物體認(rèn)知
——基于動(dòng)物自發(fā)行為的一種學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)方法的研究

呂靜薇，宋廣青，董黎明，姜 寧，陳善廣，劉新民*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094)

物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)方法是1988年由Ennaceur提出，它是基于嚙齒類動(dòng)物天生具有的新奇偏愛(ài)性，用于檢測(cè)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，不需給予正向(獎(jiǎng)賞)或反向(懲罰)的刺激，也不需冗長(zhǎng)的訓(xùn)練，動(dòng)物分別根據(jù)“新舊物體”特征、位置、出現(xiàn)的順序和所處的背景對(duì)“新舊物體”進(jìn)行辨別，能夠檢測(cè)從簡(jiǎn)單的物體識(shí)別記憶到復(fù)雜的空間、時(shí)序和情景記憶[1]，對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶行為實(shí)現(xiàn)精細(xì)化區(qū)分，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易操作。在學(xué)習(xí)記憶發(fā)生發(fā)展機(jī)制、認(rèn)知障礙防護(hù)藥物和保健品研發(fā)等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值[2-3]。但目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)對(duì)其四種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ郊安僮饔绊懸蛩氐南到y(tǒng)研究。

本文選擇兩種常用品系小鼠，對(duì)新物體識(shí)別、物體位置識(shí)別、時(shí)序記憶和情景記憶四個(gè)模式的實(shí)驗(yàn)方法操作步驟，以及測(cè)試期時(shí)間、熟悉期與測(cè)試期間隔時(shí)間等因素展開(kāi)研究，為物體認(rèn)知的應(yīng)用提供穩(wěn)定可靠、客觀規(guī)范的操作方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)，ICR雄性小鼠108只和KM雄性小鼠48只，24～28 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2012-0001]。動(dòng)物自購(gòu)入后先進(jìn)行一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間給予動(dòng)物充足的食、水，實(shí)驗(yàn)室保持安靜，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(上午8:00開(kāi)燈)[SYXK (京) 2013-0023]。實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)間固定，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將動(dòng)物由動(dòng)物房移入實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)約20 min，實(shí)驗(yàn)裝置調(diào)節(jié)燈光強(qiáng)度在60 lx左右。

1.2 主要儀器

物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)設(shè)備：由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心、北京康森益友有限公司聯(lián)合研制。設(shè)備包括四個(gè)測(cè)試箱和不同的物體，并于箱體頂部裝置攝像頭進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)期實(shí)驗(yàn)中將動(dòng)物放入沒(méi)有任何物體的實(shí)驗(yàn)箱中，每只每天10 min，每天1次，連續(xù)3 d。第4天進(jìn)行熟悉期實(shí)驗(yàn)，開(kāi)始時(shí)箱中不放入任何物體，將動(dòng)物放入再次適應(yīng)2 min，動(dòng)物取出后，放入兩個(gè)完全相同的物體，分別記錄每只動(dòng)物5 min內(nèi)對(duì)左側(cè)物體的探索時(shí)間(exploration time for left object，Tl)和對(duì)右側(cè)物體的探索時(shí)間(exploration time for right object，Tr)。

熟悉期后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后開(kāi)始測(cè)試期實(shí)驗(yàn)。測(cè)試期時(shí)放入兩個(gè)不同的物體，其中一個(gè)物體與熟悉期的物體完全相同，另外一個(gè)是新奇物體(與熟悉期物體匹配)，動(dòng)物放入后計(jì)時(shí)5 min，分別記錄動(dòng)物在不同時(shí)間段對(duì)熟悉物體的探索時(shí)間(exploration time for familiar object，Tf)和對(duì)新奇物體的探索時(shí)間(exploration time for novel object，Tn)。

探索活動(dòng)定義為：小鼠的鼻子近距離指向物體或者直接嗅、舔物體。當(dāng)其他部位接觸物體而鼻子沒(méi)有指向物體或站在物體上時(shí)非對(duì)物體的探索活動(dòng)[4]。

1.3.2 物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)期與熟悉期實(shí)驗(yàn)過(guò)程同新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，而測(cè)試期與新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)不同，只是將熟悉期中兩個(gè)相同物體中的一個(gè)移到新的位置，動(dòng)物放入后計(jì)時(shí)5 min，分別記錄動(dòng)物在不同時(shí)間段對(duì)兩不同物體的探索時(shí)間。

