外泌體在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用的研究進(jìn)展

宋麗杰,王 麗,王 捷

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科,中國(guó)廣東廣州510010)

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過程：腫瘤細(xì)胞惡性增殖,失去對(duì)基底膜的黏附作用,突破基底膜進(jìn)入到血管或淋巴管中,其中絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中被清除,只有約0.01%的循環(huán)腫瘤細(xì)胞到達(dá)待轉(zhuǎn)移的位點(diǎn),并開始增殖形成新的腫瘤灶。以往有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究多集中于腫瘤細(xì)胞本身,近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境以及遠(yuǎn)端細(xì)胞之間的信息交流也發(fā)揮著重要作用。外泌體(exosome)是一種納米級(jí)的囊泡,幾乎所有物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物都可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外,并且外泌體在細(xì)胞與遠(yuǎn)端細(xì)胞之間,以及細(xì)胞與微環(huán)境之間的信息交流方面也發(fā)揮了重要作用。研究者們發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源的外泌體通過攜帶各種功能性分子參與了許多重要的生理及病理過程,尤其是在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用。本文將重點(diǎn)闡述外泌體在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮的作用。

1 外泌體簡(jiǎn)介

1.1 外泌體的來源

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于成熟哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞當(dāng)中,是40～100 nm的圓形或橢圓形囊泡[1]。1981年,Trams等[2]首次將此納米級(jí)的囊泡命名為外泌體。外泌體可由細(xì)胞內(nèi)多泡內(nèi)涵體與細(xì)胞膜融合之后分泌,其形成過程涉及到許多信號(hào)分子的緊密調(diào)控,目前有關(guān)外泌體分泌的具體分子機(jī)制還不太清楚,但Ostrowski等[3]發(fā)現(xiàn)Rab蛋白家族成員如Rab27a和Rab27b在外泌體的分泌過程起著重要的調(diào)控作用,并且不同類型的細(xì)胞其激活外泌體分泌的方式不同。

外泌體可由多種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌,并且體外培養(yǎng)的細(xì)胞也可分泌外泌體。外泌體能夠穩(wěn)定地存在于尿液、唾液、乳汁、血液、腦脊液、羊水和腫瘤積液等多種體液當(dāng)中,而且在腫瘤微環(huán)境中特別豐富[4]。起初,研究者們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞排出的“廢物”,并不參與機(jī)體的生理過程。隨著高分辨率成像和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的生物活性分子在細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)過程發(fā)揮了重要作用[5]。

1.2 外泌體的結(jié)構(gòu)

外泌體由脂質(zhì)雙分子層包裹,不含細(xì)胞器,包含有多種蛋白質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)。外泌體的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)不但賦予外泌體一定的形狀,并且能夠保護(hù)其內(nèi)在的物質(zhì)免遭外界環(huán)境的破壞。外泌體包含的蛋白質(zhì)分為兩類：一是保守蛋白質(zhì),即所有外泌體都含有,與外泌體的分泌調(diào)控相關(guān),如CD81、CD9、CD63,常被作為外泌體表面標(biāo)志物;二是因分泌細(xì)胞不同而特有的蛋白質(zhì),例如網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的外泌體中富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,這類蛋白質(zhì)常常通過外泌體為載體參與細(xì)胞間的通訊活動(dòng)。外泌體還包含一些核酸類物質(zhì)：DNA和RNA,其中研究最多的為miRNA。Valadi等[6]于2007年首次證明miRNA和mRNA可通過外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞,并且從人體唾液中檢查出來的miRNA大部分集中在外泌體中。外泌體中的mRNA和miRNA可以改變受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá),從而可能影響到受體細(xì)胞在體內(nèi)的生物活性。

2 外泌體與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)

