分子標(biāo)記技術(shù)及其在果樹(shù)種質(zhì)資源上的應(yīng)用分析

陳薇薇

摘 要 分子標(biāo)記技術(shù)是一種遺傳標(biāo)記技術(shù)，其具有特別的優(yōu)越性，在生物學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，對(duì)各種動(dòng)植物的長(zhǎng)效發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用?；诖耍瑢⒎肿訕?biāo)記技術(shù)及其在果樹(shù)種質(zhì)資源上的應(yīng)用作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)的概述，進(jìn)而對(duì)其在果蔬種質(zhì)資源上的應(yīng)用展開(kāi)分析，以期為果樹(shù)種植奠定良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 分子標(biāo)記技術(shù);果樹(shù)種質(zhì)資源;應(yīng)用分析

中圖分類號(hào)：Q75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.36.070

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，人們對(duì)于生物遺傳規(guī)律的認(rèn)知也日漸加深。從1975年開(kāi)始，人們開(kāi)始通過(guò)DNA分子技術(shù)對(duì)生物進(jìn)化、分類以及基因、遺傳建立等方面展開(kāi)研究，直到1985年有學(xué)者提出了PCR技術(shù)，其實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜DNA片段的體外擴(kuò)增，憑借著迅速、準(zhǔn)確以及高度靈敏等優(yōu)勢(shì)受到生物界的重視，在品種鑒定、系譜分析、遺傳圖譜建立等領(lǐng)域廣泛使用。

1 分子標(biāo)記技術(shù)類型

分子標(biāo)記的類型較多，其按照分子生物學(xué)技術(shù)主要分成3種。1）在雜交技術(shù)基礎(chǔ)上提出的分子標(biāo)記，其中代表性最強(qiáng)的就是RFLP技術(shù)。2）在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上提出的分子標(biāo)記技術(shù)，其主要分為RAPD、AFLP、SCAR等技術(shù)。3）在重復(fù)序列基礎(chǔ)上提出的分子標(biāo)記技術(shù)，其中具有代表性的就是SSR、ISSR等技術(shù)。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在果樹(shù)種質(zhì)資源上的應(yīng)用

2.1 品種鑒定分類

果樹(shù)基本為多年木生植物、無(wú)性繁殖，不同地區(qū)栽培技術(shù)互相借鑒，使得更多物種產(chǎn)生，類型增多，如葡萄品種超過(guò)20 000種，但是實(shí)際計(jì)算發(fā)現(xiàn)其只有5 000～8 000種，果樹(shù)品種鑒定分類混亂成為當(dāng)前果樹(shù)種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)的果樹(shù)品種鑒定分類主要是利用植物特征比較和細(xì)胞學(xué)、酶學(xué)等方面進(jìn)行，但其無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)別材料關(guān)系相近的果樹(shù)。隨著科技的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的提出和應(yīng)用使得果樹(shù)品種鑒定分類更加準(zhǔn)確，其通過(guò)DNA多態(tài)性為我國(guó)果樹(shù)品種的鑒定分類起到了重要的推動(dòng)作用。

自從RAPD技術(shù)在果樹(shù)品種鑒定中應(yīng)用之后，其已成功地對(duì)蘋(píng)果、桃杏、草莓、柿子等多種果樹(shù)進(jìn)行了具體的鑒定。例如，蘋(píng)果通過(guò)RAPD技術(shù)對(duì)“Fuji”品種的實(shí)木苗植株與芽變進(jìn)行了區(qū)分，并沒(méi)有檢測(cè)檢測(cè)到兩者存在遺傳變異可能性。而在對(duì)楊梅等屬性的植物進(jìn)行RAPD鑒定時(shí)，將中美區(qū)域不同品種的楊梅實(shí)現(xiàn)了具體區(qū)分，但是其在對(duì)楊梅品種進(jìn)行分類時(shí)發(fā)現(xiàn)與RAPD結(jié)果不同，這需要進(jìn)一步的完善楊梅分類方法[1]。在對(duì)地中海區(qū)域中的油橄欖進(jìn)行分析之后發(fā)現(xiàn)17種油橄欖種質(zhì)資源具有明顯的多態(tài)性，經(jīng)聚類分析，17個(gè)品種分成大小兩類果群，其與形態(tài)學(xué)的分類是相同的[2]。

