• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山東省及周邊地區(qū)肉鴨源大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性分析

    2018-03-29 10:20:18駱延波李蘭波賈紀(jì)美齊靜李璐璐胡明劉玉慶鄧旭明
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:藥敏試驗大腸桿菌

    駱延波 李蘭波 賈紀(jì)美 齊靜 李璐璐 胡明 劉玉慶 鄧旭明

    摘要:為建立鴨大腸桿菌快速鑒定及藥敏檢測方法,篩選合適的抗生素,本試驗從山東省12個、河北4個及河南4個地區(qū)養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖小區(qū)采集到447份疑似感染鴨大腸桿菌的肉鴨肝臟和腦部組織病料,共分離到300株大腸桿菌,分離率為67.11%。利用大腸桿菌phoA基因為目的基因,建立了PCR快速鑒定鴨源大腸桿菌的方法。該PCR檢測方法可快速鑒定鴨源大腸桿菌,鑒定效率顯著提高。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)及瓊脂稀釋法藥敏試驗原理,建立了96點接種藥敏檢測盒快速檢測方法,結(jié)果表明:硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星抑菌率相對較高;卡那霉素、氨芐西林、氟苯尼考抑菌率相對較低。根據(jù)藥敏檢測結(jié)果可快速篩選適用的敏感藥物和劑量,并交替輪流使用抗生素。

    關(guān)鍵詞:鴨;大腸桿菌;藥敏試驗;多重耐藥

    中圖分類號:S858.322.61+2文獻標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2018)02-0119-05

    Abstract This study was aimed to establish the methods for rapid separation and identification of Escherichia coli from ducks and drug susceptibility test, and screen proper antibiotics. We collected 447 histological materials including livers and brains from ducks with suspected coli bacillosis from 12 districts or cities of Shandong Province, 4 cities of Hebei Provice and 4 cities of Henan Province.Based on the phoA gene,a PCR method was established for rapidly identifying Escherichia coli from ducks. By this method, 300 strains of Escherichia coli were identified with the isolation rate as 67.11%. This PCR method could be used to rapidly identify Escherichia coli from ducks, and the identification efficiency was significantly improved. According to the standard of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and agar dilution method, the rapid detection method of 96 array antimicrobial susceptibility test was established. The results showed that the antibacterial rate of polymyxin sulfate and pefloxacin mesylate were higher,while that of kanamycin, ampicillin and florfenicol were relatively lower. So the optimal sensitive drugs and doses could be screened out according to the drug sensitivity test results, and the antibiotics could be used alternately.

    Keywords Duck; Escherichia coli; Antibiotic susceptibility test; Multi drug resistance

    鴨大腸桿菌感染是目前肉鴨養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的細(xì)菌性傳染病之一,而且該菌常與其它細(xì)菌混合感染[1-3]??股刈鳛榧?xì)菌感染的有效治療手段得以普遍應(yīng)用,但是近些年來廣譜抗菌藥的濫用以及細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)等因素,導(dǎo)致鴨大腸桿菌表現(xiàn)出了普遍的多重耐藥性[4-8],不同地區(qū)分離到的鴨大腸桿菌對不同抗菌藥的敏感程度存在較大差異[9-11],進行大批量鴨大腸桿菌鑒定及藥敏試驗需要耗費相當(dāng)長的時間才能得到相應(yīng)的結(jié)果,給該病的診斷與治療造成了極大的困難。針對目前山東省及周邊地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖中細(xì)菌傳染病發(fā)病率高、防治困難,同時傳統(tǒng)的鴨大腸桿菌鑒定及藥敏試驗方法檢測效率較低的現(xiàn)狀,本研究建立了鴨大腸桿菌的PCR快速鑒定方法,并根據(jù)CLSI瓊脂稀釋法藥敏試驗原理,建立了96點接種藥敏檢測盒,菌株的分離檢測效率大大提高,并可為獸醫(yī)臨床合理用藥提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    從山東省12個地區(qū)、河北4地區(qū)及河南4地區(qū)養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖小區(qū)采集到447份疑似鴨漿膜炎的病鴨肝臟及腦部組織病料。

