白內(nèi)障動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

賈 杰, 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心、云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 昆明 650118)

白內(nèi)障(Cataract)作為世界范圍內(nèi)主要的致盲性眼科疾病，是一種由遺傳和環(huán)境等因素引起的以晶狀體渾濁為特征的眼科疾病[1]。據(jù)報(bào)道[2]全球視力受損者約為2.85億人, 視力低下者2.46億人，失明0.39億人。其中33%的視力受損和51%的失明是由白內(nèi)障引起。影響晶狀體透明性的因素眾多, 且白內(nèi)障存在高度的異質(zhì)性，臨床上根據(jù)發(fā)病年齡、病因、晶狀體渾濁形態(tài)和程度分為先天性白內(nèi)障、創(chuàng)傷性白內(nèi)障和代謝性白內(nèi)障等[3]。目前研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的主要手段之一是構(gòu)建動(dòng)物模型，構(gòu)建白內(nèi)障模型常用的動(dòng)物有大鼠、小鼠、豚鼠。不同類型的白內(nèi)障動(dòng)物模型可復(fù)制各種白內(nèi)障發(fā)病的病因或臨床癥狀，解決患者眼部材料不易獲取的難題。因此，建立穩(wěn)定的白內(nèi)障動(dòng)物模型是眼科臨床醫(yī)學(xué)研究十分重要的內(nèi)容之一。本文就國內(nèi)外關(guān)于白內(nèi)障動(dòng)物模型建立和相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 先天性白內(nèi)障

先天性白內(nèi)障是由染色體變異或基因突變等原因引起，該類型白內(nèi)障動(dòng)物模型可通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)基因突變所建立。Jochen等[4]采用乙基亞硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)法對(duì)小鼠誘變篩選, 結(jié)果顯示Cryba1基因第6外顯子的第2堿基可由T突變?yōu)锳，且雜合突變表現(xiàn)為胎兒眼睛晶狀體表層乳濁化，而純合突變則完全發(fā)展為白內(nèi)障，認(rèn)為該突變類型的小鼠可作為研究人類先天性繞核性白內(nèi)障很好的動(dòng)物模型。另外，先天性白內(nèi)障動(dòng)物模型也可以用群體中偶發(fā)先天性白內(nèi)障的動(dòng)物，經(jīng)側(cè)交、回交等繁殖手段保持其遺傳特性。Bu等[5]利用昆明近交系小鼠建立隱性白內(nèi)障的小鼠模型，研究顯示Crygs基因外顯子3第489位堿基可由G突變?yōu)锳，且純合突變的小鼠在出生11 d后開始出現(xiàn)晶狀體渾濁; Crygs基因不僅編碼晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白，而且參與晶狀體上皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡。Yuan等[6]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除家兔αA-crystallin基因造成3～52 bp缺失突變 ，可造成新生家兔先天性白內(nèi)障，表現(xiàn)為小眼球畸形、眼球渾濁、晶狀體過早萎縮等特征。認(rèn)為該動(dòng)物模型提示應(yīng)該進(jìn)一步研究人類αA-crystallin基因突變與先天性白內(nèi)障的關(guān)聯(lián)研究。

UPL大鼠(The Upjohn Pharmaceuticals Limited rat)因其白內(nèi)障為常染色體半顯性遺傳方式，且具有純合子發(fā)病早而雜合子發(fā)病遲的特點(diǎn)，成為獨(dú)特的白內(nèi)障動(dòng)物模型。Yamashita等[7]利用UPL封閉群大鼠定位白內(nèi)障相關(guān)基因，表明Cx50基因的第340位堿基由C突變?yōu)門導(dǎo)致相應(yīng)的精氨酸變?yōu)樯彼?，可延緩白?nèi)障的發(fā)病。該基因編碼產(chǎn)物的分子特征也許可為延緩白內(nèi)障發(fā)病的藥物研發(fā)提供更好的靶點(diǎn)。Kondo等[8]研究顯示, CF1小鼠中存在出生后22 d完全發(fā)展為白內(nèi)障的小鼠。該模型小鼠具有易飼養(yǎng)和可繁殖，晶狀體上皮細(xì)胞和晶狀體皮質(zhì)空泡化, 晶狀體纖維膨脹, 許多細(xì)胞核固縮的特點(diǎn)。通過雜交和回交并對(duì)子代進(jìn)行全基因組測(cè)序顯示該模型小鼠的癥狀通過常染色體隱性的方式遺傳,且該模型的相關(guān)基因?yàn)锽CAR3。該基因第7外顯子區(qū)堿基C的插入產(chǎn)生終止密碼子提前終止BCAR3蛋白的翻譯。認(rèn)為該模型為白內(nèi)障發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制和BCAR3蛋白的功能提供更多的信息[9]。