1.3.3 時(shí)序記憶實(shí)驗(yàn)

時(shí)序記憶實(shí)驗(yàn)程序和上述兩種方法有所不同，實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1，包括2個(gè)熟悉期，即熟悉期1和熟悉期2，其他過(guò)程基本相同。適應(yīng)期同新物體識(shí)別。

第4天進(jìn)行熟悉期實(shí)驗(yàn)，開(kāi)始時(shí)箱中無(wú)任何物體，將動(dòng)物放入再次適應(yīng)2 min，動(dòng)物取出后放入兩相同的物體，進(jìn)行熟悉期1實(shí)驗(yàn)，分別記錄5 min內(nèi)對(duì)兩個(gè)完全相同物體的探索時(shí)間；將動(dòng)物取出后放入飼養(yǎng)籠中，10 min后進(jìn)行熟悉期2實(shí)驗(yàn)，在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)箱中放入另外兩個(gè)完全相同的物體(與熟悉期1中物體匹配)，分別記錄5 min內(nèi)對(duì)兩個(gè)完全相同物體的探索時(shí)間。熟悉期2后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后開(kāi)始測(cè)試期實(shí)驗(yàn)。測(cè)試期時(shí)放入兩個(gè)不同的物體，分別是熟悉期1和熟悉期2中各一個(gè)物體，動(dòng)物放入后計(jì)時(shí)5 min，分別記錄在不同時(shí)間段對(duì)兩不同物體的探索時(shí)間。

注：以紅色圓圈標(biāo)記物體為新奇物體。圖1 時(shí)序記憶實(shí)驗(yàn)操作流程圖Note. Red circles indicate novel objects.Fig.1 Schematic diagram of the experimental process of temporal order memory task

注：以紅色圓圈標(biāo)記物體為新奇物體。為保持配對(duì)平衡，A、B兩種放置方式均需考慮。圖2 情景記憶實(shí)驗(yàn)操作流程圖Note. Red circles indicate novel objects. Objects should be placed as A and B for counterbalance.Fig.2 Schematic diagram of the experimental process of object context recognition task

1.3.4 情景記憶實(shí)驗(yàn)

情景記憶實(shí)驗(yàn)程序與時(shí)序記憶實(shí)驗(yàn)類似，也包括2個(gè)熟悉期，但在不同背景的實(shí)驗(yàn)箱中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖2。

適應(yīng)期實(shí)驗(yàn)將動(dòng)物放入具有第一種背景的實(shí)驗(yàn)箱中，適應(yīng)完成10 min后，再放入第二種背景的實(shí)驗(yàn)箱中，每種實(shí)驗(yàn)箱適應(yīng)過(guò)程與新物體識(shí)別中適應(yīng)期實(shí)驗(yàn)相同。第4天開(kāi)始熟悉期實(shí)驗(yàn)，在具有第一種背景的實(shí)驗(yàn)箱中放入兩相同的物體，進(jìn)行熟悉期1實(shí)驗(yàn)，分別記錄5 min內(nèi)對(duì)兩個(gè)完全相同物體的探索時(shí)間；將動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后進(jìn)行熟悉期2實(shí)驗(yàn)，在具有第二種背景的實(shí)驗(yàn)箱中放入另外兩個(gè)完全相同的物體(與熟悉期1中的物體匹配)，分別記錄5 min內(nèi)對(duì)兩相同物體的探索時(shí)間。熟悉期2后將動(dòng)物取出放入飼養(yǎng)籠中，10 min后進(jìn)行測(cè)試期實(shí)驗(yàn)，計(jì)時(shí)5 min，分別記錄在不同時(shí)間段對(duì)兩不同物體的探索時(shí)間。