    1.1.1 培養(yǎng)基與試劑 麥康凱培養(yǎng)基,MH培養(yǎng)基,伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基,大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,TSA培養(yǎng)基,TSB培養(yǎng)基;新生牛血清,PCR反應(yīng)試劑(Taq酶、dNTP Mix、MgCl2、10×Loading buffer),DNA Marker(DL2000 plus),PMD18-T載體,DH5α感受態(tài)細(xì)胞,核酸膠回收試劑盒,質(zhì)粒提取試劑盒,瓊脂糖,50×TAE電泳緩沖液,氨芐青霉素(Amp)貯存液,LB+Amp平板,1%瓊脂糖凝膠等。

    1.1.2 試驗藥物 購自青島康地恩藥業(yè)有限公司,主要成分分別為氨芐西林鈉、乳酸環(huán)丙沙星、硫酸多粘菌素、硫酸卡那霉素、甲磺酸培氟沙星、氟苯尼考、磺胺氯噠嗪鈉、痢菌凈、多西環(huán)素等。

    1.1.3 主要試驗儀器 96孔聚乙烯板藥敏檢測盒;VD-650型桌上式超凈臺;LDZX-40SBI高壓滅菌鍋;DYY-2電泳儀;移液器(德國Eppendoff公司);凝膠成像系統(tǒng);HPP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱;生物安全柜;Ultrospec 3100 Pro紫外分光光度計(英國Biochrom公司); FA2104N電子分析天平;HZQ-C空氣浴振蕩器;PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 大腸桿菌分離培養(yǎng) 從病死鴨病變組織(肝、腦等)中無菌穿刺采樣,接種于裝有2 mL滅菌LB瓊脂培養(yǎng)基的穿刺管中培養(yǎng)36~48 h;之后用接種環(huán)從穿刺管中心插入,抽出后劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平皿,37℃倒置培養(yǎng)16~18 h,即可出現(xiàn)紫黑色、帶金屬光澤的圓形疑似大腸桿菌菌落。取疑似菌落劃線接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板,37℃倒置培養(yǎng)16~18 h進行純化。鉤取純化菌落涂片,革蘭氏染色后鏡檢,進行后續(xù)生化及分子鑒定。

    1.2.2 生化鑒定 取疑似菌落分別接種于五糖發(fā)酵管、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛瓊脂上進行糖發(fā)酵(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇)試驗、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗、硫化氫試驗,置于37℃培養(yǎng)2~3 d觀察結(jié)果。

    1.2.3 分子鑒定 將分離菌株無菌劃線接種于TSA培養(yǎng)基上,挑取單菌落于MH液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)18~24 h,離心,棄上清,用50 μL滅菌水懸浮沉淀,放入沸水浴中煮沸10 min,取出后迅速放入冰塊中,冷卻5 min,12 000 r/min離心3 min,吸上清液作為DNA模板,并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    參考文獻[12]~[14],選取大腸桿菌phoA保守基因為目的片段設(shè)計引物,引物序列為F:5′-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3′,R:5′-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3′,擴增序列長度750 bp。檢測基因的PCR反應(yīng)體系見表1,反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性10 min;94℃變性50 s,54℃退火45 s,72℃延伸50 s,共32個循環(huán);最后72℃再延伸10 min[15,16]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行進目的核苷酸克隆測序,并用DNAStar MegAlign進行多序列比對,確定種屬關(guān)系。

    1.2.4 瓊脂稀釋法藥敏試驗 首先按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)或臨床推薦劑量稀釋藥物至L值(獸藥成品的L值等于養(yǎng)殖戶治療動物疾病使用的藥物濃度或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)“R”值),然后設(shè)置L/4、L/2、L、2 L、4 L五個濃度梯度。

    菌液制備:將分離得到的大腸桿菌菌液200 μL按順序接入96孔板Ⅰ中,每板接48株菌為宜,之后取96點陣板扣入已接菌液的96孔板Ⅰ中,充分接觸后,把96點陣板扣入每孔裝有200 μL LB液體的96孔板Ⅱ中,充分接觸后,再把此點陣板扣入每孔裝有200 μL LB液體的96孔板Ⅲ中,充分接觸后,保留96孔板Ⅲ(每孔菌液濃度約為105 CFU/mL),同時做好標(biāo)記,記錄菌株順序。

