卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)規(guī)范

梁珊珊，黃國(guó)寧，孫海翔，范立青，馮云，沈浣，劉平，盧文紅，張?jiān)粕?，王秀霞，張松英，黃學(xué)鋒，伍瓊芳，全松，周從容，周燦權(quán)，師娟子，孫瑩璞，滕曉明

(中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)第四屆委員會(huì))

背 景

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)自1992年第一例嬰兒誕生起，為輔助生殖技術(shù)(ART)開(kāi)辟了新的領(lǐng)域，并在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。為推動(dòng)ICSI技術(shù)在我國(guó)應(yīng)用的健康發(fā)展，規(guī)范ICSI技術(shù)的操作流程，中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的文獻(xiàn)，參考國(guó)外現(xiàn)行應(yīng)用的相關(guān)指南(ESHER 2015 Revised guidelines for good practice in IVF laboratories；NICE 2014 Fertility problems Quality standard)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)“人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)”，結(jié)合參加編寫(xiě)專家的經(jīng)驗(yàn)，廣泛征求胚胎實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員意見(jiàn)的基礎(chǔ)上，基于實(shí)驗(yàn)室和輔助生殖技術(shù)后代安全性立場(chǎng)考慮，經(jīng)過(guò)交流討論達(dá)成了本ICSI操作技術(shù)規(guī)范。

方法和內(nèi)容

本技術(shù)規(guī)范內(nèi)容包含ICSI基本條件、操作前準(zhǔn)備、操作過(guò)程、特殊情況處理。

一、基本條件

1.配子操作環(huán)境：與IVF實(shí)驗(yàn)室配子/胚胎操作區(qū)域環(huán)境控制原則相同，并需按照技術(shù)規(guī)范，采取措施降低操作區(qū)域內(nèi)VOC含量。

2.人員：ICSI技術(shù)人員需按照規(guī)范要求在輔助生殖技術(shù)培訓(xùn)基地接受培訓(xùn)并考核合格，再經(jīng)過(guò)動(dòng)物配子和人類配子操作訓(xùn)練后，具備熟練的顯微操作及體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技能。在后續(xù)工作中還需進(jìn)行持續(xù)質(zhì)控。

3.儀器：除IVF技術(shù)常規(guī)儀器，需要增加倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)。建議配置2套，以備檢修。顯微操作系統(tǒng)可以是液壓和/或氣壓系統(tǒng)。

開(kāi)展男科顯微手術(shù)取精的中心需要配備相關(guān)顯微顯像及手術(shù)設(shè)備，開(kāi)展凍精復(fù)蘇后ICSI的中心需配備相關(guān)的設(shè)備。

4.耗材和試劑：除IVF常規(guī)用品，還需要適宜管徑的拆卵針(內(nèi)徑分別為450～500 μm、150～200 μm、130～140 μm的毛細(xì)管)、ICSI操作皿、無(wú)需CO2平衡的配子操作液(以下簡(jiǎn)稱操作液)、透明質(zhì)酸酶、精子制動(dòng)試劑(如PVP)。

注射針和固定針有0°、20°、25°、30°、35°等多種角度，建議采用30°角。注射針的內(nèi)徑一般為5 μm，外徑為7 μm；固定針內(nèi)徑有15 μm和25 μm，外徑均為100 μm。

開(kāi)展冷凍精子ICSI的中心需要精子冷凍及解凍試劑盒。

二、ICSI操作的準(zhǔn)備

1.卵母細(xì)胞的脫顆粒細(xì)胞：卵丘復(fù)合物移入透明質(zhì)酸酶中，顆粒細(xì)胞松散后移入配子洗滌液中，用內(nèi)徑適宜的拆卵針?lè)磸?fù)吹吸，使顆粒細(xì)胞脫落。

注：透明質(zhì)酸酶使用參考試劑說(shuō)明書(shū)，盡量減少透明質(zhì)酸酶和卵子接觸的時(shí)間(因各種酶制劑活性成分不同，如說(shuō)明書(shū)中提及此時(shí)間需控制在1 min之內(nèi)，則需嚴(yán)格遵照；如未提及具體時(shí)間限制，亦不可過(guò)久)；脫顆粒后充分洗滌卵子[1]。如果卵子數(shù)較多(一般超過(guò)10枚以上)，建議分批處理。

