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    孤養(yǎng)對單次延長應(yīng)激建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠行為學(xué)的影響

    2018-03-29 06:42:04方錦穎陳光耀李龍梅鄭思思
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2018年3期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)模型

    方錦穎,陳光耀,李龍梅,鄭思思,毛 萌

    (北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

    創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)指在經(jīng)歷或目睹重大災(zāi)難性應(yīng)激事件后延遲出現(xiàn)并長期存在的一種精神疾病[1]。作為焦慮障礙的一種,其核心癥狀包括:反復(fù)出現(xiàn)創(chuàng)傷體驗(yàn),持續(xù)回避創(chuàng)傷事件,警覺性的高度提高和心理的消極變化[2]。單次延長應(yīng)激(single-prolonged stress,SPS)作為通過以疲勞為環(huán)境條件建立的敏感化動物模型的一種,較好地模擬了PTSD臨床患者應(yīng)激過程及發(fā)病后的癥狀。較之于其他PTSD動物模型,SPS模型重復(fù)性良好,且該模型能夠被抗抑郁及抗焦慮藥物所改善,逐漸成為當(dāng)今研究PTSD最為常用的國際公認(rèn)動物模型之一[3]。

    對SPS模型的嘗試改進(jìn)以增加該模型的表觀、預(yù)測和結(jié)構(gòu)效度與臨床的吻合度為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。如Keller等人[4]依據(jù)臨床PTSD發(fā)病率女性高于男性的特點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)SPS雌性大鼠模型較之于雄性模型大鼠行為學(xué)條件恐懼行為增加;趙中興、陳旺等人[5-6]采用在大鼠束縛過程中增加不可逃避足底電刺激建立復(fù)合應(yīng)激模型,行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合應(yīng)激組較之于單純SPS組行為學(xué)出現(xiàn)焦慮樣癥狀增加、活動性降低、空間記憶受損等特點(diǎn)。孤養(yǎng)作為一種應(yīng)激手段,被應(yīng)用于新生期孤養(yǎng)、慢性不可預(yù)見應(yīng)激等大鼠模型的建立[7-8]。本文擬通過將SPS模型與SPS聯(lián)合孤養(yǎng)模型進(jìn)行對比,探究孤養(yǎng)對單次延長應(yīng)激(SPS)建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)模型大鼠的影響。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    雄性Wistar大鼠36只,體重190~210 g,6周齡,實(shí)驗(yàn)動物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司[SCXK (京) 2016-0011],在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物室[SYXK (京) 2016-0038]飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃,濕度(65±5)%,光照12 h,每天更換墊料、飼料及水瓶,自由飲水及進(jìn)食,造模前一周購入進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

    1.2 主要試劑與儀器

    75%乙醇,安徽太和縣光明酒精分裝廠,批號:160606;無水乙醚,北京化工廠,批號:20170417。圓桶狀透明塑料大鼠固定器:長25 cm,筒口外徑7 cm,內(nèi)徑5 cm,由北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室提供;曠場箱:底部100 cm×100 cm正方形、高45 cm,材料為灰色木質(zhì),箱底部用黑線劃分出25個正方形格(20 cm×20 cm),攝像頭位于曠場箱正中格上方;造模及強(qiáng)迫游泳使用水箱:底部65 cm×100 cm、高80 cm的立方形紅色塑料水箱;行為學(xué)觀察及自動分析系統(tǒng):Nodule公司生產(chǎn),包括計(jì)算機(jī)、攝像監(jiān)控系統(tǒng)、Observior及Ethevision行為學(xué)分析軟件。曠場箱、水箱和行為學(xué)觀察及自動分析系統(tǒng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)診斷系神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模

