CMU/1和CMU/2長(zhǎng)爪沙鼠與F344大鼠及BALB/c小鼠4項(xiàng)凝血指標(biāo)分析

李 迎, 杜小燕, 崔曉霞, 馬蘭芝, 尚世臣,趙志兵, 趙 權(quán), 李桂軍, 王冬平, 陳振文

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 北京 100071;2. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部, 北京 100069;3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118)

在臨床上血栓與止血檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用，血栓與出血不僅涉及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué), 且與多個(gè)臨床學(xué)科(包括血液科、呼吸消化科、心血管科神經(jīng)科)的疾病密切相關(guān)。凝血酶原時(shí)間(PT)、部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)和凝血酶時(shí)間(TT)是臨床診斷出血和血栓性疾病的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，也是抗凝血藥物用量監(jiān)測(cè)，療效評(píng)估和手術(shù)前預(yù)測(cè)凝血功能的重要指標(biāo)[1]。凝血4項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)在內(nèi)源性、外源性凝血因子缺乏或減少的實(shí)驗(yàn)中是重要依據(jù)。在相關(guān)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，常常要觀測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上述4項(xiàng)指標(biāo)。本文針對(duì)腦缺血模型近交系CMU/1與CMU/2長(zhǎng)爪沙鼠和常用近交系F344大鼠及BALB/c小鼠的4項(xiàng)凝血指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與比較，旨在了解腦缺血模型近交系長(zhǎng)爪沙鼠的特性，為其實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

CMU/1 長(zhǎng)爪沙鼠36只, CMU/2長(zhǎng)爪沙鼠12只,均為3～4月齡，普通級(jí)，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; 50只近交系F344大鼠，40只近交系BALB/c小鼠，均為清潔級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍)2012-0004]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由采食和飲水，室溫為20～24 ℃。本實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. AEEI-2017-032)。

1.2 儀器設(shè)備及主要試劑

MC-4000四通道血凝儀,由德國(guó)美創(chuàng)公司生產(chǎn)，配套試劑由上海太陽生物技術(shù)有限公司提供;質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%的檸檬酸鈉抗凝劑，由北京雷根生物技術(shù)有限公司提供; 低溫離心機(jī)(CF16RX)，日本Hitachi公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集和處理 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12～24 h，自由飲水。眼眶靜脈取血900 μL, 置于含100 μL抗凝劑試管，即血液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%檸檬酸鈉溶液以9∶1的比例充分顛倒混勻, 7 000 r/min離心15 min制備血漿。

1.3.2 樣品檢測(cè)及指標(biāo) 將用蒸餾水復(fù)溶的試劑和待測(cè)標(biāo)本置于預(yù)熱槽至37 ℃。PT檢測(cè): 于37℃孵育60 s, 然后加入預(yù)溫的100 μL試劑; APTT檢測(cè):準(zhǔn)備50 μL血漿與50 μL APTT試劑，預(yù)溫180 s，之后加入50 μL CaCl2試劑; FIB檢測(cè): 準(zhǔn)備10 μL血漿和90 μL IBS試劑，預(yù)溫后加入50 μL FIB試劑;TT檢測(cè): 準(zhǔn)備100 μL血漿，加入50 μL預(yù)溫好的TT試劑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 使用單因素方差分析對(duì)測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CMU/1的PT、FIB與F344大鼠差異顯著，APTT與BALB/c小鼠和F344大鼠差異顯著; CMU/2的PT、ATPP與F344大鼠差異顯著; F344大鼠的PT、APTT與BALB/c小鼠差異顯著; CMU/1和CMU/2彼此間差異不顯著(表1)。CMU/1的APTT、FIB和CMU/2的FIB個(gè)體間差異較大。

表 1 各組動(dòng)物4項(xiàng)凝血指標(biāo)Table 1 Four blood coagulation factors of animals in each group

3 討論

血液凝固是由一系列凝血因子按一定順序相繼激活酶解而生成凝血酶，最終使FIB變?yōu)槔w維蛋白的過程。一般分為外源性凝血途徑、內(nèi)源性凝血途徑和凝血共同途徑。目前，臨床主要用凝血4項(xiàng)(PT、APTT、TT、FIB)測(cè)定來反映體內(nèi)凝血系統(tǒng)的狀況。

PT主要用于檢測(cè)外源性凝血系統(tǒng)有無障礙，是監(jiān)測(cè)口服抗凝劑的首選指標(biāo)。PT延長(zhǎng)常見于先天性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ缺乏癥，PT縮短見于先天性凝血因子Ⅴ增多，血栓性疾病等。APTT是用于檢測(cè)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的篩選試驗(yàn)，能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的水平; 也可用于相關(guān)因子抑制物的測(cè)定和肝素治療的監(jiān)測(cè)，其準(zhǔn)確性測(cè)定即可取得最佳抗凝療效，又無嚴(yán)重的出血風(fēng)險(xiǎn)[2]。FIB用于纖溶的篩查[3]，通過凝血酶的作用使FIB轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。主要由肝臟合成，是凝血酶作用的底物，在凝血酶水解下形成肽A和肽B，最后形成不溶性的纖維蛋白以達(dá)到止血作用。TT主要代表血漿纖維蛋白原的反應(yīng)性，用于測(cè)定凝血共同途徑纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程中，是否存在纖維蛋白原異常及是否發(fā)生纖溶和是否存在抗凝物質(zhì)的情況[4,5]。

通過對(duì)上述動(dòng)物4項(xiàng)凝血指標(biāo)的測(cè)定可以看出,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種不同，指標(biāo)間差異較大。PT值和APTT值CMU/1、CMU/2以及BALB/c小鼠都與F344大鼠差異顯著，CMU/1與BALB/c小鼠的APTT值差異顯著，F(xiàn)IB值CMU/1與F344大鼠差異顯著。王迎等[6]報(bào)道的SD大鼠、Wistar大鼠、ICR小鼠及長(zhǎng)爪沙鼠4項(xiàng)凝血因子指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示, 不同品種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的同一指標(biāo)間差異較大，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是一致的。但是CMU/1、CMU/2和BALB/c小鼠的TT值顯示+++，表明該測(cè)定方法不在線性范圍內(nèi)，未測(cè)出結(jié)果。是否與離心轉(zhuǎn)速、測(cè)試比例等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步探討研究。紅細(xì)胞沉淀不徹底會(huì)干擾血漿的測(cè)定, 標(biāo)本離心不好，血小板去除不徹底都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還會(huì)受到動(dòng)物狀態(tài)、樣品采集后放置時(shí)間及處理、抗凝劑與試劑、設(shè)備、儀器等多方面因素的影響[7-10]。因此在實(shí)際工作中，應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程進(jìn)行操作，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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