    菌液接種:首先在9 cm平皿上依次標(biāo)明待測藥物名稱與藥物濃度梯度,并各加入20 mL高壓滅菌水,然后在每種藥物的4 L濃度平皿中加入20 mL待測藥物,其余各皿按藥物濃度依次進行梯度稀釋。分別向每個96點陣藥敏檢測盒中加入18 mL高壓滅菌且冷卻至55℃左右的MH瓊脂與2 mL不同濃度梯度的待測藥物,并立即混勻,同時避免產(chǎn)生氣泡(此時每種藥物的濃度依次為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL)。然后使用多位點接種器接種96孔板Ⅲ中菌液至96點陣藥敏檢測盒瓊脂表面,首先接種無抗菌藥物的對照盒,然后從每種藥物的最低藥物濃度至最高藥物濃度依次開始接種。將接種后的96點陣藥敏檢測盒在室溫靜置至接種點的水分被瓊脂完全吸收,干燥,但整個過程不能超過30 min。然后將平皿倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~20 h。

    結(jié)果判定:有菌生長,此藥物濃度無效;無菌生長,此藥物濃度有效。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

    從山東、河北、河南部分區(qū)、市采集到的447份病鴨的腦、肝組織病料中共分離到大腸桿菌300株,分離率為67.11%。

    2.2 培養(yǎng)特性、鏡檢及生化鑒定結(jié)果

    在伊紅美蘭瓊脂平板上長出紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落,疑似為大腸桿菌菌落;另有少數(shù)樣品在伊紅美蘭瓊脂平板上出現(xiàn)乳白、邊緣不規(guī)則菌落,判為雜菌。疑似大腸桿菌在顯色培養(yǎng)基上純化,挑取純化的單菌落涂片,革蘭氏染色鏡檢,觀察記錄菌體形態(tài)和染色特征。大腸桿菌染色后為紅色,細(xì)菌形態(tài)為短小的桿狀,單個存在。最終鑒定結(jié)果為300株大腸桿菌。生化反應(yīng)見表2。

    2.3 分子鑒定結(jié)果

    對大腸桿菌phoA基因進行PCR 擴增,結(jié)果300株大腸桿菌均擴增出750 bp特異性條帶(圖1)。陽性擴增產(chǎn)物經(jīng)純化測序后,通過NCBI BLAST比對分析發(fā)現(xiàn),均與其標(biāo)準(zhǔn)菌株有高達(dá)99%的同源性。根據(jù)同源性達(dá)到99%以上為同一種屬的原則,可以判定其為同一種屬, phoA是保守的特異性基因,可以作為大腸桿菌快速檢測的候選基因之一。

    2.4 藥敏試驗結(jié)果

    如表3所示,硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星、痢菌凈、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星抑菌率相對較高,可作為目前選用的主要藥物。硫酸卡那霉素、氨芐西林、氟苯尼考長期用于獸醫(yī)臨床,抑菌率較低,建議暫時不用該類抗生素。

    多重抗藥性現(xiàn)象嚴(yán)重(表4)。以L值作為抗藥性判定標(biāo)準(zhǔn),300株大腸桿菌中不存在單重抗藥株,二重抗藥占比3%,三重抗藥17%,4重抗藥10%,5重以上抗藥共占70%。這與長期使用復(fù)方抗生素有很大關(guān)系。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 大腸桿菌分離培養(yǎng)

    本研究中從447份病死鴨的肝、腦組織病料共分離到大腸桿菌300株,分離率較高。大腸桿菌分離率明顯高于沙門氏菌和里默氏桿菌,表明從總體來看,在疑似鴨漿膜炎病傳播中大腸桿菌仍是主要致病菌。雖然從細(xì)菌分離率來看,沙門氏菌和里默氏桿菌要低的多,但是由于其致病力更強、致死率更高,這兩種病原菌也不容忽視。