2.卵母細(xì)胞評(píng)估：去除顆粒細(xì)胞后，觀察卵母細(xì)胞。卵周間隙見(jiàn)第一極體提示卵子核成熟，可用于ICSI。如觀察發(fā)現(xiàn)GV期、MI期、特大極體(大于14 μm)、巨卵(卵子直徑大于200 μm)應(yīng)不予ICSI[1]；發(fā)現(xiàn)多極體、胞漿空泡等需記錄；發(fā)現(xiàn)卵周間隙過(guò)大、極體碎裂及可疑多極體的卵子如有條件可使用紡錘體觀測(cè)儀選擇穿刺點(diǎn)。

全部卵子均為未成熟卵子時(shí)考慮行IVM后ICSI(實(shí)驗(yàn)室學(xué)組專家共識(shí)試行指南2016)。

3.注射皿準(zhǔn)備：可將精子制動(dòng)液滴(如PVP微滴)置于注射皿中央，周圍放置配子液微滴。用礦物油覆蓋微滴。將處理后的精子懸液移入微滴，卵子逐個(gè)移入其余微滴。

注：每皿注射卵子數(shù)不宜過(guò)多(原則上可根據(jù)操作熟練程度，預(yù)計(jì)培養(yǎng)箱外操作時(shí)間不超過(guò)10 min，減少失溫對(duì)卵子產(chǎn)生的不利影響)。

4.操作系統(tǒng)的調(diào)試：恒溫臺(tái)溫度控制在37℃。調(diào)節(jié)注射針和固定針的手柄放置正中位置，旋鈕的指針處于正中位置。根據(jù)ICSI注射針和固定針的規(guī)格角度調(diào)試兩側(cè)持針臂的角度。裝針前保證兩側(cè)持針臂在同一矢狀面，然后在低倍鏡下安裝注射針和固定針，之后轉(zhuǎn)換高倍鏡，再調(diào)整注射針和固定針的水平位置和垂直位置。

注：顯微控制系統(tǒng)非工作狀態(tài)時(shí)，持針臂抬高。液壓系統(tǒng)更換時(shí)管道內(nèi)不進(jìn)空氣，保證順利通暢。建議顯微操作時(shí)使用目鏡10倍，物鏡20倍。

5.精子處理：射出精液處理同常規(guī)IVF，收集活動(dòng)精子備用。冷凍精子解凍后應(yīng)用，參考精子冷凍解凍試劑盒說(shuō)明。附睪手術(shù)所取精子可直接裝入注射皿或洗滌后使用，睪丸組織需要機(jī)械法拆碎曲精小管，制成精子懸液備用。

注：當(dāng)精液中紅細(xì)胞數(shù)量較多，精液粘稠度高或逆行射精標(biāo)本建議行非連續(xù)密度梯度離心處理。

三、ICSI操作

1.ICSI時(shí)機(jī)：正常受精需要卵母細(xì)胞核成熟以及胞質(zhì)成熟。胞核成熟明顯標(biāo)志為第一極體排出，但胞質(zhì)成熟更為復(fù)雜[2]。在自然狀態(tài)下，兩者應(yīng)該同步，但在促排周期中表現(xiàn)非同步[3]。在IVF或ICSI前的培養(yǎng)，能使胞質(zhì)進(jìn)一步成熟。但長(zhǎng)期停留在MII階段未受精，顆粒細(xì)胞凋亡可能使得卵子發(fā)生老化[4]。ICSI取卵、脫顆粒細(xì)胞、注射操作之間的最佳時(shí)間間隔尚無(wú)明確定論?，F(xiàn)階段證據(jù)指出，HCG后>36 h取卵，帶顆粒細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)局更好；脫顆粒>5 h后ICSI對(duì)結(jié)局會(huì)有負(fù)面影響[5-6]。建議HCG后38～40 h行ICSI授精。

2.精子制動(dòng)：在精子微滴中盡量選擇形態(tài)正常的活動(dòng)精子，用ICSI注射針轉(zhuǎn)移到PVP微滴中。用ICSI注射針將精子的尾部中段1/3處垂直壓在培養(yǎng)皿底部，輕柔拉動(dòng)，劃破尾部胞膜后精子尾遠(yuǎn)端停止擺動(dòng)，近頭端可仍稍有擺動(dòng)，有時(shí)可見(jiàn)明顯折痕。注：不推薦在精子微滴中或在不加PVP的操作液中進(jìn)行制動(dòng)。精子制動(dòng)后盡快注射。

