related protein 4 in myasthenia gravis[J]. Annals of Neurology，2011，69（2）：418-422.

[8] Go GW，Mani A. Low-density lipoprotein receptor（LDLR） family orchestrates cholesterol homeostasis[J]. Yale J Biol Med，2012，85（1）：19-28.

[9] Barik A，Lu Y，Sathyamurthy A，et al. LRP4 is critical for neuromuscular junction maintenance[J]. Journal of Ne-uroscience，2014，34（42）：13892-13905.

[10] Liversage AD，Holmes D，Knight PJ，et al. Titin and the sarcomere symmetry paradox11Edited by J. Karn[J]. Journal of Molecular Biology，2001，305（3）：401-409.

[11] Aarli JA，Lefvert AK，Tonder O. Thymoma-specific antibodies in sera from patients with myasthenia gravis demonstrated by indirect haemagglutination[J]. Journal of Neuroimmunology，1981，1（4）：421-427.

[12] Gautel M，Lakey A，Barlow DP，et al. Titin antibodies in myasthenia gravis：Identification of a major immunogenic region of titin[J]. Neurology，1993，43（8）：1581-1585.

[13] Shelly S，Agmon-Levin N，Altman A，et al. Thymoma and autoimmunity[J]. Cellular and Molecular Immunology，2011， 8（3）：199-202.

[14] 黃載慧，喬健，張祥，等. 血清CAE和Titin抗體檢測(cè)對(duì)伴胸腺瘤重癥肌無(wú)力診斷意義的比較[J]. 上海免疫學(xué)雜志，2003，（6）：361-364.

[15] 武茜，顧萍，姚娟，等. 血清AChRab、PsMab和CAEab檢測(cè)在胸腺異常患者中的診斷意義[J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2017，（5）：344-348.

[16] Maruta T，Yoshikawa H，F(xiàn)ukasawa S，et al. Autoantibody to dihydropyridine receptor in myasthenia gravis[J]. Journal of Neuroimmunology，2009，208（1-2）：125-129.

[17] Coronado R，Morrissette J，Sukhareva M，et al. Structure and function of ryanodine receptors[J]. Am J Physiol，1994， 266（6 Pt 1）：1485-1504.

[18] 田雪瑩，于公元. 興奮-收縮偶聯(lián)中DHPR與RyR的相互作用[J]. 生命的化學(xué)，2007，（5）：413-416.

[19] Suzuki S. Autoimmune targets of heart and skeletal muscles in myasthenia gravis[J]. Archives of Neurology，2009， 66（11）：1334-1335.

[20] Aarli JA. Inflammatory myopathy in myasthenia gravis[J]. Current Opinion in Neurology，1998，11（3）：233-234.

[21] Suzuki S，Satoh T，Sato S，et al. Clinical utility of anti-signal recognition particle antibody in the differential diagnosis of myopathies[J]. Rheumatology，2008，47（10）：1539-1542.

[22] 許博，張臨友，張永強(qiáng). 自身抗體與重癥肌無(wú)力的研究新進(jìn)展[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志，2011，34（5）：276-280.

[23] Meager A. Biological assays for interferons[J]. J Immunol Methods，2002，74（5）：1658-1662.

[24] Tu H，Huhtala P，Lee HM，et al. Membrane-associated collagens with interrupted triple-helices（MACITs）：Evolution from a bilaterian common ancestor and functional conservation in C. elegans[J]. BMC Evol Biol，2015，1（15）：280-281.

[25] Tu Hongmin，Pirskanen-Matell，Ritva Heikkinen，et al. Autoimmune antibodies to collagen in myasthenia gravis patients[J]. Muscle & Nerve，2017，12（5）：201-216.

[26] 李尊波，郭俊，沈定國(guó)，等. 放射免疫法定量檢測(cè)乙酰膽堿受體抗體與重癥肌無(wú)力患者臨床特征的相關(guān)性[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2017，（3）：156-161.

[27] Rodriguez Cruz，Huda S，Vincent A，et al. Use of cell-based assays in myasthenia gravis and other antibody-mediated diseases[J]. Experimental Neurology，2015，32（270）：66-71.

[28] Jacob S，Viegas S，Leite MI，et al. Presence and pathogenic relevance of antibodies to clustered acetylcholine receptor in ocular and generalized myasthenia gravis[J]. Archives of Neurology，2012，69（8）：994-1001.

（收稿日期：2017-12-21）