    將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后,隨機(jī)分為3組,即正常組、SPS模型組、SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組,每組各12只,經(jīng)檢測各組大鼠體重在同一基線水平上。正常組不予處理,SPS模型組與SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組進(jìn)行SPS造模,流程如下:使用束縛桶將大鼠進(jìn)行2 h束縛,隨后置于水深45 cm、水溫25℃的水箱中進(jìn)行20 min的游泳,游泳結(jié)束15 min后將大鼠置于密閉玻璃容器中使用乙醚進(jìn)行麻醉,失去意識后置于籠子中放置在通風(fēng)處,待意識恢復(fù)后進(jìn)行靜養(yǎng)[9]。造模后正常組、SPS模型組每籠6只進(jìn)行飼養(yǎng),孤養(yǎng)組每籠1只,大鼠均放置于普通飼養(yǎng)籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。除更換墊料、飼料及飲水外,避免打擾大鼠,連續(xù)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行行為學(xué)檢測。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

    1.3.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

    (1)大鼠體重增長數(shù):在造模前及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別使用電子秤測量大鼠體重,后一次體重減去前一次體重即為大鼠體重增長數(shù)。

    (2)曠場實(shí)驗(yàn)[10-11]:實(shí)驗(yàn)者穿著純黑色衣服(避免軟件分析時實(shí)驗(yàn)者身體某些淺色部位被識別為大鼠)將動物放入箱內(nèi)的正中格,迅速將進(jìn)入曠場區(qū)域的手撤出,開始進(jìn)行錄像5 min,錄像過程中實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)遠(yuǎn)離曠場箱以避免對動物造成干擾。每只動物測試結(jié)束后用蘸有酒精的毛巾擦拭曠場箱內(nèi)部,以避免對下只動物的測試造成影響。錄像結(jié)束后采用軟件對錄像進(jìn)行分析,測得每組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)以及單次最大運(yùn)動距離。

    (3)僵立行為測試[12]

    使用造模時水箱,將水注入箱中(調(diào)節(jié)使水深45 cm、水溫25℃),將大鼠小心放置于水箱中。僵立時間的記錄標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在水中靜止不動,但可以有輕度搖擺,除保持呼吸運(yùn)動外其他的肌肉活動均消失。記錄5 min內(nèi)大鼠僵立時間及次數(shù)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠體重增長數(shù)

    SPS模型組大鼠體重增長數(shù)(28.3±4.9)g較正常組(34.8±4.8)g降低,差異有顯著性(P< 0.01),SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組(30.0±4.8)g較之于正常組大鼠體重增長數(shù)降低,差異有顯著性(P< 0.05),SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組差異無顯著性(P> 0.05)。

    2.2 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離

    SPS模型組較正常組運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)減少,差異有顯著性(P< 0.05),單次最大運(yùn)動距離減少,差異有顯著性(P< 0.01);SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于正常組運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離差異無顯著性(P> 0.05);SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離增加,差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

    2.3 大鼠僵立行為次數(shù)及時間

    SPS模型組較正常組僵立行為次數(shù)、僵立時間增加,差異有顯著性(P< 0.01);SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于正常組僵立行為次數(shù)、僵立時間增加,差異有顯著性(P< 0.05);SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組僵立行為次數(shù)、僵立時間差異無顯著性(P> 0.05)。見表2。

    3 討論

    應(yīng)激能夠造成實(shí)驗(yàn)動物內(nèi)分泌系統(tǒng)及消化系統(tǒng)功能紊亂,從而出現(xiàn)體重增長速度較前減少[13]。曠場實(shí)驗(yàn)通過觀察實(shí)驗(yàn)動物在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度,從而反映出大鼠的焦慮水平[14]。僵立行為測試將大鼠重新置于造模時場景,當(dāng)大鼠重新受到負(fù)性刺激后表現(xiàn)出的恐懼反應(yīng),是檢測SPS模型是否成功復(fù)制的重要指標(biāo)。造模7 d后SPS模型組較之于正常組,大鼠體重增長數(shù)減少,曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離均減少,僵立行為測試僵立次數(shù)及時間增加,與之前文獻(xiàn)記載相符,提示對SPS模型進(jìn)行了成功復(fù)制[15]。

