TRIM11靶向調(diào)控miR- 24- 3p促進乳腺癌細(xì)胞系MCF7增殖和侵襲

張 洋，張 靜，季 琳，李文媛，王 瑩，孫 平，于偉光

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1.解剖教研室；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3.紅旗醫(yī)院 普外一科，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球女性因癌導(dǎo)致死亡的首要原因[1]，目前乳腺癌發(fā)病分子機制仍不明確。TRIM11 (tripartite motif-containing protein 11)是一種泛素E3連接酶，研究表明TRIM11為多種惡性腫瘤的致癌基因，在肝癌[2]、結(jié)腸癌[3]、人腦惡性膠質(zhì)瘤[4]和肺癌[5]中表達上調(diào)，促進腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。前期研究發(fā)現(xiàn)與3′-UTR TRIM11序列相匹配microRNAs(miRNAs)為miR- 24- 3p，認(rèn)為TRIM11可能靶向調(diào)控miR- 24- 3p表達[3]。miR- 24- 3p已被證實可作為多種腫瘤的抑癌基因[6- 8]，因此推測TRIM11可能反向調(diào)控miR- 24- 3p表達促進乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。

因此本研究擬探討TRIM11 在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達，明確TRIM11高表達與患者預(yù)后的關(guān)系，證實TRIM11在體外對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響以及對miR- 24- 3p的靶向調(diào)控作用，為臨床乳腺癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和試劑

1.1.1 臨床資料：選取牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院普外科2011年10月至2015年12月首次經(jīng)手術(shù)治療的原發(fā)乳腺癌患者31 例。均為女性，平均62.7歲。隨訪時間為10～60個月，平均32個月。乳腺癌癌旁正常組織31例為對照組。該研究經(jīng)患者知情，并由牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗細(xì)胞和試劑：人乳腺癌細(xì)胞系(MCF7)和正常乳腺上皮細(xì)胞系(HMEC hTERT)(Sigma公司)；siRNA TRIM11慢病毒(piLenti-siRNA-TRIM11)、siRNA對照慢病毒(piLenti-siRNA-GFP)、miR- 24- 3p慢病毒(Lenti hsa-miR- 24- 3p)、miR對照慢病毒(pLenti-III-mir-Blank)(Ambion公司)；TRIM11、miR- 24- 3p、內(nèi)參U6、GAPDH引物(Ambion公司合成)；雙熒光素酶報告試劑盒(Promega公司)；四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TRIM11一抗(Sigma公司)；microRNA PCR Kit試劑盒(Exiqon公司)；Trizol提取液(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺癌組織TRIM11：按照試劑盒說明書步驟進行操作，其中一抗TRIM11(1∶200)。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染：用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)MCF7和HMEC hTERT，3～4 d消化傳代，取增殖狀態(tài)良好的細(xì)胞用于慢病毒轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24 h前將細(xì)胞鋪到6孔板中。每孔加入2 μL siRNA TRIM11慢病毒、siRNA對照慢病毒、miR- 24- 3p慢病毒和miR對照慢病毒，培養(yǎng)箱中孵育3 d。

1.2.3 實時定量PCR(RT-qPCR)：應(yīng)用Trizol提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)說明書通過SYBR Green系統(tǒng)進行實時熒光定量。TRIM11引物如下：5′-GAGAACGTGAACAGGAAGGAG-3′；5′-CC ATCGGTGGCACTGTAGAA-3′。GAPDH引物如下：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；5′-GACAAGCT TCCCGTTCTCAG-3′。miR- 24- 3p應(yīng)用Mirvana RT-qPCR miRNA檢測試劑盒進行檢測。miR- 24- 3p引物如下：5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′；5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；U6引物如下：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′；5′-CTCGCTTCG GCAGCACATAT-3′。

