數(shù)字PCR和熒光定量PCR診斷急性期布魯菌病的靈敏度比較初步研究

韓 冰，吳翠萍，趙 芯，劉貴明，蔣榮猛

布魯菌病是由布魯菌感染導(dǎo)致人畜共患疾病，主要以發(fā)熱、大汗、關(guān)節(jié)痛、肝脾大和慢性化為特征，在全球均有流行，我國主要集中于新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、甘肅、寧夏等牧區(qū)，但隨著畜牧業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，病例逐漸向城市擴(kuò)散，北京地區(qū)病例逐年增加。布魯菌病診斷主要依靠分離培養(yǎng)、抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)。布魯菌血培養(yǎng)陽性率低，且存在安全性問題，臨床應(yīng)用受限?？贵w檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用最廣，但是缺乏大樣本臨床研究，導(dǎo)致具有診斷意義的抗體滴度存在爭(zhēng)論，比如，關(guān)于布魯菌病急性期試管凝集試驗(yàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)，我國與WHO推薦的不一致，我國推薦試管凝集試驗(yàn)（standard tube agglutination test, SAT）滴度≥1∶100，WHO推薦SAT滴度≥1∶160。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在國外證實(shí)靈敏度和特異度較高，被美國CDC推薦用于布魯菌病診斷。但是，熒光定量PCR技術(shù)在我國應(yīng)用可能存在兩方面問題，一是我國布魯菌病患者從發(fā)病到診斷時(shí)間較長，部分患者診斷前應(yīng)用抗生素進(jìn)行治療，國內(nèi)常用的頭孢類和喹諾酮類抗生素治療布魯菌病有效，導(dǎo)致菌血癥存在時(shí)間短，布魯菌核酸血清含量低，熒光定量PCR臨床研究結(jié)果可能和國外研究存在差異。二是熒光定量PCR受到PCR抑制物、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)曲線偏倚的影響，導(dǎo)致室間質(zhì)量評(píng)價(jià)依從性差，不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果可比性差。數(shù)字PCR技術(shù)為絕對(duì)定量技術(shù)，檢測(cè)靈敏度優(yōu)于熒光定量PCR技術(shù)，在各實(shí)驗(yàn)室之間具有高度可重復(fù)性，在國外已被作為HIV和HBV病毒載量臨床檢測(cè)技術(shù)。本研究擬建立用于布魯菌檢測(cè)的數(shù)字PCR技術(shù)，先期選取20例符合急性期布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者血清樣本進(jìn)行小樣本研究，初步比較數(shù)字PCR與熒光定量PCR檢測(cè)布魯菌的靈敏度差異，并分析原因，為后續(xù)開展大樣本實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)提供參考，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血清標(biāo)本來源于2018年4—8月就診于濰坊益都中心醫(yī)院的急性期布魯菌病患者，陽性對(duì)照菌為中國CDC布魯菌病實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng)。急性期定義為符合布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程6個(gè)月以內(nèi)[1]。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 Qubit dsDNA assay kit （Q32853，Invitrogen）、ddPCR Supermix for Probes （no dUTP）（186-3024，Bio-Rad）、ddPCR Droplet Reader Oil （186-3004，Bio-Rad）、Droplet Generation Oil for Probes （1863005，Bio-Rad）、Taqman Fast Advanced Master Mix（4444963，Applied Biosystems）、5 min TA/Blunt-Zero Cloning kit （C601-01，Vazyme）、DH5α Competent cell（CW0808S，康為世紀(jì)）、QIAprep mini kit （27104，QIAGEN）

1.2.2 主要儀器 桌面小型離心機(jī)（CUBEE，臺(tái)灣CUBEE）、渦旋振蕩器（Vortex 5，其林貝爾）、Qubit 3.0 熒光定量儀（Qubit3.0，Invitrogen）、微量移液槍（Eppendorf）、QX200?Droplet Digital?PCR System （QX200，Bio-Rad）、Bio-Rad T100 PCR儀（T100，Bio-Rad）、PX1封膜儀（PX1，Biorad）、-20℃冰箱 （BD-226W，青島海爾）、Bio-Rad 熒光定量PCR儀（CFX 96，Bio-Rad）。