2.2 建立遺傳圖譜

建立遺傳圖譜是當(dāng)前遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的一種重要方向，其是對(duì)基因組展開(kāi)系統(tǒng)研究和遺傳育種的重要依據(jù)，對(duì)于果蔬早期育種選擇具有重要的作用。傳統(tǒng)遺傳圖譜的建立是在形態(tài)、生理以及生化標(biāo)記的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，由于其工作復(fù)雜，大部分的作物遺傳圖譜的建立不夠快。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們?cè)诮⒐麡?shù)遺傳圖譜上也更加便捷，當(dāng)前人們已經(jīng)利用分子標(biāo)記遺傳技術(shù)對(duì)蘋(píng)果、櫻桃、葡萄等果樹(shù)建立了遺傳圖譜。

Weeden等[3]利用RAPD和RFLP與同工酶分析建立了蘋(píng)果遺傳圖譜，蘋(píng)果品種圖譜標(biāo)記構(gòu)成共有253個(gè)，屬于24個(gè)連鎖群。King[4]建立了歐洲地區(qū)的蘋(píng)果遺傳圖譜，其標(biāo)記了蘋(píng)果生長(zhǎng)、果實(shí)性狀、抗寒抗病程度等基因性質(zhì)。DIRLE等[5]將桃F2分離群體作為試驗(yàn)材料，按照524個(gè)引物中所具備的38個(gè)多態(tài)引物擴(kuò)增了8個(gè)連鎖群體。Cai[6]對(duì)柑橘雜交群體實(shí)行了RAPD分析，并與同工酶等方法共同建立了9個(gè)連鎖群體，將80%的基因組覆蓋完成。

遺傳圖譜的建立耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)、投資多，彼此合作能夠推動(dòng)深入研究，澳洲與歐洲共同建立的蘋(píng)果基因計(jì)劃，其通過(guò)建立與蘋(píng)果抗白粉、黑星、蚜蟲(chóng)等病癥和果實(shí)品種、矮化等情況相關(guān)的遺傳圖譜。同時(shí)，英法等國(guó)家也建立了核果類基因計(jì)劃，通過(guò)RFLP、RAPD以及形態(tài)等位點(diǎn)建立了多個(gè)遺傳圖譜，標(biāo)記了油桃、抗蚜蟲(chóng)等病癥基因。

2.3 分析遺傳多樣性

遺傳多樣性是生命系統(tǒng)基本特征，其是物種自然進(jìn)化發(fā)展的基礎(chǔ)。而分子標(biāo)記技術(shù)作為種質(zhì)資源遺傳多樣性檢測(cè)的工具，其在果樹(shù)種質(zhì)資源檢測(cè)上的研究分為兩方面：1）篩選核心種質(zhì)，也就是通過(guò)最小群體使最全面的遺傳信息保存下來(lái);2）群體遺傳變異，是從分子方面對(duì)群體遺傳的多樣性展開(kāi)了研究，通過(guò)RAPD技術(shù)分析了寬皮柑橘品種之間在高度遺傳上存在的多樣性，得到對(duì)其品種變化具有決定作用的就是有性雜交以及性狀重組這兩個(gè)因素。

Warburton ML等[7]利用RAPD技術(shù)對(duì)136個(gè)品種的桃子進(jìn)行了遺傳多樣性分析，得到美國(guó)品種遺傳情況單一，亞洲品種遺傳多樣。張開(kāi)春等[8]通過(guò)38個(gè)隨機(jī)引物對(duì)平邑甜茶展開(kāi)了RAPD研究，得到了其中穩(wěn)定的DNA條帶超過(guò)了170條，其中兩條為多態(tài)性譜帶，這就表示無(wú)融合生殖平邑甜茶的遺傳特征高度相同，遺傳分化表現(xiàn)較小。而Vicente等[9]通過(guò)RFLP技術(shù)以扁桃DNA為基礎(chǔ)對(duì)歐美品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，分析得到西班牙的品種遺傳多樣性不明顯。沈向[10]在對(duì)杏品種進(jìn)行分析之后得到品種之間盡管存在地域差異，但是彼此之間的遺傳信息聯(lián)系十分密切，具有遺傳一致性表現(xiàn)。

2.4 標(biāo)記基因

標(biāo)記基因主要是將與目的基因聯(lián)系密切的篩選出來(lái)，其是基因克隆與分子育種的基礎(chǔ)。分子標(biāo)記能夠使樣品DNA分子中的多樣差異被迅速找出來(lái)，進(jìn)而將其與差異區(qū)的標(biāo)記出來(lái)，進(jìn)而確定目的基因定位區(qū)域?，F(xiàn)階段，目的基因標(biāo)記方法分為連鎖圖法、近等位基因系法和集群分離分析方法3種。但是，由于大部分的果樹(shù)在遺傳連鎖圖及其飽和度上缺乏，因此連鎖圖法的價(jià)值不足。近等位基因系方法需要7代以上才能夠使用，其使用具有一定的困難性。而集群分離分析方法則是將群體中的個(gè)體按照目的性狀不同而分成了兩組，各組個(gè)體DNA等量混合，建立了混合池，之后尋找基因組片段差異，標(biāo)記連鎖型的基因，這是當(dāng)前果樹(shù)基因標(biāo)記的重要方法。