1.2.4 細(xì)胞增殖實驗：細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×103個細(xì)胞，培養(yǎng)6 d。在細(xì)胞增殖檢測時間點，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT培養(yǎng)2 h，丟棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，檢測細(xì)胞增殖數(shù)量。每孔加入100 mL DMSO，波長570 nm測定吸光度值，檢測細(xì)胞增殖活力[9]。

1.2.5 細(xì)胞侵襲試驗：用Transwell檢測細(xì)胞侵襲，(8～10)×104細(xì)胞加入到基質(zhì)膠的上室，600 μL RPMI- 1640培養(yǎng)液注入下室。收集細(xì)胞后PBS沖洗和固定，0.1%結(jié)晶紫染色，拍照及顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞個數(shù)[10]。

1.2.6 熒光素酶報告基因分析：從人基因組DNA中克隆TRIM11 3′-UTR，插入XhoⅠ與NotⅠ酶切位點之間，進行psiCHECK- 2熒光素酶基因報告，通過測序驗證野生型和突變型的插入序列[3]。將細(xì)胞接種在24孔板中行miR- 24- 3p慢病毒或miR對照組慢病毒轉(zhuǎn)染。根據(jù)說明書用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.7 Western bolt檢測TRIM11蛋白表達:用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后加入一抗TRIM11抗體(1∶1 000)或GADPH(1∶5 000)，二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBS洗凈，應(yīng)用顯色液顯示后行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TRIM11在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達及TRIM11與乳腺癌預(yù)后相關(guān)性

TRIM11在乳腺癌組織中高表達百分比為83.15%，明顯高于正常組織的12.32%(圖1A，B)。TRIM11高表達乳腺癌患者的生存率顯著降低(P<0.05)(圖1C)。此外， TRIM11在人乳腺癌MCF7細(xì)胞中的蛋白相對表達顯著高于正常乳腺上皮HMEC-hTERT細(xì)胞 (P<0.001)(圖1D, E)。

A.immunohistochemical analysis of TRIM11 expression in breast cancer tissue; B.percent of TRIM11 high expression in normal or tumor tissue was show,**P<0.001 compared with normal tissue; C.Kaplan Meier’s analysis of the correlation between TRIM11 high and low expression of breast cancer patients; D, E.Western blot analysis of TRIM11 expression in MCF7 cell and HMEC-hTERT cell，*P<0.01 compared with HMEC-hTERT

圖1TRIM11在乳腺癌組織和MCF7細(xì)胞中表達上調(diào)及TRIM11高表達乳腺癌患者生存率降低

2.2 siRNA-TRIM11抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲

siRNA-TRIM11慢病毒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞后TRIM11蛋白表達較對照組顯著下調(diào)(P<0.001)(圖2A，B)。體外培養(yǎng)4～6 d顯著抑制siRNA-TRIM11組乳腺癌細(xì)胞增殖數(shù)量(P<0.001)(圖2C)。與siRNA對照組比較，在轉(zhuǎn)染6 d后siRNA-TRIM11顯著抑制MCF7細(xì)胞增殖活力(P<0.05) (圖2D)，siRNA-TRIM11能夠顯著抑制MCF7細(xì)胞侵襲(P<0.001)(圖2E，F(xiàn))。