2.1 外泌體與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)信號(hào)。EMT是指腫瘤上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。通過EMT,腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性以及細(xì)胞間的黏附能力,增殖能力下降,而細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)[7]。經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,E-cadherin蛋白表達(dá)下降,而vimentin蛋白表達(dá)升高,并且細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殄F形。這些變化與Snail、Zeb以及Twist信號(hào)途徑的激活有關(guān)。研究表明外泌體在EMT中發(fā)揮了重要作用。EBV(Epstein-Barr virus)感染的鼻咽癌細(xì)胞外泌體含有大量的LMP1(latent membrane protein 1)和 HIF1α (hypoxia-inducible factor 1α)。HIF1α 作用于Snail信號(hào)通路,提高Twist的表達(dá),從而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT。鼻咽癌外泌體的受體細(xì)胞將會(huì)因EMT而具有更強(qiáng)的侵襲能力,同時(shí)LMP1可以降低HIF1α溶酶體途徑的降解,從而引起EMT途徑的激活[8]。膀胱癌細(xì)胞分泌的外泌體可引起尿道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,提高細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[9]。這些外泌體通過TGF-β1途徑誘導(dǎo)尿道上皮細(xì)胞vimentin、Snail和Twist的表達(dá),并且抑制E-cadherin和β-cadherin蛋白的表達(dá)。外泌體miR-23a在肺癌細(xì)胞中通過抑制E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生[10]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌、肺癌以及結(jié)直腸癌細(xì)胞來源的外泌體也具有誘導(dǎo)EMT的作用[11～13]。經(jīng)歷EMT的腫瘤細(xì)胞通過外泌體可以同時(shí)促進(jìn)鄰近細(xì)胞發(fā)生EMT,從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力,促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

2.2 外泌體與低氧微環(huán)境

當(dāng)實(shí)體瘤的大小超過1 cm3,在腫瘤組織的局部區(qū)域會(huì)出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象。低氧環(huán)境對(duì)于促進(jìn)腫瘤的生存和轉(zhuǎn)移非常重要。在低氧狀態(tài)下,多發(fā)性骨髓瘤會(huì)分泌更多的外泌體,其中包含的miR-135b通過直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞中FIH-1(factor-inhibiting hypoxia-inducible factor 1)的生成而促進(jìn)HIF1α的表達(dá),進(jìn)而通過HIF-FIH信號(hào)通路促進(jìn)血管的生成[14]。在乳腺癌模型中,研究發(fā)現(xiàn)低氧可以介導(dǎo)HIF-1因子的活化,從而促進(jìn)外泌體的分泌,使細(xì)胞具有侵襲性[15]。Park等[16]發(fā)現(xiàn)A431腫瘤細(xì)胞在低氧的微環(huán)境中,能夠通過外泌體分泌特定的四分子交聯(lián)體家族蛋白和Alix,從而促進(jìn)血管生成和提高細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能。處于低氧狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞分泌更多的外泌體,能夠提高細(xì)胞的血管生成能力和轉(zhuǎn)移潛能,提示腫瘤細(xì)胞通過分泌外泌體刺激血管生成或促使細(xì)胞轉(zhuǎn)移至更適宜的環(huán)境。

3 外泌體與血管生成和血管通透性

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管的生成及通透性相關(guān)。新生血管對(duì)于腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧份的供應(yīng)十分重要,并且是轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)的重要關(guān)口。研究表明,外泌體通過釋放不同的功能性分子,改變血管的通透性和促進(jìn)血管生成。比如：乳腺癌細(xì)胞外泌體含有miR-105,可以下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá),從而破壞細(xì)胞間的緊密連接,增加內(nèi)皮的通透性,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞透過血管壁發(fā)生肺及骨的轉(zhuǎn)移[17]。最近有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體含有miR-939,其直接靶向內(nèi)皮細(xì)胞的VE-cadherin,從而增加血管的通透性[18]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌含有SDF-1(stromal cell-derived factor-1)的外泌體刺激血管的生成[19]。其中,SDF-1主要通過趨化聚集內(nèi)皮祖細(xì)胞來促進(jìn)血管的生成。此外,外泌體也可以直接將血管生成相關(guān)蛋白質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到基質(zhì)中,影響基質(zhì)蛋白質(zhì)的表達(dá),其中包括表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)mRNA和內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)mRNA[20,21]。