    3.2 大腸桿菌鑒定

    大腸桿菌可以通過菌落形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)鑒定、生化反應(yīng)[17-20]等傳統(tǒng)技術(shù)手段相互配合來進行鑒定,但這些方法操作繁瑣,靈敏度低、特異性差。phoA是大腸桿菌內(nèi)特異性較高的基因,編碼磷酸酯分解酶A。本研究在該基因上選取目的片段,設(shè)計PCR引物,對受試菌株進行PCR檢測,檢測結(jié)果與生化鑒定相符,而且其特異性更高、靈敏性更強,可以作為快速檢測方法。

    3.3 大通量瓊脂稀釋法藥敏試驗

    藥敏試驗方法多樣,耗費低、耗時少,試驗結(jié)果在臨床用藥中具有很高的指導(dǎo)意義,是一種標(biāo)準(zhǔn)化的、易于掌握和操作的技術(shù),但即便如此在畜牧生產(chǎn)中遠(yuǎn)沒有被有效的利用。本試驗改進CLSI藥敏試驗體系,以臨床推薦劑量為準(zhǔn),設(shè)定多個梯度,基于瓊脂稀釋法建立了大通量篩選敏感藥物及其適宜的臨床使用劑量的方法。試驗結(jié)果表明該方法易于確認(rèn)結(jié)果,比標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴散法更準(zhǔn)確且效率高,比微量肉湯稀釋法藥敏試驗的效率提高10倍,適合高通量藥敏檢測。結(jié)合穿刺采樣,集中多種鑒定檢測策略,我們相對高效地完成了覆蓋山東全省的抗藥性普查,并針對各地區(qū)現(xiàn)狀推薦了適宜的抗菌藥物及劑量。利用該方法可以建立養(yǎng)殖廠區(qū)內(nèi)及更大區(qū)域內(nèi)動態(tài)的藥敏檢測系統(tǒng),以便篩選有效藥物,用于藥物區(qū)域輪換。

    參 考 文 獻:

    [1] 郭玉璞,張大丙. 鴨疫里默氏桿菌病[J].養(yǎng)禽與禽病防治,1999(10):6-7.

    [2] 蘇敬良.禽病學(xué)[M].第十版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:76-78.

    [3] 張大丙,郭玉璞.不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的部分特性比較[J].中國獸醫(yī)雜志,1999(10):13-15.

    [4] 汪銘書,程安春,李淑梅,等.RAPD用于鴨疫里默氏桿菌鴨源致病性大腸桿菌和鴨沙門氏菌的遺傳相似性及聚類分析的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2007(9):9-11.

    [5] Saif Y M,Barnes H J,Glisson J R, et al. Diseases of poultry[M].11th edition. America:Wiley-Blackwell,2003:354-363.

    [6] 宋立,寧宜寶,張秀英,等.中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(7):1466-1473.

    [7] 劉建民,張瑞華,姜世金.濰坊市肉鴨源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性的檢測[J]. 家禽科學(xué),2015(11):17-20.

    [8] 劉玉慶,等譯.細(xì)菌抗藥性[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2012.

    [9] 丁孟建,胡世君,鄭凱,等.規(guī)模養(yǎng)殖場肉鴨大腸桿菌病病原的分離鑒定及耐藥性檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(5):105-107.

    [10]葉保國,林大捷,邢漫萍,等.鴨大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 家禽科學(xué), 2013(10):43-44.

    [11]程方俊,周廷宣,田晉紅,等.重慶養(yǎng)鴨場雛鴨大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,28(6):1007-1010.

    [12]教郁,高維凡,胡彩光.大腸桿菌耐藥性研究進展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013(5):53-58.

    [13]劉巍申.鴨疫里默氏桿菌脂多糖在致病機制中的作用研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

    [14]倪粒瓊.鴨源大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌原生質(zhì)體融合及其融合子研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    [15]謝永平,彭昊,陳澤祥,等.鴨疫里默桿菌PCR快速檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011(1):88-89.

    [16]Davies J, Smith D I. Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents[J]. Annu. Rev. Microbiol., 1978, 32:469-518.

    [17]李富祥,楊斌,常志順,等.間接ELISA檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(1): 202-206.

    [18]程安春,汪銘書,方鵬飛,等.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清1,2,4和5型鴨疫里默氏桿菌抗體的研究[J].中國家禽,2004(16):11-14.

