單克隆抗體生產(chǎn)中CHO細胞培養(yǎng)工藝研究進展

李未思

（四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室，四川成都 610000）

CHO細胞（中華倉鼠卵巢細胞，Chinese Hamster Ovary Cells）是廣泛應(yīng)用的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，目前已上市、進入臨床和臨床前研究階段的大部分治療性單克隆抗體采用該表達系統(tǒng)進行生產(chǎn)。用于生產(chǎn)過程的細胞培養(yǎng)工藝應(yīng)能持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)出質(zhì)量一致的合格產(chǎn)品，同時具有較好的生產(chǎn)效率和效益。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，收獲液經(jīng)純化工序制得原液，原液需根據(jù)相關(guān)法規(guī)要求，以及基于產(chǎn)品安全性和有效性的風(fēng)險評估來確定其關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributs，CQAs）。其中，與細胞培養(yǎng)工藝密切相關(guān)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢測項目有抗體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、糖型分布、聚體情況、電荷變異情況、宿主蛋白/DNA含量等。收獲液中上述項目相關(guān)雜質(zhì)的含量多寡直接影響純化工序的難度和收率，其中不同糖型的抗體在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中很難有效分離，因此，雜質(zhì)的含量必須從細胞培養(yǎng)工序中加以控制。在保障抗體質(zhì)量的前提下，應(yīng)同時提高抗體表達量、抗體生成速率、細胞活性密度至合適程度，優(yōu)化操作參數(shù)和流程，以提高生產(chǎn)過程的效率、穩(wěn)定性和安全性。本文從上述角度出發(fā)，對CHO細胞培養(yǎng)工藝中的主要影響因素和需要注意的問題進行探討。

1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是CHO細胞生長、產(chǎn)物表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，培養(yǎng)基的選擇應(yīng)充分考慮細胞株種系特點和產(chǎn)品要求。根據(jù)加入時機及目的不同，培養(yǎng)基可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要用于細胞早期增殖階段，補料培養(yǎng)基主要用于早期增殖和表達階段，應(yīng)根據(jù)不同階段細胞的營養(yǎng)需求和代謝來選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。同時，化學(xué)成分確定、無動物來源、無蛋白已成為當(dāng)今培養(yǎng)基的發(fā)展趨勢，可帶來安全性、穩(wěn)定性以及法規(guī)方面的優(yōu)勢和便利。

目前，已有多種商品CHO細胞培養(yǎng)基，可滿足不同細胞系、生產(chǎn)階段的需求，同時，定制培養(yǎng)基也已投入生產(chǎn)應(yīng)用。與非定制的商品培養(yǎng)基相比，定制化培養(yǎng)基可針對具體細胞株進行精準優(yōu)化，且生產(chǎn)企業(yè)掌握配方，可靈活選擇各有資質(zhì)的廠家進行定制，達到提高產(chǎn)品質(zhì)量與產(chǎn)量，降低培養(yǎng)基成本，提高供應(yīng)源穩(wěn)定性的目的。

有多種途徑進行培養(yǎng)基的優(yōu)化。（1）采用混料設(shè)計，直接采用商品培養(yǎng)基進行混料實驗，可在較短時間內(nèi)篩選出較好的組合；（2）向培養(yǎng)基內(nèi)添加氨基酸、生物因子、維生素、微量元素等物質(zhì)，從中選取對所考察質(zhì)量屬性有較大影響的物質(zhì)，并進行下一步優(yōu)化；(3)對培養(yǎng)基成分及細胞代謝進行分析，從營養(yǎng)物質(zhì)缺失和代謝廢物累積兩方面明確限制因子，針對性補加或設(shè)法清除相關(guān)物質(zhì)，并可通過細胞代謝特點確定補料策略，以及定制培養(yǎng)基各成分比例[1-2]。同時，應(yīng)考察培養(yǎng)基成分對抗體質(zhì)量屬性，如糖型等的影響[3]。在小規(guī)模高通量系統(tǒng)中完成初步優(yōu)化后，應(yīng)在中試生物反應(yīng)器中進行驗證，以確認新配方在生產(chǎn)中的適用性。