1.3 探針序列

1.3.1 數(shù)字微滴PCR實(shí)驗(yàn)所用探針序列由江蘇泓訊生物科技股份有限公司合成。IS711正反向引物及探針序列：IS711-F ATGTTTTCTCGCATCGCAGC；IS711-R AGGAACGCCATCAGATTGAA；IS711-Probe FAM-CGACGATAGCGTTTCAANFQ-MGB。RB51正反向引物及探針序列：RB51-F CCGGGCGTACCAACTCG；RB51-R CGAAGCCTTACAGATGAGCAA；RB51-Probe FAMAAGATATGCTTCGATCCGGT-NFQ-MGB。

1.3.2 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所用探針序列由江蘇泓訊生物科技股份有限公司合成。IS711正反向引物及探針序列：IS711-qF GACTGGAGGCTGTACAAGGA；IS711-qR ATGGACGAAACCCACGAATG；IS711-qProbe FAM-TCGCATCGCAGCGCAATGCGBHQ； RB51正反向引物及探針序列：RB51-qF TGGCGTCGACAAATAATCGG；RB51-qR TGGAACCGGATCGAAGCATA；RB51-qProbe FAM-CTGCGGCCGGGCGTACCAAC-BHQ。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 取1.0 ml 菌懸液于1.5 ml 的離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄去上清。按照DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取操作，將提取的DNA 放置-20 ℃保存?zhèn)溆茫NA溶液用Gene Quant 定量儀測(cè)濃度和純度。

1.4.2 數(shù)字微滴PCR檢測(cè)

1.4.2.1 用陽性對(duì)照M3（中國CDC提供羊布魯菌DNA）做濃度梯度檢測(cè)所設(shè)計(jì)探針的有效性及靈敏度 對(duì)陽性對(duì)照樣本M3進(jìn)行梯度稀釋，按照10倍梯度稀釋法得到以下梯度樣本：1 ng/μl，1×10-1ng/μl，1×10-2ng/μl，1×10-3ng/μl，1×10-4ng/μl，1×10-5ng/μl。配置體系，體系中模板投入量為1μl，10 μM 正向引物和反向引物各 1.8 μl使整個(gè)體系中引物終濃度為900 nM，1 μM探針加入5 μl使終濃度為250 nM，加入ddPCR Supermix 10 μl， 補(bǔ)水至體系總反應(yīng)體系 20 μl。

體系配好以后指彈法混勻，桌面離心機(jī)快速離心使液體收集到管底。將20 μl反應(yīng)體系和70 μl微滴生成油小心分別轉(zhuǎn)入加樣孔和加油孔中，蓋上膠墊，轉(zhuǎn)入微滴生成儀。反應(yīng)結(jié)束后，將微滴生成的產(chǎn)物約40 μl體系轉(zhuǎn)入96孔板中。將96孔板蓋上專用的可穿透膜，用預(yù)熱到180 ℃的PX1封膜儀對(duì)其進(jìn)行封膜（180 ℃，10 s）。封膜后將96孔板放入T100中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 60 s， 40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min。

將反應(yīng)結(jié)束后的96孔板放入QX200中的96孔板固定裝置組裝好。打開電腦中的QuantaSoft軟件，在讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果前先做一遍Flush Syster。之后在軟件中對(duì)96孔板樣本信息進(jìn)行程序設(shè)置，實(shí)驗(yàn)類型選擇絕對(duì)定量。

檢查程序設(shè)置信息無誤后即可運(yùn)行程序，結(jié)束后檢查實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。觀察微滴生成數(shù)是否符合泊松分布，人工核實(shí)調(diào)整出現(xiàn)閾值判讀失誤的數(shù)據(jù)，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行后續(xù)的解讀分析。