    在精神類疾病動物模型的制作中,孤養(yǎng)作為一種負(fù)性情緒刺激被作為應(yīng)激源廣泛應(yīng)用。在本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,預(yù)期將孤養(yǎng)作為一種額外應(yīng)激刺激附加于SPS模型,從而使SPS模型更加穩(wěn)定以及PTSD相關(guān)表現(xiàn)更加明顯。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組造模7 d后較之于SPS模型組曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離增加,提示SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組焦慮水平降低。結(jié)果表明7 d孤養(yǎng)使得SPS模型焦慮狀態(tài)得到改善,與預(yù)期結(jié)論截然相反。

    Tab.1Total movement distance, frequency of grid crossing and single maximum movement distance of the rats in each group during the open field test

    組別Groups運(yùn)動總距離(cm)Totalmovementdistance穿格次數(shù)Frequencyofgridcrossing單次最大運(yùn)動距離(cm)Singlemaximummovementdistance正常組Normalgroup22029±5349862±290113±36SPS模型組SPSmodelgroup15099±7514a547±368a73±24bSPS聯(lián)合孤養(yǎng)組SPScombinedwithsocialisolationgroup24066±7475cd958±342cd105±29cd

    注:與正常組比較,aP< 0.05,bP< 0.01,cP> 0.05;與SPS模型組比較,dP< 0.05。

    Note. Compared with the normal group,aP< 0.05,bP< 0.01,cP> 0.05. Compared with the SPS model group,dP< 0.05.

    Tab.2Freezing frequency and time of the rats in each group

    組別Groups僵立次數(shù)Freezingtimes僵立時間(s)Freezingtimeduration正常組Normalgroup083±111075±101SPS模型組SPSmodelgroup775±742a652±530aSPS聯(lián)合孤養(yǎng)組SPScombinedwithsocialisolategroup442±438bc351±369bc

    注:與正常組比較,aP< 0.01,bP< 0.05;與SPS模型組比較,cP> 0.05。

    Note. Compared with the normal group,aP< 0.01,bP< 0.05. Compared with the SPS model group,cP> 0.05.

    創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)患者在遭受巨大應(yīng)激過后,當(dāng)再次出現(xiàn)與應(yīng)激相關(guān)聯(lián)或類似的事件、情景或其他線索時,常表現(xiàn)出強(qiáng)烈的心理與生理反應(yīng)。為避免這種反應(yīng)的出現(xiàn),患者往往出現(xiàn)持續(xù)回避的系列癥狀,包括與他人避免接觸及獨(dú)自生活于安靜的環(huán)境中,提示回避可能是PTSD患者的一種自我保護(hù)性反應(yīng),將大鼠單獨(dú)進(jìn)行飼養(yǎng)從一定程度上滿足了PTSD大鼠進(jìn)行回避的需求[16]。在實(shí)驗(yàn)過程中亦發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷巨大應(yīng)激過后,大鼠常處于易激惹狀態(tài),在群居過程中更容易出現(xiàn)打斗,因此群居飼養(yǎng)可能會對大鼠造成額外的應(yīng)激。在動物模型的制作中,將孤養(yǎng)作為應(yīng)激源進(jìn)行造模多采用較長時間的干預(yù),本研究僅僅對SPS造模后孤養(yǎng)7 d的大鼠進(jìn)行觀察,造模7 d后SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組焦慮水平較之于SPS模型組降低,提示在SPS造模后進(jìn)行7 d孤養(yǎng)可能作為一種保護(hù)機(jī)制作用于模型大鼠,而進(jìn)一步延長孤養(yǎng)時間是否會對SPS模型造成負(fù)性機(jī)制尚不得而知。因此,課題組進(jìn)一步將對SPS聯(lián)合孤養(yǎng)模型多個時間點(diǎn)的行為學(xué)改變進(jìn)行觀察,以明確孤養(yǎng)對SPS模型影響的具體時間點(diǎn),并進(jìn)一步探究其相關(guān)病理及分子機(jī)制。

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