3.注射時(shí)第一極體位置：第一極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)，注射點(diǎn)3點(diǎn)時(shí)，精子頭或者尾先進(jìn)入胞質(zhì)不影響受精率和優(yōu)胚率[7]。各種研究提示，精子與紡錘體位置近可能提高受精及優(yōu)胚率[8-10]。

推薦注射時(shí)第一極體位于11～12點(diǎn)。

4.卵胞漿內(nèi)單精子注射：將制動(dòng)后的精子吸入注射針，使精子頭位于注射針尖端。將含精子的顯微注射針和固定針移入含卵子的微滴中。用固定針固定卵子，使第一極體位于11～12點(diǎn)位置。將ICSI注射針穿過(guò)透明帶，進(jìn)入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。穿刺針頭部過(guò)中線位置后緩慢回吸胞漿液至突然加速，提示卵母細(xì)胞破膜，停止回吸，將精子慢慢注入卵子中心區(qū)域，精子頭部進(jìn)入胞質(zhì)后，稍作停頓，再緩慢退出注射針。固定針釋放卵子后退出液滴。不推薦在注射針內(nèi)同時(shí)間隔一定距離吸入多條精子進(jìn)行ICSI，雖然可以縮短注射時(shí)間，但增加了ICSI操作難度和風(fēng)險(xiǎn)。

注射后的卵子移入培養(yǎng)皿內(nèi)，放入培養(yǎng)箱，同IVF胚胎培養(yǎng)。

注：盡量減少注射入卵胞質(zhì)內(nèi)的PVP。

四、特殊情況處理

1.MI卵：臨床上約有15%卵子處在未成熟階段，但因臨床和技術(shù)難度，IVM技術(shù)仍然只在少數(shù)中心作為常規(guī)操作[11]。2010年研究提示，經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)成熟的卵子非整倍體率100%，經(jīng)4～8 h培養(yǎng)成熟時(shí)非整倍體率為66.6%，短期(2 h)培養(yǎng)成熟時(shí)非整倍體率接近正常PGD(40.3%)[12]。盡管使用MI成熟后受精的胚胎可以增加數(shù)量，但由于高的非整倍體率和臨床結(jié)局不良，需要考慮非整倍體篩查[13]。

2.卵子退化：ICSI后卵子退化率可在5%～19%[14-15]，目前一般在5%左右?？砂l(fā)生在進(jìn)針/出針時(shí)胞漿溢出，或者第二天檢查受精時(shí)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)固縮[16]。

2006年研究提示，D3 FSH水平、獲得成熟卵數(shù)、HCG日E2水平是卵子退化率的獨(dú)立顯著相關(guān)因素[16]。發(fā)生卵胞膜突然破裂、破裂困難[14]、抽針后無(wú)針道[17]可能與卵子退化率增高有關(guān)，提示卵子質(zhì)量差。透明帶異常、細(xì)胞骨架損傷可能與卵子退化相關(guān)。脫顆粒細(xì)胞不完全時(shí)，雖然可以繼續(xù)胚胎發(fā)育，但也與退化率增高有關(guān)，原因可能是注射時(shí)遮擋視線以及固定困難[18]。

建議使用3～5 μm內(nèi)徑的細(xì)針(常規(guī)使用直徑5～7 μm)，優(yōu)點(diǎn)是卵胞膜損傷小、胞漿吸出少、進(jìn)入的PVP少。建議控制正常形態(tài)MII卵子注射后正常受精率不低于70%，卵子退化率不高于10%。

前次卵胞膜突然破裂、高退化率(>20%)的卵子經(jīng)過(guò)激光輔助孵化(AH)后受精率可增高，胚胎質(zhì)量改善[19]。AH理論上可能誘發(fā)孵出時(shí)囊胚嵌頓，但尚無(wú)單卵雙胎報(bào)道。對(duì)非選擇性患者AH后ICSI并無(wú)明顯益處[20]。

3.裸卵：體外操作時(shí)透明帶丟失而卵胞膜完整，或卵子生成時(shí)透明帶缺如的卵母細(xì)胞稱為裸卵。透明帶先天缺如者可能涉及遺傳異常。裸卵多數(shù)丟棄，但獲卵數(shù)很少的時(shí)候可以培養(yǎng)至囊胚期移植并獲得妊娠[21]。2014年研究135枚裸卵與正常卵子對(duì)比，受精率、卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均無(wú)顯著差異，解凍復(fù)蘇率及活產(chǎn)率、孕周及出生體重?zé)o顯著差異[22]。但不建議卵裂期移植，以避免卵裂球分離。