    [19]劉維平,程安春,汪銘書,等.間接免疫組化法檢測鴨疫里默氏桿菌感染和抗原定位[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2005,25(4):362-365.

    [20]杜娟,牛艷波,王麗.鴨致病性大腸桿菌耐藥性調(diào)查與分析[J].飼料博覽,2015(6):41-43.

    猜你喜歡
    藥敏試驗大腸桿菌
    解放軍第四五八醫(yī)院2015年度細(xì)菌耐藥性監(jiān)測分析
    甲基黃嘌呤生物堿作用概述
    基于樹枝狀分子及功能化金納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器檢測污泥中大腸桿菌
    紹興市重癥肺炎患者病原菌分布及耐藥性分析
    對慢性鼻—鼻竇炎患者細(xì)菌學(xué)檢測及藥敏的探究
    1000例真菌感染與耐藥性分析
    適應(yīng)度代價對大腸桿菌藥物敏感性恢復(fù)的作用
    復(fù)發(fā)性尿路感染的細(xì)菌檢驗分析
    斷奶幼兔日糧中添加Tu—569菌劑對其生長性能及腸道微生物區(qū)系的影響
    長期保存活力低下的大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞條件的優(yōu)化
    最近手机中文字幕大全| 丰满少妇做爰视频| 亚洲综合色网址| 久久人人爽人人爽人人片va| 女人精品久久久久毛片| 日日撸夜夜添| 亚洲精品乱久久久久久| 一级毛片 在线播放| 国产一区二区三区av在线| 久久99一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 夫妻性生交免费视频一级片| 热99久久久久精品小说推荐| 久久毛片免费看一区二区三区| 18+在线观看网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 精品人妻在线不人妻| 久久婷婷青草| 亚洲国产精品国产精品| 99久久人妻综合| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费人成在线观看视频色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品第二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩一区二区三区影片| 婷婷成人精品国产| 高清毛片免费看| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 精品一区二区三卡| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利,免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久久电影| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 18禁动态无遮挡网站| 久久久久久人人人人人| 自线自在国产av| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲国产av新网站| 亚洲成国产人片在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美另类一区| 一边亲一边摸免费视频| 精品一区在线观看国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产av国产精品国产| 成人无遮挡网站| 久久久久精品性色| 韩国av在线不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 三级国产精品片| 18禁动态无遮挡网站| 秋霞伦理黄片| av有码第一页| 岛国毛片在线播放| 在线看a的网站| 免费观看av网站的网址| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜日本视频在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 各种免费的搞黄视频| 99热国产这里只有精品6| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久伊人网av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 午夜福利视频精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 自线自在国产av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 五月开心婷婷网| av播播在线观看一区| 国产亚洲欧美精品永久| av在线播放精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲第一av免费看| av有码第一页| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 青青草视频在线视频观看| 国产 精品1| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日本中文国产一区发布| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成人国语在线视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲天堂av无毛| 国产男女内射视频| 精品国产国语对白av| 国产av精品麻豆| 波多野结衣一区麻豆| 哪个播放器可以免费观看大片| 一级片'在线观看视频| av国产精品久久久久影院| www.色视频.com| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久国产网址| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩中字成人| 久久午夜综合久久蜜桃| 婷婷色综合www| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品成人在线| 国产黄频视频在线观看| 国产精品三级大全| 精品一区二区三区视频在线| 热re99久久精品国产66热6| 精品人妻在线不人妻| 免费高清在线观看日韩| av.在线天堂| 精品一区二区三卡| 精品视频人人做人人爽| 免费高清在线观看日韩| 超色免费av| 亚洲综合色网址| 黑人猛操日本美女一级片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久| xxx大片免费视频| 婷婷色综合www| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲色图综合在线观看| 妹子高潮喷水视频| 国产色婷婷99| 国产免费现黄频在线看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 看免费成人av毛片| 在线看a的网站| 国产 一区精品| 中文字幕最新亚洲高清| 一本久久精品| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产精品999| 国产黄色免费在线视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久午夜福利片| 18禁观看日本| 欧美人与善性xxx| 久久99精品国语久久久| 日韩av免费高清视频| 成人无遮挡网站| av线在线观看网站| 日本黄色日本黄色录像| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 天天影视国产精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 制服诱惑二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲图色成人| 国产免费现黄频在线看| www.