豬瘟病毒NS4B真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

豬瘟（swine fever，CSF），也稱豬霍亂，是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種豬急性、接觸性傳染病，死亡率高達(dá)90%。該病以高熱和出血為主要臨床表現(xiàn)，以小血管壁變性、內(nèi)臟器官多發(fā)性出血、梗塞和壞死等為主要病理特征[1]，對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。目前，我國CSF在發(fā)病及流行特點(diǎn)上出現(xiàn)了新變化，表現(xiàn)為隱性感染范圍廣，發(fā)病無典型癥狀，免疫豬群免疫后抗體水平低，免疫失敗時(shí)有發(fā)生，成為當(dāng)前我國豬瘟防制中的一大難題。基于此，很多學(xué)者認(rèn)為其流行現(xiàn)狀與CSFV遺傳變異有關(guān)，因此很有必要進(jìn)行CSFV流行毒株的序列測定與分析，了解CSFV流行毒株的基因變異情況[4-6]。

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是豬瘟的病原體，長4O～6O nm，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科瘟病毒屬。基因組全長約12.5 kb，僅有一個(gè)開放性閱讀框架（ORF）[4-8]。NS4B是古典豬瘟病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，是一種嚴(yán)重的高致命性疾病病原體。NS4B基因位于基因組偏3’端部分，它在病毒生命周期中的功能尚不清楚。NS4B基因在瘟病毒中較保守，在豬瘟病毒各毒株間有較高的同源性[9-12]。將NS4B基因插入質(zhì)粒載體pEGFP-N3，構(gòu)建攜帶NS4B基因的重組真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究NS4B基因的功能以及豬瘟病毒的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、豬瘟病毒S株、pMD18-T載體、pEGFP-N3質(zhì)粒。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 引物、E×Taq DNA聚合酶、瓊脂糖，DNA marker、溴化乙錠（EB）檢測液。Biospin膠回收試劑盒、TIANpure Midi Plasmid Kit，購自天根生物公司。Ligmix Kit，HindⅢ、BamHⅠ，T4 DNA連接酶購自Takara公司。

1.1.4 儀器 PTC-200型PCR儀（MJ Research公司）、電子天平（型號：ALC-210.3）、松下微波爐（型號：NN-G3641MF）、電泳儀（Bio-Rad公司）、DYY-Ⅲ40B型電泳槽（北京六一儀廠）、離心機(jī)5804R（Eppendorf公司）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 設(shè)計(jì)引物 從GenBank中查找豬瘟病毒NS4B基因序列，由MEGA 4.0分析軟件對序列進(jìn)行分析，閱讀其框架，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1對引物，在上游引物5'端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)和翻譯起始密碼子ATG；在下游引物5'端引入BamHⅠ的酶切位點(diǎn)和翻譯終止密碼子TCA，上下游引物5’端加保護(hù)堿基（GC）[12]。引物由北京華大基因科技有限公司合成。

NS4B（1 041 bp） 無HindⅢ（AAGCTT）和BamHⅠ（GGATTC）

上游引物：5’ GC AAGCTT ATG gctcagggggatgtgcag 3’

下游引物：5’ GC GGATTC TCA tagctggcggatctttcc 3’

1.2.2 PCR產(chǎn)物處理 引物稀釋后進(jìn)行PCR反應(yīng)，退火溫度為55℃，45 s；延伸溫度為72℃，1 min。循環(huán)數(shù)為33。隨后進(jìn)行電泳PCR產(chǎn)物（90 V，30 min）的切膠回收并與T載體16℃連接過夜。

1.2.3 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α 取20 μL連接產(chǎn)物加到含100 μL E.coli感受態(tài)細(xì)胞的Ep管中，混勻，冰置30 min；42℃熱擊（水浴鍋）90 s，冰置2 min；加入800 μL的LB液體培養(yǎng)基，放在37℃水浴100 min涂平板。37℃倒置培養(yǎng)后選5個(gè)單菌落，挑半個(gè)菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測，100 μL PCR體系與之前相同，分裝成5管，每管20 μL（模板為菌落），選條帶較清晰的菌落，挑剩下的半個(gè)菌落，在20 mL的LB液體培養(yǎng)基中振蕩過夜（12～16 h）。提取重組質(zhì)粒。后擴(kuò)增提取質(zhì)粒載體pEGFP-N3。

1.2.4 測序 檢測與T載體連接的NS4B基因是否突變。測序結(jié)果說明基因未突變，可繼續(xù)試驗(yàn)。測序由北京華大基因科技有限公司完成。

1.2.5 轉(zhuǎn)化小提 pMD18-T-NS4B重組質(zhì)粒和質(zhì)粒載體pEGFP-N3，將酶切后的產(chǎn)物并切膠回收目的片段并將酶切后的NS4B基因與質(zhì)粒載體pEGFP-N3連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α涂平板，在LB固體培養(yǎng)基含Kan，37℃進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。后挑取單克隆擴(kuò)增。提取pEGFP-N3-NS4B重組質(zhì)粒并酶切檢測。

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá) 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并用Western Blot檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

對最后提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，獲得NS4B基因片段，表明豬瘟病毒NS4B真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.1 各操作過程檢測結(jié)果 DNAmarker電泳條帶由負(fù)極到正極為：2 000、1 000、750、500、250和100 bp。NS4B基因長度1 041 bp，pMD18-T載體長度2 960 bp，pEGFP-N3質(zhì)粒長度4 700 bp。

2.2 00NNSS 44 BB與PPmmdd1188--TT重組載體測序結(jié)果 NS4B-pMD18-T質(zhì)粒測序，基因在T載體上的插入位點(diǎn)425，T載體上的序列做引物。引物M13-F（347～370）、M13-R（478～500）經(jīng)比對測序峰圖，重組載體構(gòu)建正確。

圖 1 PCR擴(kuò)增目的基因電泳圖Fig.1 Electrophoretic picture of target gene amplified by PCR

圖 2 含有pMD18-T-NS4B重組質(zhì)粒的菌落PCR電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic picture of Colony PCR with pMD18-T-NS4B plasmid.

圖 3 pMD18-T-NS4B重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.3 Enzyme digestion of pMD18-T-NS4B recombinant plasmid

圖 4 pEGFP-N3-NS4B重組質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.4 Enzyme digestion of pEGFP-N3-NS4B recombinant plasmid

2.3 Western BBlloott檢測蛋白表達(dá)

圖 5 Western Blot檢測NS4B蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of NS4B protein expression by Western Blot

3 討論

豬瘟病毒NS4B基因的研究表明，NS4B可能與病毒致病性有關(guān)，具體功能尚不清楚。本試驗(yàn)以豬瘟病毒S株NS4B基因?yàn)檠芯繉ο?，以其與pMC18質(zhì)粒連接成的重組質(zhì)粒為模板，克隆NS4B基因，再將其與質(zhì)粒載體pEGFP-N3質(zhì)粒載構(gòu)建真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究NS4B基因的功能提供前提[13-14]。

在試驗(yàn)中首先進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，切膠回收目的片段后與T載體連接，轉(zhuǎn)化，提取的重組質(zhì)粒酶切后，切膠回收目的基因，再與pEGFP-N3質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化后，選擇性培養(yǎng)基上長出菌落，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，對陽性菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，提取的重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切檢測，結(jié)果表明豬瘟病毒NS4B真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

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