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    瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用

    2018-03-29 06:42:05劉熙鵬
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2018年3期
    關(guān)鍵詞:汀對孔板瑞舒伐

    劉 明,劉熙鵬

    (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,河北 張家口 075061)

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞株

    膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

    1.2 主要試劑與儀器

    瑞舒伐他汀鈣購于浙江京新藥業(yè)有限公司,溶解于二甲基亞砜(DMSO),并制成濃度為2×103μmol/L的瑞舒伐他汀母液,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求利用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋;兔抗人MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗體均購于美國Abcam公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室均購于美國Gibco公司;BCA蛋白測定試劑盒、CCK-8試劑盒均購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。

    DYCZ-425D型雙垂直電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購于北京六一儀器廠;GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購于美國伯樂公司;168-1000XC型酶標(biāo)儀均購于美國BD公司;AF6000型熒光顯微鏡購于德國萊卡公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

    將5×103個(gè)U87細(xì)胞接種到96孔板,培養(yǎng)24 h,加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀作用24、48、72 h,加入CCK-8試劑,繼續(xù)孵育4 h后,利用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處的OD值,每組平行3個(gè)復(fù)孔。

    1.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

    將8×103個(gè)U87細(xì)胞接種到6孔板,培養(yǎng)24 h后,于6孔板底部用記號筆劃線,再用200 μL的槍頭對6孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行劃痕,接著用PBS洗去脫落下來的細(xì)胞,加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培養(yǎng)48 h,于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照并每孔選取4個(gè)視野進(jìn)行劃痕距離的記錄。

    1.3.3 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力

    實(shí)驗(yàn)前將Matrigel膠均勻地平鋪于Transwell小室微膜上,備用。將8×103個(gè)U87細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h后,加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培養(yǎng)48 h后,消化細(xì)胞并制成單懸液,接種到Transwell上室,而下室僅加入DMEM培養(yǎng)基,48 h后,將Transwell小室取出來,用多聚甲醛固定細(xì)胞,結(jié)晶紫染色,并于倒置顯微鏡下觀察,對5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù),并取平均值,即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

    根據(jù)對泰煤家園的調(diào)查與研究,利用優(yōu)勢理論和參與式發(fā)展理論,實(shí)現(xiàn)群策群力、共享共治的目標(biāo)。最終落腳到民生民情關(guān)懷上,以此重喚居民自豪感,重拾工人自信心。

    1.3.4 Western blot檢測細(xì)胞中MMP2、MMP9及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

    收集細(xì)胞并裂解,離心收獲上清液即是總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度,制作濃縮膠和分離膠,蛋白上樣,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉凝膠電泳,濕法轉(zhuǎn)膜。2%的BSA室溫下孵育1 h,一抗溶液(兔MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗體,稀釋度為1∶100)4℃過夜孵育,次日室溫條件下二抗溶液孵育1~2 h,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞活力的影響

    與對照組比較,隨著作用時(shí)間延長,5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組細(xì)胞活力逐漸降低(P< 0.01),且隨著給藥濃度增加,細(xì)胞活力也逐漸降低(P< 0.01),見表1。

    2.2 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

    與對照組比較,5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著降低(P< 0.01),見圖1、圖2及表2。

    2.3 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響

    與對照組比較,5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組MMP2及MMP9表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01),見圖3。

    2.4 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與對照組比較,5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01),見圖4。

    3 討論

    瑞舒伐他汀是20世紀(jì)80年代合成得到的一種新型他汀類降脂藥物,能夠抑制內(nèi)皮素、NO的合成與釋放,減少自由基生成,能夠改善動脈內(nèi)皮功能,能夠防治動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生,最終減少心血管疾病的發(fā)生[4-5]。瑞舒伐他汀對肝細(xì)胞具有很強(qiáng)的親和力,且與其它藥物之間作用小,是目前常用的心腦血管二級預(yù)防藥物[4-5],且近些年來研究還發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀對乳腺癌、肺癌、乳頭狀甲狀腺癌、胰腺癌及肝癌等腫瘤具有顯著療效[9-10],同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著毒性[6],但具體作用機(jī)制未知。另外研究報(bào)道證實(shí)瑞舒伐他汀能夠顯著抑制高半胱氨酸及PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移[7-8],提示瑞舒伐他汀可能對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲具有抑制作用,因此本研究對此展開了探討。

    Tab.1Effect of rosuvastatin on the viability of U87 cells

    組別Groups24h48h72h對照組Controlgroup0486±00500612±00610728±00735μmol/L組5μmol/Lgroup0442±0044??0520±0052??0542±0054??10μmol/L組10μmol/Lgroup0396±0040??0443±0044??0451±0045??20μmol/L組20μmol/Lgroup0336±0030??0351±0035??0358±0036??