色视频.com| 9191精品国产免费久久| 久久精品国产亚洲av天美| 岛国毛片在线播放| 国产一区二区三区av在线| 久久青草综合色| 久久精品久久久久久久性| 熟女av电影| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| xxx大片免费视频| 婷婷色综合www| 国产高清三级在线| 久久久国产精品麻豆| 街头女战士在线观看网站| 两个人看的免费小视频| 欧美成人午夜精品| 尾随美女入室| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久热在线av| 亚洲成人一二三区av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 两个人免费观看高清视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 国产黄频视频在线观看| 久久久久久久精品精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人国语在线视频| 久久久久精品性色| 18+在线观看网站| 91国产中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美 日韩 精品 国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 少妇高潮的动态图| 国产黄色免费在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产看品久久| 18+在线观看网站| 秋霞在线观看毛片| 少妇精品久久久久久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 乱人伦中国视频| 免费高清在线观看日韩| 国产一区二区在线观看av| 在线观看三级黄色| 久久精品人人爽人人爽视色| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 晚上一个人看的免费电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲天堂av无毛| 国产综合精华液| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲高清免费不卡视频| 乱人伦中国视频| 国产成人精品福利久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成人免费观看视频高清| 国产成人免费观看mmmm| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 9191精品国产免费久久| 久久 成人 亚洲| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人一区二区在线| av在线观看视频网站免费| 国产成人精品婷婷| www日本在线高清视频| 青春草视频在线免费观看| 超色免费av| av国产久精品久网站免费入址| 中文字幕亚洲精品专区| 岛国毛片在线播放| 亚洲成色77777| 激情五月婷婷亚洲| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美xxⅹ黑人| 久久ye,这里只有精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费观看a级毛片全部| 春色校园在线视频观看| 成人二区视频| 女性生殖器流出的白浆| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 男的添女的下面高潮视频| 国产片内射在线| 人妻系列 视频| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲天堂av无毛| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 乱人伦中国视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产1区2区3区精品| 18禁观看日本| 男的添女的下面高潮视频| 综合色丁香网| 99热全是精品| 国产av一区二区精品久久| 国产精品 国内视频| av在线播放精品| 少妇的逼水好多| 免费观看在线日韩| 黄色怎么调成土黄色| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品偷伦视频观看了| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日韩精品成人综合77777| 熟女电影av网| 一级毛片电影观看| 晚上一个人看的免费电影| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 青春草亚洲视频在线观看| 日本91视频免费播放| av免费观看日本| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产高清不卡午夜福利| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产在线一区二区三区精| av播播在线观看一区| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 色视频在线一区二区三区| 国产又爽黄色视频| av播播在线观看一区| 在线 av 中文字幕| 国产在线免费精品| 久久久国产一区二区| 亚洲国产精品国产精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 美女内射精品一级片tv| 午夜福利,免费看| 一级片'在线观看视频| 999精品在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产精品久久久久久av不卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品久久久久久精品古装| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲最大av| 婷婷成人精品国产| 久久久国产精品麻豆| www.熟女人妻精品国产 | 2022亚洲国产成人精品| 天堂8中文在线网| 久久久久久人人人人人| 交换朋友夫妻互换小说| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜免费观看性视频| 草草在线视频免费看| 最后的刺客免费高清国语| 18+在线观看网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲成人手机| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久国产亚洲av麻豆专区| 热99久久久久精品小说推荐| www.色视频.com| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲国产精品一区三区| 国产色婷婷99| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品不卡视频一区二区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品成人av观看孕妇| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 香蕉国产在线看| 日本欧美国产在线视频| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 成人二区视频| 亚洲经典国产精华液单| 9色porny在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久狼人影院| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 免费看光身美女| 男女高潮啪啪啪动态图| 乱人伦中国视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲少妇的诱惑av| 26uuu在线亚洲综合色| 免费日韩欧美在线观看| 