4 外泌體與腫瘤微環(huán)境的形成

4.1 外泌體與腫瘤細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)移

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移部位不是隨機(jī)的,而是腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移器官復(fù)雜的相互作用的結(jié)果。有關(guān)腫瘤靶向轉(zhuǎn)移的假說最早是由Paget于1889年提出的“種子與土壤”學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(種子)只有與宿主環(huán)境(土壤)相適應(yīng)時(shí)才會(huì)形成轉(zhuǎn)移灶[22]。Fidler[23]在1973年支持了該假說,并指出來源于特定腫瘤部位的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移到特定部位的能力。在腫瘤細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移部位之前,預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境已經(jīng)形成。研究發(fā)現(xiàn)來源于胃癌細(xì)胞的外泌體含有EGFR,可以促進(jìn)肝臟組織轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成,EGFR能夠整合進(jìn)入肝臟基質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜上,通過抑制miR-26a/b的表達(dá)來激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)的表達(dá),而HGF通過與轉(zhuǎn)移細(xì)胞C-MET受體的結(jié)合促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[24]。更有研究提示外泌體表面的整合素類型決定著腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移部位,即 αvβ4 和 α6β1 與肺轉(zhuǎn)移相關(guān),αvβ5與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[25]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明人或鼠源親腦、親肺及親肝轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體優(yōu)先與預(yù)轉(zhuǎn)移靶器官的宿主細(xì)胞結(jié)合,激活S100基因表達(dá)及Scr信號(hào)通路,從而對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境進(jìn)行預(yù)處理。

4.2 外泌體與炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)可以刺激腫瘤的生長(zhǎng),并且提前為腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成做好準(zhǔn)備。研究證明外泌體可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),有利于轉(zhuǎn)移灶的形成。在胰腺癌模型中,腫瘤外泌體通過與Kupffer細(xì)胞相互作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肝臟中的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)[26]。Kupffer細(xì)胞攝取外泌體后激活炎癥反應(yīng)以及成纖維途徑,導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶微環(huán)境的形成,該過程依賴MIF信號(hào)通路。MIF能夠介導(dǎo)TGF-β1的生成,TGF-β1可以促進(jìn)纖連蛋白的表達(dá),從而通過纖連蛋白聚集BMDCs(bone marrow-derived cells)至小鼠肝臟組織中,最終誘導(dǎo)肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成,促進(jìn)胰腺癌的肝臟轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)血管生成、細(xì)胞侵襲和基質(zhì)重建。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體通過與巨噬細(xì)胞表面的TLRs(toll-like receptors)結(jié)合,激活 NF-κB,從而引起與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、G-CSF和 CCL2的分泌增多[27]。

4.3 外泌體與細(xì)胞外基質(zhì)的重建

外泌體可以直接作用于間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞,從而改變細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),使其適宜腫瘤細(xì)胞生存。體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)人慢性淋巴細(xì)胞白血病分泌的外泌體作用后,其細(xì)胞增殖及遷移能力增強(qiáng),并且細(xì)胞炎性因子的釋放增加,從而有助于腫瘤適宜微環(huán)境的形成[28]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)能夠與基質(zhì)相互作用促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血管生成,引起細(xì)胞外基質(zhì)重塑,有助于腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移。研究表明多種腫瘤細(xì)胞(間皮瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞)分泌的包含有TGF-β的外泌體能夠誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分化為CAFs,并伴隨著α-SMA(α-smooth muscle actin)表達(dá)升高, 刺激FGF2、VEGF、HGF和 MMPs等細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[29]。CAFs也可以通過分泌TGF-β1誘導(dǎo) EMT,并且激活TGF-β1-SMAD信號(hào)通路[19]。膽管癌細(xì)胞來源的外泌體作用于間充質(zhì)干細(xì)胞,能夠使其向肌成纖維細(xì)胞分化,并且促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)α-SMA,分泌CXC-1、CCL2和IL-6等細(xì)胞因子,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[30]。肺癌細(xì)胞分泌的含EMMPRIN的外泌體作用于成纖維細(xì)胞,刺激細(xì)胞分泌MMPs,可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[31]。

4.4 外泌體與腫瘤代謝微環(huán)境

腫瘤細(xì)胞抵達(dá)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)之后,需要豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來支持細(xì)胞的增殖。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)腦部星型膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體富含miRNA,能夠降低PTEN基因的表達(dá),從而提高細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)。在腫瘤微環(huán)境中,CAFs分泌的外泌體可以為癌細(xì)胞提供代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如氨基酸、脂質(zhì)、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物等,從而在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[33]。還有研究證明腫瘤細(xì)胞通過分泌富含miR-122的外泌體在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中抑制非腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,為轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)豐富的高葡萄糖環(huán)境,從而維持腫瘤細(xì)胞高水平的糖攝取[34]。