2 培養(yǎng)參數(shù)

CHO細胞培養(yǎng)的主要培養(yǎng)參數(shù)有溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧等。現(xiàn)有CHO細胞培養(yǎng)工藝廣泛采用變溫培養(yǎng)，即細胞生長增殖及產(chǎn)物表達階段采在不同溫度下培養(yǎng)。一般在指數(shù)生長后期降低培養(yǎng)溫度，可調(diào)節(jié)細胞周期，延緩細胞死亡，提高抗體生成速率，延長培養(yǎng)時間，達到提高總表達量的效果。與變溫培養(yǎng)類似，也可對pH進行調(diào)節(jié)，使細胞代謝方式從增殖階段向產(chǎn)物表達階段轉(zhuǎn)變。需要注意的是，溫度和pH的變化可影響抗體的糖型、聚體、電荷變異等方面，需進行相應(yīng)的考察[4-6]。

大多數(shù)現(xiàn)有CHO細胞單抗生產(chǎn)平臺使用攪拌式生物反應(yīng)器進行產(chǎn)物表達。在培養(yǎng)過程中，攪拌式生物反應(yīng)器通過攪拌槳攪拌和氣體分布器通氣進行傳質(zhì)，來滿足細胞對氧氣的需求，同時去除多余的二氧化碳，維持反應(yīng)器內(nèi)各處溫度、溶氧、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等培養(yǎng)條件的均一性。然而，過大的攪拌和通氣速率會對細胞造成剪切傷害，降低密度和活性，影響產(chǎn)物質(zhì)量，尤其是在大型生物反應(yīng)器中，維持足夠的氧氣傳遞系數(shù)和較短的混合時間的同時，應(yīng)充分考慮剪切傷害。

反應(yīng)器培養(yǎng)中CHO細胞所受到的剪切傷害主要來自攪拌槳的機械擠壓，培養(yǎng)液中的渦旋和氣泡破裂產(chǎn)生的表面張力。為避免機械擠壓和渦旋的剪切傷害，槳尖速度不應(yīng)超過CHO細胞的耐受值；渦旋的最小尺度（即Kolmogorov尺度）應(yīng)大于細胞的最大直徑，以避免細胞在多個渦旋之間受到切向剪切。槳尖速度與攪拌轉(zhuǎn)速成正相關(guān)，Kolmogorov尺度與攪拌轉(zhuǎn)速成負相關(guān)，因此需將轉(zhuǎn)速控制在一定范圍內(nèi)。氣泡破裂產(chǎn)生的表面張力可殺死附著在其表面的細胞，加入表面活性劑可減少氣泡表面的細胞附著；適當(dāng)?shù)耐饬亢蜌馀莩叽缫材芙档蜌馀萜屏训挠绊懀苤朴跉怏w分布器的規(guī)格尺寸和反應(yīng)器的混合性能，因此在配置設(shè)備時應(yīng)及早結(jié)合工藝進行考察。