基因組位點(diǎn)定向敲入或敲除的方法可得到特定基因變異的先天白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。Jonathan等[10]通過比較野生型小鼠和敲入可引起人類遺傳性白內(nèi)障的αB-R120G突變的小鼠中P62蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示敲入αB-R120G突變的小鼠P62蛋白表達(dá)上調(diào)，他們認(rèn)為該模型可用于探索減少晶狀體蛋白聚集方法的研究。近年來研究顯示, 晶狀體細(xì)胞具有自噬功能[11]，P62的累積被認(rèn)為是自噬功能受抑制的標(biāo)志[12,13]。晶狀體細(xì)胞自噬功能受抑制可導(dǎo)晶狀體細(xì)胞喪失抗應(yīng)激和分化能力，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[14]。晶狀體內(nèi)蛋白分子的聚集和晶狀體自噬功能被抑制之間的關(guān)聯(lián)性值得進(jìn)一步研究。通過減少細(xì)胞內(nèi)有害蛋白的積累來維持晶狀體細(xì)胞的自噬功也許能有助于闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。

2 創(chuàng)傷性白內(nèi)障

創(chuàng)傷性白內(nèi)障是由于晶狀體受傷特別是穿孔傷之后, 房水由囊膜進(jìn)入晶體, 晶體內(nèi)水溶性蛋白大量丟失，DNA合成以及細(xì)胞分裂減慢，引起晶狀體受傷部位混濁并很快波及到晶體的周邊部，最終導(dǎo)致整個(gè)晶體的混濁。目前最常采用針頭刺穿晶狀體或刺劃晶狀體前囊形成創(chuàng)傷，控制白內(nèi)障形成過程以建立創(chuàng)傷性白內(nèi)障的模型。Xiao等[15]用注射器針頭穿刺晶狀體前囊，快速誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可建立晶狀體囊膜損傷的小鼠模型。該模型可用于前囊下白內(nèi)障和晶體后囊混濁的生物學(xué)研究以及新療法的療效研究。Kwon等[16]用外科損傷法建立了干眼和非干眼型小鼠白內(nèi)障模型, 用以評(píng)估白內(nèi)障手術(shù)后角膜炎癥細(xì)胞浸潤、血管和淋巴管的生成, 表明干眼型的小鼠白內(nèi)障模型容易誘發(fā)血管和淋巴管的形成，并且更易誘發(fā)眼角膜組織的炎癥反應(yīng)，因此建議干眼型白內(nèi)障手術(shù)后應(yīng)輔以抗炎治療以減少眼角膜和前房的炎癥。

3 紫外線誘導(dǎo)白內(nèi)障

紫外輻射是晶狀體混濁化及白內(nèi)障形成的主要外部因素之一, 其機(jī)制是紫外線激發(fā)晶狀體產(chǎn)生自由基, 加劇氧化應(yīng)激過程, 損傷細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)等。構(gòu)建該類型白內(nèi)障動(dòng)物模型時(shí)將動(dòng)物麻醉固定后，采用光照強(qiáng)度已知且恒定的紫外燈照射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼球。Galichanin等[17]建立了一種用B型紫外線(ultraviolet ray B, UVR-B)誘導(dǎo)白內(nèi)障的大鼠模型, 并用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄PCR探索該類型白內(nèi)障的分子機(jī)制, 提供了一種研究UVR-B誘導(dǎo)的白內(nèi)障發(fā)生過程中分子特征的方法。Mody等[18]建立了一種檢測(cè)豚鼠對(duì)UVR-B誘發(fā)的白內(nèi)障最大耐受劑量的方法, 并比較了豚鼠、大鼠和家兔對(duì)UVR-B的敏感性, 為UVR-B誘導(dǎo)豚鼠白內(nèi)障毒性的估計(jì)提供一個(gè)合適的方法。Ishikawa等[19]利用衰老標(biāo)記蛋白-30(SMP30)基因敲除的小鼠為模型探究維生素C對(duì)UVR-B誘導(dǎo)的晶狀體渾濁的影響, 顯示維生素C的缺乏可增加小鼠對(duì)UVR-B誘導(dǎo)白內(nèi)障的易感性。Stefano等[20]用不同強(qiáng)度的輻射劑量照射Patched 基因雜合的小鼠, 研究輻射誘發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。他認(rèn)為闡明此類白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制,除了要分析晶狀體上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及隨后的纖維化改變之外, 還要分析潛在的遺傳因素對(duì)此類白內(nèi)障的影響。De Stefano等[21]研究顯示Patched1 (Ptch1)基因雜合的小鼠可自發(fā)形成白內(nèi)障, 且對(duì)電離輻射誘導(dǎo)形成白內(nèi)障更敏感, 對(duì)該基因型小鼠進(jìn)行2 Gy X線輻射劑量處理可誘發(fā)白內(nèi)障。研究顯示當(dāng)Ptch1缺乏時(shí), 其配體Shh協(xié)同轉(zhuǎn)化生長因子B共同激活上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化, 促進(jìn)Ptch1相關(guān)的白內(nèi)障的發(fā)病。認(rèn)為該小鼠模型是一種新型有效的白內(nèi)障動(dòng)物模型, 可用于研究白內(nèi)障形成的分子機(jī)制。