利用BSA方法對(duì)油桃和桃的雜交出的后代篩選出和果肉硬度等相關(guān)的RAPD標(biāo)記。利用BSA以及RAPD技術(shù)篩選標(biāo)記，同時(shí)將其標(biāo)記在基因兩側(cè)，遺傳距離約為2 cm。而在對(duì)有毛、無(wú)毛以及白肉、黃肉等屬性的桃進(jìn)行RAPD技術(shù)分析標(biāo)記的時(shí)候，其連鎖距離分別為5 cm和9.5 cm。在分析海棠中找到了與蘋(píng)果中存在的抗黑星病的基因相關(guān)的標(biāo)記，其中兩個(gè)標(biāo)記基因連接的十分緊密，在對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)試的時(shí)候，合成了特異序列引物，對(duì)其品種進(jìn)行了抗性優(yōu)化鑒定。研究結(jié)果表示，一般的無(wú)核果木無(wú)核性狀是由多基因所控制的，這些其有主效與微效兩種分別。將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)變成為了SCAR標(biāo)記，在擴(kuò)增SCAR引物擴(kuò)增之后獲得的無(wú)核基因表達(dá)與攜帶者。

2.5 分析系譜

果木中的天然雜種較多，一些品種是由實(shí)生選育得到的，還有一些是由混合花粉雜交選育得到的。在無(wú)法判斷這類果木親本的時(shí)候，分子標(biāo)記就能夠解決這種問(wèn)題。蘋(píng)果品種津輕是在日本金冠基礎(chǔ)上得到的優(yōu)良果木，其父本不清，可能為紅玉，在通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)分析之后得到其與紅玉存在基因重疊現(xiàn)象，進(jìn)而確認(rèn)父本是紅玉、陸奧等三倍體品種，但是親本是二倍的，因此其體配子相對(duì)不清，之后在對(duì)其進(jìn)行RAPD譜帶擴(kuò)增分析的時(shí)候，得到二倍體配置母品種就是金冠，這與同工酶分析方法得到的結(jié)果是一樣的。溫州蜜柑栽培技術(shù)最早是在日本，但是栽培技術(shù)的起源是在中國(guó)，這是由RAPD技術(shù)得到的結(jié)果，而在對(duì)溫州蜜柑進(jìn)行分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)其RAPD帶型和我國(guó)浙江的寬皮柑橘相似，但是與日本的立花橘存在較大的差異，這就表明溫州蜜柑和我國(guó)浙江寬皮柑橘關(guān)系更加接近。

3 結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)在果樹(shù)種質(zhì)資源中的應(yīng)用為人們從自然環(huán)境中獲取更多的資源提供了便利，同時(shí)也使得人們對(duì)自然資源的利用更加科學(xué)合理，其通過(guò)鑒定品種、建立遺傳圖譜等工作為果樹(shù)育種提供了便利，促使果樹(shù)育種速度提升，提高了培育效率，解決了果蔬育種周期問(wèn)題，為果樹(shù)遺傳改良方面也作出了一定的貢獻(xiàn)。果木作為木生植物，其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，自交不親和，品種差異性較大，這就導(dǎo)致果樹(shù)遺傳群體及其作圖群體相對(duì)困難，進(jìn)而對(duì)分子標(biāo)記在果樹(shù)遺傳應(yīng)用上受到影響，發(fā)展不夠完善?？傮w而言，標(biāo)記多態(tài)性低是由于其提供的DNA水平信息無(wú)法滿足資源研究要求，遺傳圖譜飽和度不高，標(biāo)記距離大，分子標(biāo)記研究和育種實(shí)踐關(guān)系不親等。對(duì)此，我國(guó)需要加強(qiáng)國(guó)際之間的交流合作，對(duì)果樹(shù)生產(chǎn)中的問(wèn)題結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行分子標(biāo)記重點(diǎn)研究，篩選更多的多態(tài)性探針等，進(jìn)行自動(dòng)化的標(biāo)記，進(jìn)而使果樹(shù)的遺傳改良進(jìn)程加快，為促進(jìn)我國(guó)果木遺傳標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：趙中正）