2.3 miR- 24- 3p是TRIM11靶基因抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲

探討TRIM11潛在的靶點miRNA，該研究應(yīng)用TargetScan軟件檢測發(fā)現(xiàn)miR- 24- 3p通過3′-UTR區(qū)域直接靶向TRIM11，確定miR- 24- 3p為TRIM11靶向miRNA(圖3A)。我們構(gòu)建了含有野生型或突變TRIM11 3′-UTR序列靶位點熒光素酶報告基因載體驗證miR- 24- 3p是TRIM11的直接靶基因。熒光素酶報告檢測表明miR- 24- 3p高表達顯著降低野生型3′-UTR TRIM11熒光素酶活性(t12=6.417，P<0.001)，但突變型3′-UTR TRIM11沒有顯著差異(P>0.001)(圖3B)。此外，Western bolt和RT-qPCR結(jié)果表明miR- 24- 3p慢病毒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞后，TRIM11蛋白和mRNA表達水平較對照組顯著下調(diào) (蛋白：t12=8.165，P<0.01；mRNA：t12=11.51，P<0.001)(圖3C～E)。qRT-PCR測定miR- 24- 3p mRNA在人乳腺癌MCF7細(xì)胞中的mRNA表達顯著低于正常乳腺上皮HMEC-hTERT細(xì)胞(t12=4.592，P<0.001)(圖3F)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TRIM11 mRNA與miR- 24- 3p mRNA在MCF7細(xì)胞中表達顯著負(fù)相關(guān)(r=0.302，P=0.011)(圖3G)。與對照組比較，miR- 24- 3p慢病毒轉(zhuǎn)染后4～6 d顯著抑制MCF7細(xì)胞增殖數(shù)量(4 d：t12=4.587，P<0.01；5 d：t12=6.631，P<0.001；6 d：t12=9.557，P<0.001)(圖3H)。在miR- 24- 3p慢病毒轉(zhuǎn)染6 d后MCF7細(xì)胞活力較對照組顯著下降 (t12=8.140，P<0.001)，Transwell結(jié)果表明miR- 24- 3p慢病毒轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制MCF7細(xì)胞侵襲(t12=7.542，P<0.001)(圖3I, J)。

MCF7 cells were transfected with Leti-siRNA control (siRNA-control) or Leti-siRNA-TRIM11(siRNA-TRIM11)for 6 day; A, B.Knockdown efficiency of Leti-siRNA-TRIM11 in MCF7 cells was confirmed by Western blot; C.total cell numbers of MCF7 cell were counted at the indicated time points; D.at 6 d after plating, the MTT assay was performed to determine the viability of MCF7 cells; E, F.Transwell invasion assay of MCF7 cells expressing siRNA-control or siRNA-TRIM11;*P<0.01,**P<0.001 compared with siRNA-control

A.the miR- 24- 3p targeting sequence located in the 3′-UTR of TRIM11; B.dual-luciferase reporter assays were transiently transfected with the reporter plasmids with or without Leti-miR- 24- 3p; C, D.Western blot assays of the TRIM11 protein levels in MCF7 cells transfected with miR- 24- 3p or miR-control; E.the expression levels of TRIM11 mRNA in MCF7 cells were determined by RT-qPCR; F.the expression levels of miR- 24- 3p in cell samples were determined by RT-qPCR,**P<0.001 compared with HMEC-hTERT; G.spearman correlation between miR- 24- 3p and TRIM11 mRNA expression levels in MCF7 cells was analyzed; H.total cell numbers of MCF7 cell were counted at the indicated time points; I.the MTT assay was performed to determine the viability of MCF7 cells; J.Transwell invasion assay of MCF7 cells expressing miR- 24- 3p or miR-control;*P<0.01,**P<0.001 compared with miR-control

圖3miR-24-3p為TRIM11靶基因，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲

3 討論

TRIM家族是泛素E3連接酶家族的主要成員[11]， 在腫瘤發(fā)展和分化過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[12]，有研究已證實[13]TRIM家族成員TRIM24是前列腺癌致癌轉(zhuǎn)錄激活因子，而TRIM15在人結(jié)腸腺癌中表達上調(diào)并促進腫瘤生長。其中TRIM11[4]在惡性腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)[5]，它促進惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并通過EGFR和MAPK信號活性促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，TRIM11也在肝癌和肺癌組織中高表達，TRIM11高表達肝癌和肺癌患者的預(yù)后較差[2, 4]，但TRIM11在乳腺癌的表達及生物學(xué)功能目前尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)TRIM11在乳腺癌組織及MCF7細(xì)胞中表達顯著增高，表明TRIM11參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，并進一步證實了TRIM11高表達乳腺癌患者生存率顯著降低，因此推測TRIM11可能是一種乳腺癌的致癌因子，TRIM11高表達具有重要的預(yù)后價值。研究證實siRNA TRIM11慢病毒有效沉默TRIM11表達，而且發(fā)現(xiàn)沉默TRIM11表達抑制MCF7細(xì)胞增殖數(shù)量、增殖活力和侵襲能力，反向證實了TRIM11能夠通過促進乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，在乳腺癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