    注:與對照組比較,**P< 0.01。

    Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

    注:A:對照組;B:5 μmol/L組;C:10 μmol/L組;D:20 μmol/L組。圖1 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞遷移能力的影響(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.1 Effect of rosuvastatin on the migration ability of U87 cells

    注:A:對照組;B:5 μmol/L組;C:10 μmol/L組;D:20 μmol/L組。圖2 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞侵襲能力的影響(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.2 Effect of rosuvastatin on the invasion ability of U87 cells

    Tab.2Effect of rosuvastatin on the migration and invasion abilities of U87 cells

    組別Groups遷移距離(μm)Migrationdistance侵襲數(shù)目Numberofmigratedcells對照組Controlgroup2031±23115968±15.975μmol/L組5μmol/Lgroup1557±105??9854±9.85??10μmol/L組10μmol/Lgroup834±084??7146±7.14??20μmol/L組20μmol/Lgroup351±035??4238±4.23??

    注:與對照組比較,**P< 0.01。

    Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

    注:A:對照組;B:5 μmol/L組;C:10 μmol/L組;D:20 μmol/L組。與對照組比較,**P< 0.01。圖3 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of rosuvastatin on the expression of MMP2 and MMP9 in U87 cells

    注:A:對照組;B:5 μmol/L組;C:10 μmol/L組;D:20 μmol/L組。與對照組比較,**P< 0.01。圖4 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.4 Effect of rosuvastatin on the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in U87 cells

    本研究首先采用CCK-8法檢測瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87活力的影響,結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著降低U87細(xì)胞活力,并具有劑量及時(shí)間依賴性,與Tapia-Pérez等[6]的研究一致。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的快速增殖、侵襲是患者術(shù)后失敗的主要原因之一[11]。而細(xì)胞外基質(zhì)的降解為腫瘤細(xì)胞快速進(jìn)出細(xì)胞提供足夠空間,這一過程主要由蛋白水解酶MMPs介導(dǎo)。MMPs是一類依賴于Zn2+的蛋白水解酶,主要分為四類,其中明膠酶MMP2和MMP9不僅能夠降解基膜主要成分IV膠原、層連蛋白等,還能夠誘導(dǎo)血管新生,促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤擴(kuò)散。目前研究證實(shí)高表達(dá)的MMP2、MMP9與膠質(zhì)瘤的高侵襲性正相關(guān),且患者生存結(jié)果差[12]。說明通過降低MMP2和MMP9表達(dá),能夠顯著降低膠質(zhì)瘤侵襲并提高患者生存能力。而且Gan等[7]研究表明瑞舒伐他汀能夠通過下調(diào)MMP2、MMP9表達(dá)進(jìn)而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移,Shi等[8]研究表明瑞舒伐他汀能夠通過下調(diào)MMP2表達(dá)進(jìn)而抑制高半胱氨酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移,提示瑞舒伐他汀對MMP2及MMP9表達(dá)具有調(diào)控作用,所以本研究利用Western blot檢測瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2和MMP9表達(dá)的影響,結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著降低MMP2和MMP9表達(dá),從而抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。

    膠質(zhì)瘤的高侵襲性受多種信號通路的調(diào)控,Wnt信號通路就是最為重要的一種[13-14]。Wnt屬于原癌基因,包括20種亞族,不僅參與胚胎的發(fā)育過程,還在炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。Wnt通過四條信號通路將外界刺激傳遞到靶細(xì)胞,并使細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)。其中Wnt/β-catenin信號通路是其經(jīng)典通路,β-catenin是此通路的核心分子,正常生理?xiàng)l件下,β-catenin處于細(xì)胞質(zhì)中,與Axin、APC及GSK-3β等形成復(fù)合物,當(dāng)Wnt被激活后,Wnt與Frizzled形成復(fù)合物激活A(yù)xin,使β-catenin從復(fù)合物中解離出來并在細(xì)胞漿中積聚,最后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與TCL/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,刺激MMPs、CyclinD1、c-myc等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[15]。研究表明Wnt/β-catenin信號通路在膠質(zhì)瘤中高度激活并上調(diào)(包括Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin),并與膠質(zhì)瘤的高侵襲性密切相關(guān)[13-14]。因此抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá),有助于降低膠質(zhì)瘤的侵襲性。所以本研究進(jìn)一步探討瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響,結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著抑制U87細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表達(dá),從而下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá),最終抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。

    綜上所述,5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀能顯著降低U87細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞遷移與侵襲能力,并下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá),此過程與阻斷Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。在今后的實(shí)驗(yàn)研究中,本課題組將會深入探索瑞舒伐他汀對人體膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制,期望研究成果為臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新的選擇。

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