1.3.5 不同時(shí)間間隔時(shí)的物體辨別記憶能力考察

將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，熟悉期與測(cè)試期間隔分別設(shè)置為10 min，30 min，60 min，90 min，120 min。實(shí)驗(yàn)步驟與新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)相同，僅每組動(dòng)物檢測(cè)時(shí)熟悉期與測(cè)試期間隔不同。記錄每組動(dòng)物在5 min測(cè)試期中不同時(shí)間段對(duì)兩不同物體的探索時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖3可知，KM和ICR小鼠熟悉期對(duì)兩完全相同物體的探索時(shí)間差異無(wú)顯著性，動(dòng)物對(duì)物體放置的位置未表現(xiàn)出偏愛(ài)性。由圖4A和4B可知，測(cè)試期實(shí)驗(yàn)時(shí)，KM小鼠在1～5 min和ICR小鼠在2～5 min時(shí)Tn顯著多于Tf，DI與0相比有顯著性(P< 0.01)，兩品系小鼠可識(shí)別新舊物體。

2.2 物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

相較于原位置的物體，動(dòng)物對(duì)移動(dòng)到新位置的物體更感興趣。Tn表示測(cè)試期移動(dòng)到新位置物體的探索時(shí)間，Tf表示測(cè)試期對(duì)原位置物體的探索時(shí)間。由圖5A可知，KM和ICR兩種小鼠在物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試期實(shí)驗(yàn)時(shí)間為3～5 min時(shí)，Tn都顯著多于Tf(P< 0.05，P< 0.01)；圖5B表示在測(cè)試期實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2～5 min時(shí)，KM和ICR兩種小鼠DI都顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)，兩品系小鼠可辨別出物體位置的變化。

2.3 時(shí)序記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于出現(xiàn)的時(shí)序不同，相對(duì)于熟悉期2，動(dòng)物對(duì)先出現(xiàn)的熟悉期1物體更感興趣。熟悉期1中的物體作為新物體，其探索時(shí)間以Tn表示，熟悉期2中的物體探索時(shí)間以Tf表示。由圖6A可知，測(cè)試期實(shí)驗(yàn)KM小鼠3 min時(shí)和ICR小鼠1 min、4 min或5 min時(shí)Tn顯著多于Tf(P< 0.05)，由圖6B可知，KM小鼠3 min或5 min時(shí)DI顯著大于0(P< 0.05)，ICR小鼠3～5 min時(shí)DI都大于0(P< 0.05，P< 0.01)。兩種品系的小鼠對(duì)先后遇到的物體是有記憶的，都能夠根據(jù)出現(xiàn)的前后對(duì)其進(jìn)行辨別。

圖3 熟悉期KM和ICR小鼠對(duì)兩物體放置位置偏愛(ài)性的比較Fig.3 Comparison of time consumption of the KM and ICR mice for exploring both familiar objects during familiar phase in the novel object recognition task

注：A：測(cè)試期探索時(shí)間；B：相對(duì)辨別指數(shù)。與Tf比較，**P< 0.01；與0比較，## P< 0.01。圖4 測(cè)試期KM和ICR小鼠的物體辨別記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,**P< 0.01. Compared with 0,##P< 0.01.Fig.4 Comparison of the object recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

2.4 情景記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

測(cè)試背景與物體之前所處實(shí)驗(yàn)背景不匹配或不一致的物體更能引起嚙齒類動(dòng)物的興趣，與測(cè)試期實(shí)驗(yàn)箱背景不匹配物體可看作新物體，測(cè)試期探索時(shí)間即Tn，而與測(cè)試期實(shí)驗(yàn)箱背景匹配物體探索時(shí)間即Tf。由圖7A可知，測(cè)試期KM小鼠3～5 min時(shí)和ICR小鼠4 min及5 min時(shí)Tn均顯著多于Tf(P< 0.05，P< 0.01)；由圖7B可知，KM小鼠在2～5 min時(shí)DI顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)，ICR小鼠在4 min或5 min時(shí)DI都大于0(P< 0.01)。兩種品系的小鼠在該種實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)物體熟悉期所處的實(shí)驗(yàn)箱背景是有記憶的，都能夠根據(jù)物體與實(shí)驗(yàn)箱背景是否匹配對(duì)其進(jìn)行辨別。

注：A：測(cè)試期探索時(shí)間；B：相對(duì)辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖5 測(cè)試期KM和ICR小鼠的物體位置辨別記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.5 Comparison of the object location recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