1.4.2.2 用M3測(cè)試有效的探針檢測(cè)20例臨床患者DNA標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)中使用布魯菌DNA（M3：1×10-4ng/μl）作為陽性對(duì)照，用2例健康人血清提取DNA作為陰性對(duì)照。測(cè)試樣本為20例急性期布魯菌病患者的血清DNA。整個(gè)體系中引物終濃度為900 nM，探針終濃度為250 nM。陽性對(duì)照模板加入量1×10-4ng，待測(cè)樣本和陰性對(duì)照由于都是人血清DNA，投入20 ng作為模板配制20 μl PCR反應(yīng)體系。

體系配好以后指彈法混勻，桌面離心機(jī)快速離心使液體收集到管底。如前文所述將樣本轉(zhuǎn)移至微滴生成卡槽中在微滴生成儀上進(jìn)行微滴生成后將反應(yīng)產(chǎn)物40 μl轉(zhuǎn)移至96孔板中封膜后進(jìn)行PCR反應(yīng)。將反應(yīng)結(jié)束后的96孔板放入QX200中的96孔板固定裝置中組裝好。打開電腦上的QuantaSoft軟件，在讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果前先做一遍Flush Syster。之后在軟件中對(duì)96孔板樣本信息進(jìn)行程序設(shè)置，實(shí)驗(yàn)類型選擇絕對(duì)定量。

檢查程序設(shè)置信息無誤后即可運(yùn)行程序，結(jié)束后檢查實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，人工核實(shí)調(diào)整出現(xiàn)閾值判讀失誤的數(shù)據(jù)，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行后續(xù)的解讀分析。

1.4.3 熒光定量PCR檢測(cè)

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 以羊標(biāo)準(zhǔn)菌株M3 DNA為模板，分別用前文所述引物（IS711-qF/IS711-qR，RB51-qF/RB51-qR）擴(kuò)增目的片段為120 bp和85 bp，使用QIAquick gel extraction kit （QIAGEN，28704）對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收。使用克隆試劑盒（C601-01，vazyme）將目的條帶克隆至載體（pCE2 TA/Blunt-zero 質(zhì)粒）后熱擊法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行Sanger法測(cè)序確認(rèn)插入序列正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，使用QIAprep mini kit（27104，QIAGEN）進(jìn)行質(zhì)粒提取并用Qubit檢測(cè)質(zhì)粒濃度。將所制備的質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)，其中每微開樣品中檢測(cè)基因拷貝數(shù)按以下公式估算：樣品拷貝數(shù)=濃度（ng/μl）×阿伏伽德羅常數(shù)×10-9/（660×重組質(zhì)粒堿基數(shù)），阿伏伽德羅常數(shù)=6.02×1023mol-1。將質(zhì)粒按基因拷貝數(shù) 10 倍梯度稀釋為 2×101～ 2×106copies/μl。

1.4.3.2 熒光定量PCR檢測(cè)20例臨床患者DNA標(biāo)本 用Taqman qPCR試劑配制20 μl體系，體系中使用引物和探針的終濃度均為200 nM，標(biāo)準(zhǔn)品投入量按質(zhì)?？截悢?shù)梯度各加入1 μl。M3作為陽性對(duì)照，2例健康人血清DNA作為陰性對(duì)照，20例臨床患者血清DNA樣本作為研究對(duì)象，各投入2 μl作為模板。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 2min，95 ℃2 min，95 ℃ 30 s /60 ℃30 s 40個(gè)循環(huán)。運(yùn)行結(jié)束后分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果 具體見表1和表2。3、6和11號(hào)標(biāo)本為血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，數(shù)字PCR檢測(cè)為陽性結(jié)果，IS711引物檢測(cè)結(jié)果3者分別為23.15、15.57、10.17 copies/μl，RB51 引 物 檢 測(cè)結(jié)果分別為 22.80、12.17 和 10.03 copies/μl。其余17個(gè)血培養(yǎng)陰性但臨床診斷急性期布魯菌病患者血清DNA檢測(cè)為陽性，檢測(cè)拷貝數(shù)較低，IS771引物檢測(cè)拷貝數(shù)集中于0.10～38.57 copies/μl，RB51引物檢測(cè)拷貝數(shù)集中于0.08～40.97 copies/μl。