3 工藝放大

由于時間及成本的原因，反應(yīng)器培養(yǎng)工藝實驗一般先在小型反應(yīng)器中進行，再逐步放大至中試及生產(chǎn)規(guī)模。同時，可以使用小型反應(yīng)器模擬現(xiàn)有大規(guī)模生產(chǎn)中的部分工藝參數(shù)，即為縮小模型[7]。工藝放大過程中，應(yīng)確?？贵w關(guān)鍵質(zhì)量屬性及表達量、細胞密度、活性等主要指標的穩(wěn)定性。在不同的培養(yǎng)規(guī)模下，溫度、pH、流加策略一般不進行改變，但攪拌速度和通氣速率等因素受體積影響，需要遵循一定的變化準則。工藝放大/縮小通常采用相同單位體積功率P/V、傳質(zhì)系數(shù)kLa等作為準則。由于P/V ∝ P0N3D5，kLa∝ (P/V)αUgβ（其中 P0為攪拌槳功率數(shù)，N為攪拌轉(zhuǎn)速，D為攪拌槳直徑，Ug為通氣速率，α、β為常數(shù)，由實驗得出）[8]，當(dāng)P/V或kLa取值固定時，可得出培養(yǎng)規(guī)模放大/縮小后的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率。但正如前面提到的，攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率的取值必須考慮到細胞的耐受范圍和反應(yīng)器的硬件條件，同時，大型生物反應(yīng)器培養(yǎng)中存在的傳質(zhì)不均一問題，可將兩個小型反應(yīng)器通過管路及蠕動泵串聯(lián)，或通過在小型反應(yīng)器上加裝平推流反應(yīng)器（Plug flow reactor，PFR）等裝置[9]，模擬大型生物反應(yīng)器不同區(qū)域之間物質(zhì)的混合來進行考察。

4 結(jié)語

以CHO細胞為表達系統(tǒng)的大規(guī)模培養(yǎng)工藝在治療性單克隆抗體生產(chǎn)過程中起著關(guān)鍵作用。由于大規(guī)模細胞培養(yǎng)的特殊性和復(fù)雜性，以及國家監(jiān)管機構(gòu)對生物制品質(zhì)量要求日趨嚴格，生產(chǎn)廠家需要利用飛速發(fā)展的新技術(shù)和方法，開發(fā)高質(zhì)量、高表達、高效率、可穩(wěn)定生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)工藝，以期在競爭日益激烈的治療性單克隆抗體市場中脫穎而出。

[1]Robitaille J, Chen J, Jolicoeur M. A Single Dynamic Metabolic Model can Describe mAb Producing CHO Cell Batch and Fed-Batch Cultures on Different Culture Media[J]. PloS one,2015,10(9):e0136815.

[2]Kishishita S, Katayama S, Kodaira K, et al. Optimization of Chemically Defined Feed Media for Monoclonal Antibody Production in Chinese Hamster Ovary Cells[J].Journal of Bioscience and Bioengineeri ng,2015,120(1):78-84.

[3]Fan Y, Jimenez Del Val I, Müller C, et al. Amino Acid and Glucose Metabolism in Fed-Batch CHO Cell Culture Affects Antibody Production and Glycosylation[J].Biotechnology and bioengineeri ng,2015,112(3):521-535.

[4]Kou T C, Fan L, Zhou Y, et al. Increasing the Productivity of TNFR-Fc in GS-CHO Cells at Reduced Culture Temperatures[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2011,16(1):136-143.

[5]Gomez N, Subramanian J, Ouyang J, et al. Culture Temperature Modulates Aggregation of Recombinant Antibody in CHO Cells[J].Biotechnology and bioengineering,2012,109(1):125-136.

[6]Pacis E, Yu M, Autsen J, et al. Effects of Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation-what Affects High Mannose 5 Glycoform[J]. Biotechnology and Bioengineeri ng,2011,108(10):2348-2358.

[7]Sieck J B, Cordes T, Budach W E, et al. Development of a Scale-Down Model of Hydrodynamic Stress to Study the Performance of an Industrial CHO Cell Line under Simulated Production Scale Bioreactor Conditions[J]. Journal of Biotechnology,2013,164(1):41-49.

[8]Moutafchieva D, Popova D, Dimitrova M, et al. Experimental Determination of the Volumetric Mass Transfer Coefficient[J]. Journal of Chemical Technology and Metallurgy,2013,48(4):351-356.

[9]劉金濤,王星懿,范里,等.大型反應(yīng)器內(nèi)pH不均一性對CHO細胞流加培養(yǎng)過程的影響[J].生物技術(shù)通報,2015,31(10):236-241.