4 糖性白內(nèi)障

糖性白內(nèi)障是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，Zhang 等[22]用硫醇轉(zhuǎn)移酶(TTase)基因敲除小鼠研究TTase在氧化還原平衡以及抗氧化應(yīng)激過程中的作用，顯示TTase缺乏在高糖誘導(dǎo)的小鼠白內(nèi)障形成的早期階段起作用，表明糖性白內(nèi)障與抗氧化酶活性下降有關(guān)。

該動(dòng)物模型形成主要通過腹腔、球后或皮下注射一定濃度的半乳糖溶液。Ji等[23]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的半乳糖溶液注射21 日齡大鼠, 18 d后造成大鼠半乳糖性白內(nèi)障模型，該模型大鼠醛糖還原酶基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，在造模后6 d達(dá)到最高。認(rèn)為該模型大鼠可用于研究糖性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制和抗白內(nèi)障候選藥物的篩選。鏈脲佐菌素(STZ)是從鏈霉菌屬菌株分離出的抗生素 ,可誘導(dǎo)大鼠、豚鼠等產(chǎn)生Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型。Patil等[24]給出生后2 d大鼠注射鏈脲佐菌素(STZ)造成糖尿病模型，研究前驅(qū)糖尿病和白內(nèi)障病因的之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示30%的大鼠為高血糖癥并形成白內(nèi)障，認(rèn)為氧化應(yīng)激和多元醇旁路可能參與耐糖量減低相關(guān)的晶狀體異常的形成，且該大鼠模型可用于耐糖量減低相關(guān)晶狀體異常的研究。郝麗娜等[25]采用STZ制作大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型，表明葛根素腹腔注射和球旁注射給藥途徑對(duì)糖尿病性大鼠晶狀體上皮細(xì)胞均具有保護(hù)作用，且療效相當(dāng)。Wang等[26]通過腹腔注射STZ誘導(dǎo)大鼠的糖性白內(nèi)障模型，并向患糖尿病的大鼠注射丁苯酞(NBP)，顯示丁苯酞通過抑制氧化應(yīng)激延遲糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

5 硒性白內(nèi)障

亞硒酸鹽可與房水中少量的H2O2反應(yīng)生成不同形式的活性氧，改變晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致晶狀體混濁。該動(dòng)物模型的建立主要是通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服或注射高濃度亞硒酸鈉溶液，目前建模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、大鼠以及家兔。氧化應(yīng)激通過轉(zhuǎn)化生長因子-β激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)在白內(nèi)障的形成過程中起關(guān)鍵作用，Lee等[27]用亞硒酸鈉誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障模型研究TG2是否參與該白內(nèi)障模型的形成以及TG2抑制劑(半胱胺)是否能抑制該模型的形成，結(jié)果顯示半胱胺可抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障形成，認(rèn)為半胱胺可作為藥物干預(yù)以預(yù)防或延緩白內(nèi)障的形成。