表1 數(shù)字PCR IS711檢測(cè)結(jié)果Table 1 Digital PCR IS711 test results

表2 數(shù)字PCR RB51檢測(cè)結(jié)果Table 2 Digital PCR RB51 test results

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，M3陽性樣本3個(gè)重復(fù)平均CT值為14.28，而20例急性期布魯菌病患者血清DNA和2例健康人全血DNA CT值均≥36，與無模板對(duì)照（CT=37）持平，基本不具有參考討論意義，判定為無陽性檢出。

2.3 患者臨床信息 共入組20例患者，其中男16例，女4例，血培養(yǎng)陽性3例，血培養(yǎng)陰性但符合急性期布魯菌病血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)患者17例。20例患者發(fā)病到診斷時(shí)間為4～120 d，平均為36.9 d?；颊呔醒?、牛接觸史，有9例伴有脊柱炎或骶髂關(guān)節(jié)炎或椎旁膿腫。入組前有13例抗生素治療史（8～26 d），19例患者有不同程度的發(fā)熱。

3 討 論

目前，我國用于布魯菌病診斷主要有3種方法：一是血清學(xué)檢測(cè)方法，有虎紅平板凝集試驗(yàn)（rose-bengal plate agglutination test, RBPT）、SAT、ELISA、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和Coombs試驗(yàn)，但診斷靈敏度和特異度存在爭(zhēng)議[2-5]。二是細(xì)菌分離培養(yǎng)，是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在培養(yǎng)時(shí)間長，陽性率低，且存在生物安全性風(fēng)險(xiǎn)[6]。三是分子生物學(xué)診斷技術(shù)，PCR具有高效、省時(shí)、安全等特點(diǎn)，已被用于布魯菌檢測(cè)[7]。

目前，國內(nèi)和國外對(duì)血清學(xué)診斷技術(shù)診斷效能存在爭(zhēng)議。Peeridogaheh等[8]領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對(duì)于急性期布魯菌病診斷的參考價(jià)值：RBPT試驗(yàn)靈敏度為48.1%，ELISA 法檢測(cè)IgG、IgM靈敏度分別為65.6%和49.6%，IgG+IgM靈敏度為34.35%，Coombs試驗(yàn)靈敏度為72.5%。RBPT試驗(yàn)特異度為96.1%，其余各項(xiàng)試驗(yàn)技術(shù)特異度接近100%。其他兩項(xiàng)研究也證實(shí)參考目前布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，存在誤診、漏診情況[9-10]。我國主要采用RBPT和SAT技術(shù)進(jìn)行布魯菌病診斷。文獻(xiàn)報(bào)道RBPT和SAT在急性期布魯菌病中診斷與臨床符合率較高，與國外文獻(xiàn)報(bào)道差異較大[11-12]。分析原因可能為：①我國指南現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)推薦RBPT作為初篩試驗(yàn)，SAT作為確證試驗(yàn)，WHO則推薦RBPT、SAT作為初篩試驗(yàn)，Coombs和ELISA作為確證試驗(yàn)。RBPT和SAT同為抗體凝集試驗(yàn)，同時(shí)作為初篩和確證試驗(yàn)，診斷效能上存在一定交叉。②我國指南規(guī)定SAT診斷滴度≥1∶100，WHO指南則推薦SAT診斷滴度≥1∶160，2者差異明顯，直接導(dǎo)致SAT診斷的靈敏度差異。