4.受精失?。篒CSI完全受精失敗少見(jiàn)，發(fā)生率約1%～3%，但即便是精子正常時(shí)也可能發(fā)生[23]。低受精率<30%會(huì)在某些患者身上重復(fù)發(fā)生[24]。

IVF受精失敗時(shí)60%～90%卵子不含精子核，提示主要原因是精子穿透失敗[25]；但I(xiàn)CSI受精失敗時(shí)60%～70%的未受精MII卵子中可見(jiàn)腫脹的精子頭，提示與卵子活化異常有關(guān)；其他原因還有精子頭解聚異常、精子染色質(zhì)解聚異常、紡錘體異常、精子星狀體異常和單純精子注射失誤等[26-27]。

小鼠卵活化實(shí)驗(yàn)(MOAT)可用來(lái)鑒別精子受精能力[28]。受精率可分為低活化率(<20%)、中等(21%～84%)、高(>85%)。精子異常大多表現(xiàn)為低活化率，高活化時(shí)基本可排除精子異常。圓頭精子癥患者理論上AOA結(jié)局良好。對(duì)于MOAT高活化率組受精低下的患者可能還有其他因素，建議部分卵子AOA[28-29]。

卵子人工激活(AOA)可對(duì)精子及卵子活化異常起作用。顯微操作改良、物理(電)、化學(xué)方法等方案多樣。

人類卵子人工激活安全性研究現(xiàn)有2014年報(bào)道21名經(jīng)AOA出生的已超過(guò)3歲的子代隨訪，新生兒期指標(biāo)、行為及神經(jīng)發(fā)育在正常范圍內(nèi)[30]。更加全面的安全性討論尚需病例積累及長(zhǎng)期隨訪。

5.圓頭精子：所有精子均為圓頭精子患者臨床罕見(jiàn)，發(fā)生率<0.1%。特征是精子頭為圓型，頂體缺失，核胞膜異常，中段缺陷。DNA碎片顯著增高，但非整倍體率輕微升高[31-32]。ICSI技術(shù)出現(xiàn)之前，此類患者不育。但常規(guī)ICSI后仍受精率低，出生率低。

2013年34名圓頭精子癥患者AOA化學(xué)法受精率正常。而無(wú)論是常規(guī)ICSI還是AOA后，DPY19L2突變患者比非突變者受精率均稍高。對(duì)部分圓頭精子的患者建議部分卵子AOA，鑒別卵子異常[33]。

6.不動(dòng)精子：高倍鏡下持續(xù)觀察精子未見(jiàn)任何主動(dòng)運(yùn)動(dòng)的稱為不動(dòng)精子。射出精子如100%不動(dòng)，可行睪丸穿刺盡量取活動(dòng)精子。

鑒別存活精子可采用添加己酮可可堿[34]、低滲腫脹實(shí)驗(yàn)、激光法[35]或機(jī)械法折尾[36]等，存活精子可表現(xiàn)為尾部腫脹或因刺激發(fā)生卷曲及抖動(dòng)。注意：經(jīng)冷凍解凍后精子尾部可自發(fā)腫脹卷曲，不能直接認(rèn)定為活精子。

7.其他：針對(duì)一些可能受精率低下的特殊病例時(shí)，會(huì)選取除常規(guī)IVF及ICSI之外的其他授精方式。例如一半卵子IVF/一半卵子ICSI的half-ICSI方式，或是加精后當(dāng)日去除顆粒細(xì)胞觀察第二極體排出情況的rescue-ICSI，ICSI的操作過(guò)程無(wú)特殊要求。

結(jié) 語(yǔ)

本規(guī)范的適用范圍為我國(guó)實(shí)施卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的生殖中心。制定本規(guī)范的目標(biāo)是協(xié)助各中心的胚胎實(shí)驗(yàn)室制定適合的標(biāo)準(zhǔn)化操作常規(guī)，指導(dǎo)臨床胚胎學(xué)家應(yīng)對(duì)可能遇到的問(wèn)題，獲得更好的臨床結(jié)局。