日韩成人伦理影院| 久久久国产一区二区| 午夜影院在线不卡| 成人国产av品久久久| 人妻一区二区av| 精品一区在线观看国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热6这里只有精品| 精品福利永久在线观看| 一级毛片我不卡| 捣出白浆h1v1| 天堂8中文在线网| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本色播在线视频| 99热这里只有是精品在线观看| 大香蕉久久网| 2018国产大陆天天弄谢| 国产高清三级在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 在线观看国产h片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 最黄视频免费看| 亚洲成人一二三区av| 国产极品天堂在线| 国内精品宾馆在线| 不卡视频在线观看欧美| 久久影院123| 97超碰精品成人国产| 亚洲欧洲日产国产| 青春草视频在线免费观看| 一级毛片 在线播放| 国产在线一区二区三区精| 日本午夜av视频| 国产精品一二三区在线看| 黑丝袜美女国产一区| 在线观看国产h片| 国产色婷婷99| 高清黄色对白视频在线免费看| 日本黄大片高清| 国产成人av激情在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品,欧美精品| 在现免费观看毛片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲成人手机| kizo精华| 777米奇影视久久| 中文字幕制服av| 高清黄色对白视频在线免费看| 宅男免费午夜| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲少妇的诱惑av| 极品人妻少妇av视频| 高清毛片免费看| 观看av在线不卡| 成人二区视频| 日本av免费视频播放| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品,欧美精品| 人妻系列 视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费观看在线日韩| 两个人免费观看高清视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产色爽女视频免费观看| 各种免费的搞黄视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美成人精品欧美一级黄| 日产精品乱码卡一卡2卡三| a级毛色黄片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品一区二区三区视频在线| 男的添女的下面高潮视频| 国产成人免费无遮挡视频| 老司机影院毛片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| av有码第一页| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 最近中文字幕2019免费版| 国产在视频线精品| 国产不卡av网站在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 在线观看免费高清a一片| 亚洲经典国产精华液单| 日韩欧美精品免费久久| 欧美人与善性xxx| 成人漫画全彩无遮挡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日日爽夜夜爽网站| 日韩一区二区视频免费看| 在线观看三级黄色| 两个人免费观看高清视频| 久久影院123| 欧美激情国产日韩精品一区| 视频中文字幕在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 色哟哟·www| 热99久久久久精品小说推荐| 免费大片18禁| 美女中出高潮动态图| 久久久精品94久久精品| 久久亚洲国产成人精品v| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 黄片播放在线免费| 国产在线视频一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美日韩综合久久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 高清在线视频一区二区三区| www.色视频.com| 九九爱精品视频在线观看| 黑人高潮一二区| 十八禁高潮呻吟视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 中文字幕最新亚洲高清| 日本黄色日本黄色录像| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜免费观看性视频| 国产综合精华液| 久久久久久久久久久免费av| 国精品久久久久久国模美| 国产精品久久久久久久电影| 婷婷色综合www| 一级,二级,三级黄色视频| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产熟女午夜一区二区三区| 日日啪夜夜爽| 国产成人免费观看mmmm| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 婷婷成人精品国产| 日本vs欧美在线观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产一区二区三区av在线| 高清毛片免费看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品不卡视频一区二区| 色视频在线一区二区三区| 久久久久国产网址| 99久久精品国产国产毛片| 永久网站在线| 人妻系列 视频| 亚洲国产av影院在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 人人澡人人妻人| 在线观看免费视频网站a站| 青春草亚洲视频在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 91国产中文字幕| 韩国精品一区二区三区 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产亚洲精品久久久com| 这个男人来自地球电影免费观看 | 一区二区三区四区激情视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 丰满少妇做爰视频| av网站免费在线观看视频| 欧美3d第一页| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲第一av免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 五月开心婷婷网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产片内射在线| 在线精品无人区一区二区三| 日日摸夜夜添夜夜爱| 香蕉丝袜av| 曰老女人黄片| 国产爽快片一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩大片免费观看网站| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产 精品1| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人漫画全彩无遮挡| 九九在线视频观看精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲美女搞黄在线观看| 国产 一区精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲内射少妇av| 高清在线视频一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 秋霞伦理黄片| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品酒店卫生间|