熒光定量PCR能夠快速檢測(cè)布魯菌，能在種水平上鑒定牛、羊、豬和犬種,且不須進(jìn)行電泳分析，可避免污染，已被用于布魯菌診斷，IS711和RB51為最優(yōu)效的靶基因序列[13]。但是，熒光定量PCR為相對(duì)定量技術(shù)，其精確性和穩(wěn)定性，受到PCR抑制物、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)曲線偏斜的影響，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室之間的可比性差，作為臨床常規(guī)檢測(cè)技術(shù)存在不足[14]。而且，熒光定量PCR在我國用于布魯菌病臨床檢測(cè)技術(shù)可能存在問題，我國布魯菌病患者診斷周期長，患者多自行服用抗生素治療，常用的頭孢類和喹諾酮類抗生素治療布魯菌病有效，導(dǎo)致布魯菌血清含量低，存在時(shí)間短。針對(duì)我國國情而言，需要更為敏感和穩(wěn)定的PCR檢測(cè)技術(shù)。

數(shù)字PCR對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行定量分析，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接對(duì)核酸靶標(biāo)進(jìn)行絕對(duì)定量。具有比熒光定量PCR更高的重現(xiàn)性和更小的變異性。在國外已被應(yīng)用于HIV和HBV病毒載量測(cè)定[15]。同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)下限為0.001%，靈敏度較熒光定量PCR高1000倍，有作為布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的潛力。

本研究結(jié)果顯示，符合急性期布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)的20例血清標(biāo)本，數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性，熒光定量PCR檢測(cè)均為陰性，出現(xiàn)極端的結(jié)果。為避免實(shí)驗(yàn)技術(shù)造成誤差（常見的如引物問題），本試驗(yàn)分別選取IS711和RB51為靶基因序列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，2者均為數(shù)字PCR檢測(cè)全陽性，熒光定量PCR檢測(cè)全陰性。同時(shí)，數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，分別以IS711和RB51為靶基因序列進(jìn)行檢測(cè)，血清布魯菌含量較為一致。上述結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)操作過程不存在問題。

本研究結(jié)果顯示，數(shù)字PCR檢測(cè)均為陽性，拷貝數(shù)集中在0.08～40.97 copies/μl，總體標(biāo)本拷貝數(shù)水平低，而熒光定量PCR檢測(cè)均為陰性。分析原因可能為：①熒光定量PCR通過在反應(yīng)體系中加入熒光試劑或者熒光標(biāo)記的探針來實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，借助熒光曲線的CT值來定量起始靶基因的濃度。 在低拷貝靶分子、模板背景復(fù)雜等情況下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。②數(shù)字PCR可以將一個(gè)完整的PCR體系通過微滴生成反應(yīng)分散為成千上萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)中都包含1個(gè)或者0個(gè)模板。這些反應(yīng)互不干擾，反應(yīng)結(jié)束后，通過檢測(cè)獨(dú)立微滴的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定陽性拷貝數(shù)。這種檢測(cè)方式不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以排除樣本背景干擾。③實(shí)驗(yàn)中使用的陽性對(duì)照為純培養(yǎng)的布魯菌提取DNA，樣本單一，所以在數(shù)字PCR和熒光定量PCR中都可以檢出。但臨床患者血清提取DNA為患者核酸和低拷貝的布魯菌核酸混合物，在熒光定量PCR中由于反應(yīng)在同一個(gè)體系中進(jìn)行，大量的人基因組會(huì)干擾引物和探針的特異度反應(yīng)，而數(shù)字PCR不存在這樣的問題。

本研究根據(jù)布魯菌保守基因設(shè)計(jì)引物，合成探針，建立了用于布魯菌的數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)，初步證實(shí)數(shù)字PCR技術(shù)可以作為急性期布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的有效補(bǔ)充。但本研究具有局限性，主要集中在以下兩方面，一是急性期布魯菌病患者標(biāo)本少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度；二是2種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)比較需要在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)2者之間的優(yōu)劣，避免實(shí)驗(yàn)誤差帶來的影響。后期研究中將擴(kuò)大樣本量，納入陰性對(duì)照病例，設(shè)立完整診斷試驗(yàn)方案，進(jìn)而研究2種PCR技術(shù)的靈敏度和特異度。