5 外泌體與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸

當(dāng)腫瘤細(xì)胞抵達(dá)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)后,需要逃避機(jī)體的免疫監(jiān)督,腫瘤來源外泌體可建立免疫抑制微環(huán)境來維持細(xì)胞的增殖。腫瘤微環(huán)境中存在大量的髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)等免疫抑制性細(xì)胞,這些細(xì)胞及其活性分子構(gòu)成免疫抑制性局部環(huán)境,抑制抗腫瘤的免疫應(yīng)答。外泌體可以通過抑制效應(yīng)細(xì)胞和激活Treg來降低細(xì)胞免疫反應(yīng)活性。在體外急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)模型中,外泌體通過激活Fas/FasL途徑介導(dǎo)凋亡,從而降低CD8+T細(xì)胞的數(shù)量[35]。腫瘤源性外泌體通過高表達(dá)IL-10、TGF-β1、CTLA-4和 GrB 促進(jìn) CD4+T細(xì)胞的增殖,并使CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg,同時(shí)這些調(diào)節(jié)因子可以降低自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[36]。MDSC是能夠抑制T細(xì)胞活性的不成熟骨髓細(xì)胞。外泌體可以分泌HSP71/TLR2,并通過STAT3途徑和IL-6表達(dá)來激活MDSC[37]。M2型巨噬細(xì)胞具有促腫瘤作用,是主要的TAM。研究證明MDSC源性的外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化,從而抑制T細(xì)胞的功能[38]。外泌體也可以通過介導(dǎo)效應(yīng)物質(zhì)的分泌及聚集,實(shí)現(xiàn)腫瘤的免疫抑制。Clayton等[39]發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞來源的外泌體具有ATP和5’AMP的水解活性,能夠顯著提高腫瘤組織中腺苷酸的水平,腺苷酸能夠抑制T細(xì)胞的活性,從而起到免疫抑制的作用。NKG2D是NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化受體,NKG2D的丟失是腫瘤免疫逃逸的主要因素之一。研究表明,腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能夠下調(diào)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá),起到促腫瘤生長(zhǎng)的作用[40]。此外,非腫瘤細(xì)胞來源的外泌體也能抑制腫瘤的免疫應(yīng)答。比如：腸黏膜細(xì)胞來源的外泌體能夠?qū)⑶傲邢偎?(prostaglandin E2,PGE2)運(yùn)輸?shù)礁闻K中,并且誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞的免疫功能失活[41]。

外泌體除可以抑制細(xì)胞免疫反應(yīng),還可以中和抗腫瘤抗體來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。在體液免疫中,主要是通過抗體依賴的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)作用于腫瘤細(xì)胞。在乳腺癌細(xì)胞中,外泌體表達(dá)HER2和EPCAM抗原,這些抗原能夠與抗體結(jié)合,從而干擾腫瘤細(xì)胞的ADCC[42]。

6 展望

外泌體是具有強(qiáng)大功能的納米級(jí)囊泡,能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與微環(huán)境之間的物質(zhì)運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)。多項(xiàng)研究證明外泌體在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,因此可將外泌體作為腫瘤的診斷標(biāo)志物。研究者通過對(duì)大量的胰腺癌病人血清樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),與正常人相比,胰腺癌病人血清樣本中GPC1(glypican-1)陽性的外泌體占比顯著增高,并且GPC1陽性的外泌體在早期胰腺癌病人的血清中豐度就顯著高于正常人,證明外泌體檢測(cè)可以為早期胰腺癌檢測(cè)提供依據(jù)[43]。

由于外泌體廣泛存在于多種體液樣本中,易于獲取,并且外泌體檢測(cè)可成為一種真正的無創(chuàng)的診斷方法,因此在腫瘤診斷方面具有很大的應(yīng)用潛力。但是有關(guān)外泌體分泌的具體分子機(jī)制還不是很清楚,并且體內(nèi)外泌體的種類繁多,幾乎每種細(xì)胞分泌的外泌體都不同,而且同一細(xì)胞在不同的環(huán)境中分泌的外泌體也有差別。受體細(xì)胞是如何識(shí)別并且接收特定的外泌體也有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于外泌體提取的方法主要有離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、色譜法和新興試劑法,這些方法各有利弊,但若需要滿足臨床檢測(cè)的要求,則需要研究出快速、高效、無雜質(zhì)的提取方法。外泌體在未來的腫瘤治療領(lǐng)域既充滿機(jī)遇又充滿挑戰(zhàn)。