microRNAs(miRNAs)是非編碼單鏈RNA分子(22個核苷酸的長度)，而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達結(jié)合的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)的特定基因，靶向特定基因的降解或抑制翻譯[14]。miRNAs在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，為探討TRIM11潛在的靶點miRNA，闡明TRIM11的促腫瘤作用機制，應(yīng)用Targetscan軟件和熒光素酶報告基因載體證實3′-UTR TRIM11序列相匹配miRNA為miR- 24- 3p，TRIM11可能靶向調(diào)控miR- 24- 3p表達。同時發(fā)現(xiàn)miR- 24- 3p抑制MCF7細(xì)胞TRIM11表達， 二者表達顯著負(fù)相關(guān)，進一步證實了miR- 24- 3p是TRIM11的直接靶基因，TRIM11反向調(diào)控miR- 24- 3p發(fā)揮作用。miR- 24- 3p可作為一個獨立的腫瘤抑制因子，miR- 24- 3p在膀胱癌[14]、結(jié)腸癌[6]和小細(xì)胞肺癌[8]等多種腫瘤組織中表達下調(diào)，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究也證實miR- 24- 3p在乳腺癌組織中表達顯著下調(diào)，抑制MCF7細(xì)胞增殖數(shù)量、增殖活力和侵襲能力，這與以往miR- 24- 3p在其他腫瘤的作用相一致[15]。因此推測TRIM11靶向反向調(diào)節(jié)miR- 24- 3p信號促進腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，這可能是TRIM11在乳腺癌中作用機制之一。

綜上所述，TRIM11在乳腺癌組織及人乳腺癌MCF7細(xì)胞中表達上調(diào)，并可能通過靶向調(diào)控miR- 24- 3p促進乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，進而影響乳腺癌預(yù)后，TRIM11/ miR- 24- 3p軸有望成為治療乳腺癌的新靶點。

[1] 甘紹舉,王青,朱麗敏,等.靶向治療藥物在乳腺癌中的研究進展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35:134- 137.

[2] Chen Y, Li L, Qian X,etal. High expression of TRIM11 correlates with poor prognosis in patients with hepato-cellular carcinoma[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2017, 41: 190- 196.

[3] Yin Y, Zhong J, Li S,etal. TRIM11, a direct target of miR- 24- 3p, promotes cell proliferation and inhibits apoptosis in colon cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7: 86755- 86765.

[4] Wang X, Shi W, Shi H,etal. TRIM11 overexpression promotes proliferation, migration and invasion of lung cancer cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016, 35: 100- 106.

[5] Di K, Linskey ME, Bota DA. TRIM11 is overexpressed in high-grade gliomas and promotes proliferation, invasion, migration and glial tumor growth[J]. Oncogene, 2013, 32: 5038- 5047.

[6] Gao Y, Liu Y, Du L,etal. Down-regulation of miR- 24- 3p in colorectal cancer is associated with malignant behavior[J]. Med Oncol, 2015, 32: 362- 368.

[7] Kerimis D, Kontos CK, Christodoulou S,etal. Elevated expression of miR- 24- 3p is a potentially adverse prog-nostic factor in colorectal adenocarcinoma[J]. Clin Biochem, 2016,16:30387- 30393.

[8] Pan B, Chen Y, Song H,etal. miR- 24- 3p down-regulation contributes to VP16-DDP resistance in small-cell lung cancer by targeting ATG4A[J]. Oncotarget, 2015, 6: 317- 331.