注：A：測(cè)試期探索時(shí)間；B：相對(duì)辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖6 測(cè)試期KM和ICR小鼠的時(shí)序記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.6 Comparison of the object temporal order memory ability between the KM and ICR mice during test phase

注：A：測(cè)試期探索時(shí)間；B：相對(duì)辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，** P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖7 測(cè)試期KM和ICR小鼠的情景記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.7 Comparison of the object context recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

2.5 不同時(shí)間間隔時(shí)的物體辨別記憶能力

由圖8可知，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)熟悉期與測(cè)試期的間隔(delay)10 min，ICR小鼠在測(cè)試期2～5 min時(shí)，DI顯著大于0(P< 0.01)；當(dāng)delay=30 min，ICR小鼠在測(cè)試期3～5 min時(shí)，DI顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)；當(dāng)delay=1 h，ICR小鼠在測(cè)試期4 min或5 min時(shí)，DI顯著大于0(P< 0.05)。以上結(jié)果表明，ICR小鼠時(shí)間間隔≤ 1 h時(shí)，能夠辨別出新奇物體和熟悉物體，當(dāng)時(shí)間間隔延長(zhǎng)到90 min或2 h時(shí)則難以辨別。

注：與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖8 ICR小鼠不同時(shí)間間隔下的物體辨別記憶能力Note. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.8 Object recognition and memory ability of the ICR mice at different time intervals

3 討論

在物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中，需充分考慮動(dòng)物對(duì)物體的識(shí)別能力和物體配對(duì)的平衡。物體材料要相同，同時(shí)避免氣味觸覺(jué)影響[5]，另考慮對(duì)物體尺寸與動(dòng)物的體長(zhǎng)的關(guān)系[6-8]。除對(duì)物體本身的要求外，另需注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程中物體的取拿及擦洗，如保持同種材料手套的佩戴，每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成后，采用10%的酒精進(jìn)行擦拭，每階段實(shí)驗(yàn)完成后用75%酒精擦洗，后用清水沖洗干凈，晾干備用等[9]。

研究表明“新奇偏愛(ài)性”存在時(shí)間有一定限度[10]，動(dòng)物對(duì)物體的探索主要集中在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的幾分鐘內(nèi)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中兩種小鼠在測(cè)試期總時(shí)間為5 min，各時(shí)間段內(nèi)的DI有所不同，但在3～5 min時(shí)間段時(shí)最為敏感，能夠反應(yīng)出動(dòng)物的識(shí)別記憶能力。

由于存在自然遺忘現(xiàn)象，隨著熟悉期和測(cè)試期時(shí)間間隔延長(zhǎng)，動(dòng)物對(duì)不同物體的識(shí)別難度增加。ICR小鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，自然遺忘開(kāi)始在1 h～90 min之間。Bertaina-Anglade等發(fā)現(xiàn)大鼠在10 min～3 h內(nèi)，小鼠在1 h時(shí)表現(xiàn)正常辨別記憶能力[13]。確定自然遺忘開(kāi)始時(shí)間是進(jìn)行物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)的前提，一般選較長(zhǎng)間隔用于篩選改善作用潛在藥物，而選較短間隔檢測(cè)記憶損傷作用[14]。

物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)調(diào)整后，可用于不同程度以及不同類型的學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)[15-16]，并具有簡(jiǎn)單易操作、周期較短[17-18]、不需要額外的動(dòng)機(jī)(獎(jiǎng)勵(lì)或懲罰)等優(yōu)點(diǎn)。其中，物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)考察動(dòng)物的空間記憶能力，另三種為非空間記憶能力檢測(cè)方法。除此之外，時(shí)序及情景記憶能力能夠充分模擬人類日常生活的識(shí)別記憶。目前，物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中探索時(shí)間多采用人工計(jì)時(shí)，主觀性和判斷標(biāo)準(zhǔn)難統(tǒng)一。Matsumoto等采用3D跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行分析[19]，但其準(zhǔn)確性有待考證?？傊糜?jì)算機(jī)圖像技術(shù)實(shí)現(xiàn)探索時(shí)間自動(dòng)化分析，優(yōu)化探索標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)指標(biāo)，是物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)未來(lái)發(fā)展方向，此種精細(xì)敏感的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法也將獲得更廣泛的應(yīng)用。

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