6 體外誘導(dǎo)白內(nèi)障

體外誘導(dǎo)白內(nèi)障模型是在不同條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物晶狀體進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。韓笑等[28]用不同濃度的高糖溶液處理人的晶狀體上皮細(xì)胞并檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)的變化, 結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響SUMO mRNA表達(dá), 推測(cè)SUMO參與高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷過程。李平華等[29]用過氧化氫處理體外培養(yǎng)的家兔晶狀體以建立H2O2體外氧化損傷性白內(nèi)障模型，并檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率以及Fas蛋白表達(dá)。結(jié)果表明過氧化氫可能是通過上調(diào)Fas蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，參與白內(nèi)障的發(fā)病。Sampath 等[30]用δ-過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)激動(dòng)劑處理體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體, 誘導(dǎo)體外白內(nèi)障模型。他們認(rèn)為晶體體外培養(yǎng)可以用來評(píng)估PPAR激動(dòng)劑誘導(dǎo)白內(nèi)障的潛力，并研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。Li等[31]用白藜蘆醇處理體外培養(yǎng)的人和豬的晶狀體上皮細(xì)胞，顯示白藜蘆醇預(yù)防晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是通過表達(dá)Forkhead box O (FoxO1A, FoxO3A,and FoxO4)介導(dǎo)，他們認(rèn)為該方法對(duì)研究氧化相關(guān)的晶狀體病如白內(nèi)障形成的研究具有重要意義。Du等[32]用ZnCl2處理體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞，表明適當(dāng)鋅濃度的Zn2+對(duì)體外培養(yǎng)的人眼晶狀體上皮細(xì)胞輻射損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制為Zn2+降低線粒體功能障礙和活性氧過度產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，從而維持細(xì)胞的正常生理功能。

7 白內(nèi)障模型構(gòu)建的評(píng)價(jià)指標(biāo)

白內(nèi)障動(dòng)物模型構(gòu)建后，通過觀察晶狀體的渾濁度和測(cè)定晶狀體細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的生化指標(biāo)確定動(dòng)物模型的質(zhì)量。其中，晶狀體渾濁度分類方法較多，以世界衛(wèi)生組織白內(nèi)障晶狀體渾濁標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)(1995)為例: 晶狀體渾濁Ⅰ期: 晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)有細(xì)點(diǎn)狀渾濁，并排列成環(huán)形，可伴有空泡; Ⅱ期: 晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)盤狀渾濁且伴有空泡，嚴(yán)重者在盤狀渾濁的周圍出現(xiàn)不規(guī)則的條紋狀渾濁向赤道部延伸，盤狀渾濁也可向皮質(zhì)深層擴(kuò)展, 可呈寶塔狀外觀，前極部前囊下皮質(zhì)內(nèi)也可出現(xiàn)細(xì)點(diǎn)狀渾濁及空泡，視力可能減退; Ⅲ期:晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)程蜂窩狀渾濁，后極部較致密，向赤道部逐漸稀薄，伴有空泡，可有彩虹點(diǎn), 前囊下皮質(zhì)內(nèi)渾濁加重, 有不同程度的視覺障礙; Ⅳ期: 晶狀體完全渾濁, 嚴(yán)重視力障礙。

測(cè)定晶狀體勻漿混懸液的生化指標(biāo): 建模成功后，晶狀體中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)含量應(yīng)明顯增大[33]; 酶促類抗自由基指標(biāo)的氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平應(yīng)顯著下降[34,35]。

8 展望

隨著不同類型白內(nèi)障動(dòng)物模型的建立以及基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前對(duì)白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大提高，已研發(fā)出許多治療白內(nèi)障的藥物和外科學(xué)方法。但白內(nèi)障發(fā)病的確切機(jī)制目前仍未完全闡明，藥物也只能在一定程度上對(duì)白內(nèi)障起到治療作用而不能治愈。根據(jù)病因和發(fā)病進(jìn)程建立相應(yīng)白內(nèi)障動(dòng)物模型，仍是研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制、篩選藥物靶點(diǎn)和完善手術(shù)方案的重要平臺(tái)。大鼠、小鼠由于體型小易于固定、廉價(jià)且易飼養(yǎng)等特點(diǎn)被用于構(gòu)建各種疾病動(dòng)物模型。樹鼩作為接近靈長類的小型哺乳動(dòng)物，具有飼養(yǎng)周期短、經(jīng)濟(jì)成本較低的優(yōu)點(diǎn); 且具有發(fā)達(dá)的視覺系統(tǒng)、較大的眼睛、易于眼部、的手術(shù)操作等優(yōu)勢(shì)。與其他動(dòng)物相比，樹鼩晶狀體自發(fā)熒光值受年齡影響較小, 在晶狀體病變的研究中是較好的動(dòng)物模型[36]，在白內(nèi)障動(dòng)物模型構(gòu)建中有一定的應(yīng)用潛力。由于晶狀體細(xì)胞體外培養(yǎng)維持時(shí)間較短，目前仍缺乏白內(nèi)障發(fā)病的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，尤其是亞細(xì)胞水平。采用永生化細(xì)胞系雖不能完全模擬完整的晶狀體，但可以從亞細(xì)胞水平進(jìn)行長期實(shí)驗(yàn)，也許可用于研究白內(nèi)障發(fā)病過程晶狀體細(xì)胞中基因表達(dá)水平的變化。

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