[9] Zhao Y, Yang F, Li W,etal. miR- 29a suppresses MCF- 7 cell growth by downregulating tumor necrosis factor receptor 1[J]. Tumour Biol, 2017, 39: 1- 11.

[10] Xiong J, Wei B, Ye Q,etal. MiR- 30a- 5p/UBE3C axis regulates breast cancer cell proliferation and migration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 16:30381- 30383.

[11] Hatakeyama S. TRIM family proteins: roles in autophagy, immunity, and carcinogenesis[J]. Trends Biochem Sci, 2017,42:297- 311.

[12] Watanabe M, Hatakeyama S. TRIM proteins and diseases[J]. J Biochem, 2017,161:135- 144.

[13] Cambiaghi V, Giuliani V, Lombardi S,etal. TRIM proteins in cancer[J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 770: 77- 91.

[14] Yu G, Jia Z, Dou Z. miR- 24- 3p regulates bladder cancer cell proliferation, migration, invasion and autophagy by targeting DEDD[J]. Oncol Rep, 2017, 37: 1123- 1131.

[15] Ye SB, Zhang H, Cai TT,etal. Exosomal miR- 24- 3p impedes T-cell function by targeting FGF11 and serves as a potential prognostic biomarker for nasopharyngeal carcinoma[J]. J Pathol, 2016, 240: 329- 340.

新聞點擊

壓力會降低女性生育力

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 09- 26)報道，新研究證明了壓力會降低女性懷孕的概率，尤其是在排卵期間有壓力。

劉易斯維爾大學(xué)公共衛(wèi)生與信息科學(xué)系的流行病與大眾健康學(xué)助理教授Kira Taylor認(rèn)為，如果在排卵期覺得壓力比平常大，在那個月懷孕的概率可能會減少40%。

Taylor的團隊并未觀察壓力為何會在排卵時影響受孕，但她推測，壓力會中斷大腦與卵巢之間的聯(lián)系，減少排卵的概率。

有專家建議，女性可通過練習(xí)瑜珈或打坐冥想等其他方法來降低壓力程度。

Taylor認(rèn)為，每周運動5次，每次30 min這種適度地運動也可以降低壓力；但運動到極限會降低懷孕的可能性。她也建議，談話療法以及時間管理的技巧可以降低壓力的程度。

該研究刊登在《流行病學(xué)》。

即使少量運動也有助于避免癡呆癥

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 09- 01)報道，研究顯示，每天躺在沙發(fā)上的人在老年罹患癡呆癥的風(fēng)險較高。

研究人員發(fā)現(xiàn)，相較于那些規(guī)律地做適度或大量運動的人來說，那些很少或不做運動的年長者罹患癡呆癥風(fēng)險增加50%。

美國疾病控制預(yù)防中心指出，適度運動包括快走、騎自行車、跳交際舞等。加州大學(xué)洛杉磯分校的阿爾茨海默病與失智治療計劃的醫(yī)學(xué)主任Zaldy Tan博士認(rèn)為，不需要大量的運動就能降低癡呆癥風(fēng)險，即使是適量也很好。

Tan博士認(rèn)為，這個研究結(jié)果讓我們知道，要從運動獲得益處，永遠(yuǎn)都不晚。75歲以上的患者可以從運動中獲得較多好處，這是因為他們是失智風(fēng)險最大的人群。

參與者的大腦掃描結(jié)果顯示，那些適度運動的人更能對抗大腦老化的影響。Tan博士與同事們發(fā)現(xiàn)，大腦會隨著老化而萎縮，但有規(guī)律運動的人其腦容量比久坐者大。

有一些理論可解釋為何運動有助于大腦健康，Malaz Boustani博士認(rèn)為，運動增加血流可能會活化大腦，增加它的容量，并促使更多神經(jīng)元生長。

運動也會促進對大腦有益蛋白質(zhì)的分泌，比如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。Tan博士認(rèn)為，BDNF確實會促進新的神經(jīng)元生長。